ICS6502001

B16..

中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)

GB/T28067—2011

甘蔗黃葉病毒實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)方法

Detectionofsugarcaneyellowleafvirususingthereal-timeRT-PCR

2011-12-30發(fā)布2012-06-01實(shí)施

中華人民共和國國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局發(fā)布

中國國家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會(huì)

GB/T28067—2011

前言

本標(biāo)準(zhǔn)按照給出的規(guī)則起草

GB/T1.1—2009。

本標(biāo)準(zhǔn)由全國植物檢疫標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì)提出并歸口

(SAC/TC271)。

本標(biāo)準(zhǔn)起草單位福建農(nóng)林大學(xué)甘蔗綜合研究所農(nóng)業(yè)部甘蔗及制品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)測(cè)試中心農(nóng)業(yè)

:、、

部甘蔗遺傳改良重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室

。

本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人高三基陳平華陳如凱郭晉隆張華許莉萍王恒波陳由強(qiáng)

:、、、、、、、。

Ⅰ

GB/T28067—2011

甘蔗黃葉病毒實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)方法

1范圍

本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了甘蔗黃葉病毒實(shí)時(shí)熒光檢測(cè)方法所需的儀器與試劑樣品的采集與前處

RT-PCR、

理操作方法以及結(jié)果判定

、。

本標(biāo)準(zhǔn)適用于甘蔗植株種苗及種莖中甘蔗黃葉病毒的快速檢測(cè)診斷

、、。

2術(shù)語和定義

下列術(shù)語和定義適用于本文件

。

21

.

反轉(zhuǎn)錄reversetranscription

以為模板合成的過程也稱逆轉(zhuǎn)錄

RNADNA,。

22

.

實(shí)時(shí)熒光RT-PCRrealtimeRT-PCR

實(shí)時(shí)熒光反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)

-。

23

.

Ct值cycletime

每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定的閾值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)

。

3縮略語

下列縮略語適用于本文件

。

核糖核酸

RNA:

Taq酶Taq聚合酶

:DNA

種脫氧核苷三磷酸混合液

dNTPs:45′-

酶

RNase:RNA

莫洛尼鼠白血病病毒Moloneymurineleukeminvirus反轉(zhuǎn)錄酶

M-MLV:()

羧基熒光素

FAM:6-

羧基四甲基羅丹明

TAMRA:6-

4方法原理

在反轉(zhuǎn)錄酶作用下將反轉(zhuǎn)錄成再以為模板利用Taq酶進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光擴(kuò)

RNAcDNA,cDNAPCR

增反應(yīng)采用Taq探針方法在比對(duì)甘蔗黃葉病毒外殼蛋白基因的基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)一對(duì)僅在甘蔗黃

(Man)。,

葉病毒外殼蛋白基因間保守的特異性引物和一條特異性的熒光雙標(biāo)記探針探針的端標(biāo)記熒

。5’FAM

光素為報(bào)告熒光基團(tuán)端標(biāo)記熒光素為淬滅熒光基團(tuán)結(jié)合部位位于目的擴(kuò)增片段內(nèi)部

,3’TAMRA,。

當(dāng)完整的探針與目的序列配對(duì)時(shí)熒光基團(tuán)發(fā)射的熒光因與端的淬滅劑接近而被淬滅儀器檢測(cè)不

,3’,

到熒光信號(hào)但在進(jìn)行延伸反應(yīng)時(shí)Taq酶發(fā)揮的外切核酸酶功能