逆境脅迫對(duì)植物生理生化指標(biāo)的影響李忠光，2011.5.25模塊四

綜合性實(shí)驗(yàn)?zāi)康恼莆漳婢趁{迫下一些植物生理指標(biāo)的測(cè)定方法；了解逆境脅迫下植物生理生化指標(biāo)的變化以及逆境傷害和適應(yīng)的原因。流程圖根據(jù)生物膜透性根據(jù)呼吸作用染料法紙上熒光法：種皮的透性，十字花科5%紅墨水染色法0.1%靛藍(lán)、曙紅等染色法TTC法:作為H受體BTB法：外界pH的變化I2-KI染色法：松、衫科種子實(shí)驗(yàn)原理I實(shí)驗(yàn)原理I實(shí)驗(yàn)原理ITTCMethodDyeMethod實(shí)驗(yàn)原理II4260nm實(shí)驗(yàn)原理III實(shí)驗(yàn)原理IV實(shí)驗(yàn)原理V實(shí)驗(yàn)原理VIPODPPO實(shí)驗(yàn)原理VII對(duì)硫二硝基苯酸實(shí)驗(yàn)原理VIIICitedfromPlantPhysiology,2003,131:697-706實(shí)驗(yàn)方法I種子發(fā)芽率的測(cè)定：各取50粒吸脹的玉米種子或小麥種子→沿胚的中心線切成兩半（嚴(yán)格區(qū)分兩個(gè)半粒），進(jìn)行下列實(shí)驗(yàn)：

其中50個(gè)半粒進(jìn)行TTC染色（30℃水浴20min）

另50個(gè)半粒進(jìn)行曙紅染色（室溫染色10min）→洗凈后觀察根據(jù)兩種方法的染色情況，分別計(jì)算發(fā)芽率。品種為晴3或魯玉13的玉米種子或小麥種子（購(gòu)于西山種子公司）→用0.1%HgCl2消毒10min后→用蒸餾水漂洗干凈→用蒸餾水于26℃下吸漲12h→播于墊有6層濕潤(rùn)濾紙的帶蓋白磁盤（24cm×16cm）中→于26℃下暗萌發(fā)60h→計(jì)算發(fā)芽率（注意與前面結(jié)果比較）→選取長(zhǎng)勢(shì)一致的玉米幼苗做干旱5天、高溫、鹽漬或低溫下處理（去除較矮或較高的玉米幼苗）。實(shí)驗(yàn)方法I呼吸作用的測(cè)定：材料的準(zhǔn)備：將預(yù)測(cè)量的材料稱重后（0.5g）放入測(cè)量瓶。測(cè)定方法：打開電源預(yù)熱5min→打開氣泵開關(guān)→打開閉路開關(guān)→用堿石灰管分別連接面板上的“OUT”和“IN”，主機(jī)的“OUT1”和“IN1”分別與測(cè)量瓶的“OUT1”和“IN1”相連→立即開始記時(shí)→測(cè)量1min的CO2增加量計(jì)算：每分鐘每克材料的CO2釋放量（mL.g-1.min-1）。實(shí)驗(yàn)方法IIPro的提取：分別取0.1g實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的幼苗→加入3mL3%磺基水楊酸（SSA）和少許石英砂→充分研磨→用2mL3%SSA洗研缽→5000rpm離心10min→量上清液體積。測(cè)定：上清液各2mL→分別加入(2mL冰乙酸和2mL茚三酮試劑)→煮沸15min→冷卻后→5000rpm離心10min（若沒沉淀可略此步驟）→分別測(cè)定A520計(jì)算：Procontent=

(mmol.g-1FW)實(shí)驗(yàn)方法IIIMDA提取：分別取0.1g實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組→加入3mL0.1%TCA和少許石英砂→充分研磨→用2mL0.1%TCA洗研缽→5000rpm離心10min→量上清液體積。測(cè)定：分別取上清液各1mL→加入0.6%TBA（用10%TCA配制）3mL→煮沸15min→冷卻后→5000rpm離心5min（視沉淀有無(wú)）→分別測(cè)定OD450和OD532計(jì)算：實(shí)驗(yàn)方法IVH2O2提取：分別取0.1g實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組→加入3mL

0.3%三氯乙酸（TCA）和少許石英砂→充分研磨→用2mLTCA洗研缽→5000rpm離心10min→量上清液體積。測(cè)定：分別取上清液各4mL→加入0.1%Ti(SO4)2[用20%(v/v)H2SO4配制]0.2mL→搖勻→OD410計(jì)算：H2O2content=

(mmol.g-1FW)實(shí)驗(yàn)方法V實(shí)驗(yàn)方法VI1、抗氧化酶的提取：分別取0.1g實(shí)驗(yàn)材料→加入少許石英砂和3ml提取液（50mmol/LPBS,pH6.0,內(nèi)含0.１mmol/LEDTA,1%PVP）→充分研磨→轉(zhuǎn)入離心管中→用2ml提取液洗研缽→5000rpm離心10min→量上清液體積→用于測(cè)定POD和PPO酶活性或分裝后轉(zhuǎn)至-20或-80℃保存。

2、POD測(cè)定：取POD反應(yīng)混合液（10

mmol/L愈創(chuàng)木酚，5mmol/LH2O2,用PBS溶解）2.95ml，加入酶液50ml（空白調(diào)零用PBS取代），立即記時(shí)，搖勻，讀出反應(yīng)2min時(shí)的A470。3、PPO測(cè)定：取PPO反應(yīng)混合液（20mmol/L鄰苯二酚，用PBS溶解）2.9ml，加入酶液0.1ml（空白調(diào)零用PBS取代），立即記時(shí)，搖勻，讀出反應(yīng)

2min時(shí)的A410。

以每分鐘A值變化0.01所需要的酶液的量為一個(gè)活力單位（U），則：實(shí)驗(yàn)方法VIPODactivities=

(mmol.g-1FWmin-1)PPOactivities=

(U.g-1FW)4、計(jì)算實(shí)驗(yàn)方法VI實(shí)驗(yàn)方法VIIGSH的提取：分別取0.1g實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的胚芽鞘→加入3mL5%三氯乙酸（TCA）和少許石英砂→充分研磨→用2mL5%TCA洗研缽→5000rpm離心10min→量上清液體積。測(cè)定：上清液各1mL(空白用5%三氯乙酸代替)→分別加入2mL0.1MPBS(pH=7.7)→1mL2mMDTNB→25℃5min→測(cè)定A412計(jì)算：GSHcontent=

(mmol.g-1FW)實(shí)驗(yàn)方法VIIIASA的提取：分別取0.1g實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的胚芽鞘→加入3mL5%三氯乙酸（TCA）和少許石英砂→充分研磨→用2mL5%TCA洗研缽→5000rpm離心10min→量上清液體積。測(cè)定：上清液各0.8mL(空白用5%TCA代替)→分別加入0.8mL0.15MNaH2PO4(pH=7.4)和蒸餾水→搖勻→分別加入0.8mL5%TCA、44%磷酸和4%聯(lián)吡啶→搖勻→加入3%FeCl30.8mL→37℃15min→測(cè)定A525計(jì)算：ASAcontent=

(mmol.g-1FW)模塊實(shí)驗(yàn)報(bào)告“以逆境脅迫