純鈦不同的表面處理后與成纖維細(xì)胞的結(jié)合情況分析,口腔科學(xué)論文種植體修復(fù)已經(jīng)成為牙列缺失、缺損的常用修復(fù)方式方法。植入患者口內(nèi)的種植體想要獲得良好的穩(wěn)定性，長期行使功能，不僅需要其與骨組織嚴(yán)密整合，還要與軟組織構(gòu)成牢固的生物學(xué)封閉屏障。Puckettetal[1]通過實驗證明采用不同方式方法處理種植體外表會影響成纖維細(xì)胞的黏附、增殖。然而，當(dāng)前國內(nèi)的研究基本集中在鈦種植體與骨組織的結(jié)合，與軟組織結(jié)合的研究較少。該實驗通過對純鈦進(jìn)行不同的外表處理后進(jìn)行成纖維細(xì)胞與材料的共培養(yǎng)，研究細(xì)胞在不同處理外表的生長情況，進(jìn)而討論更有利于與軟組織結(jié)合的種植體外表形態(tài)。1材料與方式方法1.1實驗材料和設(shè)備純鈦棒〔TA2,寶雞和信泰金屬有限公司〕；L-929小鼠成纖維細(xì)胞〔南京凱基生物科技發(fā)展有限公司〕；-甘油磷酸二鈉鹽五水〔國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司〕；乙酸鈣〔南京凱基生物科技發(fā)展有限公司〕；優(yōu)質(zhì)胎牛血清〔杭州四季青生物工程材料有限公司〕；DMEM〔美國Gibco公司〕；DMSO〔美國Sigma公司〕；微弧氧化相關(guān)設(shè)備〔西安理工大學(xué)自制〕；S-3400NⅡ掃描電子顯微鏡〔日本日立公司〕；超凈工作臺〔SW-CJ-1FD,蘇州凈化設(shè)備有限公司〕；CO2培養(yǎng)箱〔日本SANYO公司〕；生物倒置顯微鏡〔日本Olympus公司〕；臺式低速離心機(jī)〔中國上海醫(yī)療器械股份有限公司醫(yī)療設(shè)備廠〕；酶標(biāo)儀〔美國BioTek公司〕。1.2方式方法1.2.1純鈦片的制備及分組將純鈦棒線性切割成直徑為10mm,厚為1mm的圓形鈦片試件，在流水下用耐水砂紙逐級打磨至1200#后，打磨膏拋光，依次用丙酮、無水乙醇、去離子水超聲清洗30min后枯燥備用。根據(jù)不同處理方式方法將純鈦片隨機(jī)分為光滑組、雙重酸蝕噴砂組〔先在0.5Mpa氣壓下將直徑為200m的Al2O3顆粒對鈦片外表進(jìn)行均勻的垂直噴射，距離鈦片1cm;噴砂后用去離子水超聲清洗后浸入66%HNO3與40%HF的混合液溶液中10min,取出后去離子水清洗〕、氫氟酸酸蝕噴砂組〔噴砂方式方法與雙重酸蝕噴砂組一樣，試件噴砂后去離子水超聲清洗后浸入質(zhì)量百分比為0.5%的HF溶液中10min,取出后去離子水清洗〕、微弧氧化組〔以純鈦為陽極，不銹鋼鍋為陰極，以0.04mol/L-甘油磷酸二鈉鹽五水和0.2mol/L乙酸鈣的去離子水溶液為電解液，采用脈沖直流電源進(jìn)行微弧氧化處理。所有試件在制備完成后經(jīng)過高溫高壓消毒備用。處理參數(shù)為：電壓300V,頻率500Hz,占空比12%,處理時間為3min.處理好后的試件立即用去離子水沖洗、吹干〕。1.2.2試件外表形態(tài)觀察將不同處理外表的鈦片置于掃描電子顯微鏡下觀察外表形態(tài)。1.3成纖維細(xì)胞在不同處理外表生長情況1.3.1成纖維細(xì)胞在不同試件外表的黏附將存有L-929小鼠成纖維細(xì)胞的凍存管從液氮罐中取出，立即放入37℃恒溫水浴箱中，快速晃動凍存管1~2min后，取出凍存管，用吸管吸出細(xì)胞懸液，參加到含培養(yǎng)液的離心管中并以1000r/min離心5min后棄上清液，調(diào)整細(xì)胞密度，接種于培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)。成纖維細(xì)胞復(fù)蘇后按1∶3的比例進(jìn)行傳代，選取快速生長期的第4代細(xì)胞，0.25%胰蛋白酶消化細(xì)胞系后制成1.0105個/ml濃度的單細(xì)胞懸液。從4組中各取5片試件分別置于24孔培養(yǎng)板內(nèi)，接種單細(xì)胞懸液，每孔200參加DMEM培養(yǎng)液〔含10%胎牛血清〕2ml,37℃、95%濕度、5%CO2條件下分別培養(yǎng)1、2、4h停止；PBS輕輕漂洗數(shù)次，然后每孔參加200lMTT〔5mg/ml〕和800l的DMEM培養(yǎng)液置于37℃條件下孵育4h后，棄掉孔內(nèi)上清液；參加1ml的DMSO振蕩10min,取24孔培養(yǎng)板內(nèi)液體按原順序轉(zhuǎn)移至96孔培養(yǎng)板內(nèi)，酶標(biāo)儀在490nm光波長處測其光吸收值。計算各組吸光度均值，進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，以x珋s表示。1.3.2成纖維細(xì)胞在不同試件外表的增殖效果每組分別取5個試件分別置于24孔培養(yǎng)板內(nèi)，取第4代成纖維細(xì)胞，制成2.0105個/ml濃度的單細(xì)胞懸液，接種于試件外表，每孔200l,參加DMEM培養(yǎng)液〔含10%胎牛血清〕2ml,37℃、95%濕度、5%CO2條件下分別培養(yǎng)1、3、5d停止。用MTT法檢測細(xì)胞吸光度值。詳細(xì)方式方法同1.3.1.1.3.3成纖維細(xì)胞在不同試件外表的鋪展從4組中各取3片試件分別置于24孔培養(yǎng)板內(nèi)，取第4代成纖維細(xì)胞，制成4.0105個/ml濃度的單細(xì)胞懸液，接種于試件外表，每孔200參加DMEM培養(yǎng)液〔含10%胎牛血清〕2ml,37℃、95%濕度、5%CO2條件下培養(yǎng)24h后取出。掃描電子顯微鏡觀察各組試件外表細(xì)胞的鋪展形態(tài)。1.4統(tǒng)計學(xué)處理使用SPSS20.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，SNK-q檢驗比擬組間差異。2結(jié)果2.1掃描電子顯微鏡下觀察各組外表形態(tài)光滑組試件外表無明顯凹陷；雙重酸蝕噴砂組試件外表構(gòu)成不規(guī)則的微孔構(gòu)造，試件外表可見Al2O3顆粒，顆粒形態(tài)不規(guī)則；氫氟酸酸蝕噴砂組外表構(gòu)成不規(guī)則淺凹坑，少量Al2O3顆粒嵌于外表之中，凹坑的邊緣較銳利，坑壁不規(guī)則；微弧氧化組經(jīng)微弧氧化處理后，外表構(gòu)成多孔樣構(gòu)造，構(gòu)成的孔隙孔徑較均勻，向內(nèi)凹陷，四周隆起，類似于火山口狀。見圖1.2.2MTT法檢測細(xì)胞的黏附結(jié)果細(xì)胞在培養(yǎng)1、2、4h各時間點，經(jīng)過外表處理的粗糙外表的吸光度大于光滑外表，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義〔P0.05〕。粗糙外表的吸光度氫氟酸酸蝕噴砂組雙重酸蝕噴砂組微弧氧化組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義〔P0.05〕。2.3MTT法檢測細(xì)胞的增殖結(jié)果細(xì)胞在培養(yǎng)1、3、5d各時間點，經(jīng)過外表處理的粗糙外表的吸光度大于光滑外表，微弧氧化組的吸光度最高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義〔P0.05〕。在1、3d時間點吸光度氫氟酸酸蝕噴砂組雙重酸蝕噴砂組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義〔P0.05〕；在5d時，雙重酸蝕噴砂組、氫氟酸酸蝕噴砂組的吸光度類似，差異無統(tǒng)計學(xué)意義。見圖3.2.4各組試件外表成纖維細(xì)胞生長形態(tài)光滑組試件外表成纖維細(xì)胞呈圓形或橢圓形，偶可見細(xì)胞伸出細(xì)小偽足；雙重酸蝕噴砂組試件外表成纖維細(xì)胞呈圓形或橢圓形，胞體飽滿，伸展良好，有較多偽足伸出，試件外表可見細(xì)胞外基質(zhì)；氫氟酸酸蝕噴砂組試件外表細(xì)胞形態(tài)與雙重酸蝕噴砂組相類似；微弧氧化組試件外表可見成纖維細(xì)胞胞體飽滿，在試件外表良好鋪展，細(xì)胞之間伸出大量偽足并互相融合，細(xì)胞伸出的偽足伸入試件外表的孔隙之中，錨定在試件外表，與試件嚴(yán)密附著，試件外表存在大量細(xì)胞外基質(zhì)。見圖4.3討論隨著技術(shù)的不斷改良，當(dāng)前純鈦種植體修復(fù)10年的成功率已到達(dá)98.5%[2].人們將研究的重點主要集中于怎樣提高純鈦種植體與骨組織之間的結(jié)合[3],忽略了純鈦種植體與軟組織結(jié)合的重要性。研究[4]表示清楚種植體與軟組織結(jié)合構(gòu)成良好的生物學(xué)封閉能夠保證種植體獲得長久的穩(wěn)定性。怎樣促進(jìn)種植體與軟組織之間的結(jié)合，進(jìn)一步提高種植修復(fù)的成功率已成為當(dāng)前研究的熱門之一。本實驗通過比擬純鈦外表不同處理方式方法對成纖維細(xì)胞生長的影響，討論更利于軟組織結(jié)合的外表處理方式方法。本實驗中外表處理采用噴砂酸蝕法和微弧氧化法，華而不實噴砂酸蝕外表已經(jīng)成為使用最廣泛的種植體外表。經(jīng)過噴砂酸蝕處理過的種植體外表可有效促進(jìn)成骨細(xì)胞的黏附與增殖[5].經(jīng)過微弧氧化處理不僅能夠獲得均勻的氧化膜，而且構(gòu)成的膜有更好的耐腐蝕性，與試件外表結(jié)合更嚴(yán)密，不易脫落[6].研究[7]表示清楚微弧氧化有良好地生物相容性，能夠與骨組織構(gòu)成良好地結(jié)合。本實驗通過MTT法檢測顯示微弧氧化較噴砂酸蝕更能促進(jìn)成纖維細(xì)胞早期在試件外表黏附、增殖，進(jìn)而利于軟組織與種植體的結(jié)合。掃描電鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)成纖維細(xì)胞在微弧氧化外表擁有更好的鋪展形態(tài)。揣測可能是由于一些不可控因素[8]影響了噴砂酸蝕外表與細(xì)胞的結(jié)合。微弧氧化技術(shù)不僅能夠通過調(diào)整工藝參數(shù)、電解液的成分制備出具備不同特性的涂層，而且微弧氧化涂層本身所具備的多孔樣構(gòu)造能夠為其他生物活性因子提供附著空間，使微弧氧化外表具備新的功能。已有學(xué)者[9]將抗菌劑鹵代呋喃酮化合物嵌于微弧氧化的微孔中來預(yù)防種植體可能出現(xiàn)的相關(guān)感染，促進(jìn)種植體與軟組織的結(jié)合。除此之外微弧氧化技術(shù)所需操作設(shè)備成本較低、操作方式方法簡單、制備效率高，能夠同時制備多個試件，合適商業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)。這使經(jīng)微弧氧化處理的種植體應(yīng)用于臨床成為了可能。當(dāng)然負(fù)荷、冠修復(fù)、感染及全身狀況等因素都會影響種植體與軟組織構(gòu)成良好結(jié)合，只要臨床醫(yī)師綜合考慮各方面因素才能有效提高使種植體的成功率及長期使用率。以下為參考文獻(xiàn)[1]PuckettSD,LeePP,CiomborDM,etal.Nanotexturedtitaniumsurfacesforenhancingskingrowthontranscutaneousosseointegrat-eddevices[J].ActaBiomater,2018,6〔6〕：2352-62.[2]ManganoFG,ShibliJA,SammonsRL,etal.Short〔8-mm〕loc-king-taperimplantssupportingsinglecrownsinposteriorregion:aprospectiveclinicalstudywith1-to10-yearsoffollow-up[J].ClinOralImplantsRes,2020,25〔8〕：933-40.[3]孫敏，唐旭炎，吳占傲，等。鈦酸鈣涂覆的純鈦片對成骨細(xì)胞生長的影響[J].安徽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