FACSAriaⅡ

分選型流式細(xì)胞儀BD公司生物科學(xué)部BD公司簡(jiǎn)介BD是由MaxwellW.Becton和FairleighS.Dickinson于1897年在紐約創(chuàng)立的，總部設(shè)在新澤西州。經(jīng)過100多年的發(fā)展，BD已成為世界上最大的醫(yī)療技術(shù)及醫(yī)療設(shè)備公司之一，它以領(lǐng)先的技術(shù)、卓越的產(chǎn)品質(zhì)量和誠(chéng)實(shí)可信的服務(wù)贏得了全球用戶及合作伙伴的廣泛贊譽(yù)。BD一直是全球最專業(yè)、產(chǎn)品線最全的流式細(xì)胞儀生產(chǎn)商和流式技術(shù)領(lǐng)導(dǎo)者。全球市場(chǎng)占有率達(dá)到80％，中國(guó)市場(chǎng)占有率達(dá)到85%。

BD公司流式細(xì)胞儀FACSCaliburLSRIIFACSCantoIIInfluxFACSAriaIIAccuriC6LSRFortessaFACSVerseFACSJazzBDFACSAriaII－分選型流式細(xì)胞儀

2008年最新產(chǎn)品集多種專利技術(shù)和完美設(shè)計(jì)流式細(xì)胞術(shù)(FlowCytometry,簡(jiǎn)稱FCM)是一種快速、準(zhǔn)確、客觀的同時(shí)檢測(cè)直線流動(dòng)狀態(tài)中單個(gè)顆粒多項(xiàng)物理及生物學(xué)特性，加以分析定量的技術(shù)，并可以對(duì)特定群體加以分選。研究對(duì)象為生物顆粒，如各種細(xì)胞、染色體、微生物及人工合成微球等。流式細(xì)胞儀(FlowCytometer)集激光技術(shù)、電子物理技術(shù)、光電測(cè)量技術(shù)、電子計(jì)算機(jī)技術(shù)、細(xì)胞熒光化學(xué)技術(shù)、單克隆抗體技術(shù)為一體的一種新型高科技儀器。

基本概念液流系統(tǒng)光學(xué)系統(tǒng)電子系統(tǒng)數(shù)據(jù)儲(chǔ)存與分析系統(tǒng)分選系統(tǒng)流式細(xì)胞儀組成FluidicsCartCytometer液流系統(tǒng)AIRPRESSUREBULKINJECTIONSheathTankAIRPRESSUREASPIRATEDWASTE(VACUUM)ASPIRATEDWASTE(DEGAS)SHEATHFILTER0”–9”R1SheathRegulatorR2SampleRegulatorV17V20V5V6液流系統(tǒng)樣品流速的選擇

低流速：一般用于分辨率較高的分析，如DNA分析高流速：一般用于定性分析，如免疫分型。采集速度快，影響分型。光學(xué)系統(tǒng)FluorescenceFSCdetectorSSCandFluorescencedetector(PMT3,PMT4etc.)光信號(hào)11前向角散射光信號(hào)側(cè)向角散射光信號(hào)熒光信號(hào)FluorochromesOverview123電子系統(tǒng)光電轉(zhuǎn)換器：將光信號(hào)轉(zhuǎn)換成電信號(hào)

光電二極管

光電倍增管（PMT）放大器兩種放大方式：

線性放大（lin）

對(duì)數(shù)放大（log）線性放大：按光強(qiáng)度的線性關(guān)系輸出信號(hào)。用于FSC，SSC，細(xì)胞周期檢測(cè)，SP細(xì)胞檢測(cè)及分選等。對(duì)數(shù)放大：按光強(qiáng)度的對(duì)數(shù)關(guān)系輸出信號(hào)。用于大多數(shù)熒光染色實(shí)驗(yàn)。時(shí)間

(μ秒)電壓脈沖面積脈沖高度脈沖寬度0電脈沖信號(hào)類型：

高度信號(hào)H

寬度信號(hào)W

面積信號(hào)A細(xì)胞周期中粘聯(lián)體區(qū)分AreaHeightThreshold閾值用于屏蔽噪音信號(hào)和碎片信號(hào)，只有高于等于閥值道數(shù)的信號(hào)才會(huì)被送入計(jì)算機(jī)進(jìn)行處理。模擬數(shù)字轉(zhuǎn)換器FL2時(shí)間時(shí)間時(shí)間時(shí)間FSCFL1SSC時(shí)間FL3FL1數(shù)據(jù)處理器SSCFSCFL2

時(shí)間FL4數(shù)據(jù)儲(chǔ)存與分析系統(tǒng)數(shù)據(jù)儲(chǔ)存39,27139,271Event1Event2Event3FSCSSCFITCPE06012089101606530650160List-ModeData8967530,621PE-AFITC-A675TimePE-AFITC-AMaybeexportedasFCSfile39,27122,68830,6216,189FITC/PE雙染樣本數(shù)據(jù)顯示直方圖（Histogram）二維點(diǎn)圖（DotPlot）等高線圖（ContourPlot）密度圖（Density）三維圖（3DPlot）等直方圖：顯示單一參數(shù)（橫坐標(biāo)）與通道細(xì)胞個(gè)數(shù)（縱坐標(biāo)）。一條豎線代表一個(gè)細(xì)胞信號(hào)，多豎線累加形成峰圖，一個(gè)峰即一類細(xì)胞。二維點(diǎn)圖：一個(gè)點(diǎn)代表一個(gè)細(xì)胞信號(hào)。等高線圖：可顯示數(shù)據(jù)信號(hào)的疏密程度。密度圖：可顯示信號(hào)分布的疏密程度。三維圖（3DPlot）等AriaII的噴嘴位于檢測(cè)點(diǎn)的下方，因此更換噴嘴后無需重新調(diào)整激光光路1檢測(cè)2充電3偏轉(zhuǎn)4收集分選系統(tǒng)分析結(jié)果精準(zhǔn)：需要高靈敏度和分辨率-石英杯流動(dòng)池分選細(xì)胞純度：需要對(duì)目標(biāo)細(xì)胞的準(zhǔn)確定位-Accudrop和Sweetspot技術(shù)分選速度：保證純度前提下高度分選-分選速度70,000個(gè)細(xì)胞/秒分選后活性：需要整個(gè)系統(tǒng)各環(huán)節(jié)對(duì)細(xì)胞的保護(hù)-石英杯流動(dòng)池，自動(dòng)無菌管路清洗，溫控儀器性能狀態(tài)穩(wěn)定性：質(zhì)控程序的監(jiān)控和調(diào)整-CS&T儀器質(zhì)控程序及儀器狀態(tài)監(jiān)控流式細(xì)胞儀分選要素高靈敏度-弱表達(dá)樣本檢測(cè)DimstainingPEpopulationvisibleDimstaining高靈敏度——稀有樣本檢測(cè)待測(cè)細(xì)胞細(xì)胞群的比例并不總是這么高有時(shí)，很低十萬分之一此時(shí)，靈敏度和分辨率至關(guān)重要傳統(tǒng)透射光路采用長(zhǎng)通/短通濾光片光信號(hào)經(jīng)過一次透射，信號(hào)損失15-20%多色分析時(shí)，熒光檢測(cè)靈敏度降低八角形/三角形接收裝置-BD專利采用全反射雙色光鏡光信號(hào)經(jīng)過一次反射，信號(hào)損失僅5%保證多色分析時(shí)的熒光檢測(cè)靈敏度光電倍增管帶通濾光片長(zhǎng)通雙色反光鏡細(xì)胞通過激光束的流速變慢，激光照射時(shí)間更長(zhǎng)，提高了激光激發(fā)效率流動(dòng)池被光膠耦合在熒光接收物鏡上，提高了熒光收集效率，保證多色應(yīng)用中最佳的靈敏度和分辨率固定光路，無需每日調(diào)節(jié)，機(jī)器隨開隨用，減少人為可變性，提高實(shí)驗(yàn)重復(fù)性石英杯流動(dòng)池

開機(jī)光路無需調(diào)整一鍵式操作無需操作者的豐富經(jīng)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可重復(fù)性好實(shí)測(cè)檢測(cè)靈敏度：FITC:10MESFPE:10MESF實(shí)測(cè)分辨率：CV=1.6%

二極管激光器，安裝在分選模塊裝置左側(cè)

可以提供側(cè)液流圖像的照相機(jī)

用于觀察BDAccudropTM微球熒光的發(fā)射光濾光片Accudrop微球是一種熒光微球，被位于偏轉(zhuǎn)板下方的紅激光激發(fā)后，發(fā)射光可以透過側(cè)液流監(jiān)視器前方的濾光片，用于測(cè)量dropdelay。該系統(tǒng)由下列部分構(gòu)成：InterrogationpointDropdelayBreakoffWasteNozzle+Cellsinjected++-LaserDropdelay定義：Dropdelay即液滴延遲時(shí)間，指細(xì)胞通過檢測(cè)區(qū)到液滴分離的間隔時(shí)間意義：

Dropdelay如果能夠被準(zhǔn)確確定，就可以保證包裹細(xì)胞的液滴表面不會(huì)充上相反的電荷，從而實(shí)現(xiàn)最高的分選純度及細(xì)胞得率

耗時(shí)：0.5到1.5小時(shí)輔助材料：熒光微球、熒光顯微鏡、 玻片、計(jì)算器傳統(tǒng)液滴延遲時(shí)間確定BD獨(dú)有專利Accudrop技術(shù)：Accudrop微球是一種熒光微球，被位于偏轉(zhuǎn)板下方的紅激光激發(fā)后，發(fā)射光可以透過側(cè)液流監(jiān)視器前方的濾光片，用于測(cè)量dropdelay。預(yù)先分選Accudrop熒光微球自動(dòng)準(zhǔn)確設(shè)置最佳液滴延遲時(shí)間無需手動(dòng)調(diào)節(jié)，減少人為誤差保證實(shí)驗(yàn)的分選純度和得率SweetSpot自動(dòng)監(jiān)控功能液滴斷點(diǎn)監(jiān)測(cè)窗口自動(dòng)調(diào)節(jié)振幅，維持?jǐn)帱c(diǎn)穩(wěn)定維持最佳液滴延遲狀態(tài)儀器阻塞報(bào)警，保護(hù)分選樣本不受污染，實(shí)現(xiàn)分選時(shí)無人看管分選模式Y(jié)ieldMask：如果目標(biāo)顆粒位于該設(shè)定范圍內(nèi)，則含有目標(biāo)顆粒的液滴和相鄰的液滴都被分選。PurityMask：如果非目標(biāo)顆粒位于該設(shè)定范圍內(nèi)，則與其相鄰的含有目標(biāo)顆粒的液滴將不被分選。PhaseMask：如果目標(biāo)顆粒位于該設(shè)定范圍內(nèi)，則含有目標(biāo)顆粒的液滴將不被分選。AccudropPlatesortingEnrichment2-Waysorting4-Waysorting影響分選細(xì)胞的活性的因素：細(xì)胞本身激光功率液路系統(tǒng)（噴嘴）分選系統(tǒng)的潔凈程度及溫度控制石英杯激發(fā)保證了用小功率激光的效率遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于大功率空氣激發(fā)的效率，光毒性小，很好的保證細(xì)胞活性。穩(wěn)定而零剪切力液流系統(tǒng)設(shè)計(jì)最大程度的保證了細(xì)胞的活性，同時(shí)專利的噴嘴設(shè)計(jì)，進(jìn)一步保證了細(xì)胞活性。既有樣本溫控系統(tǒng)也有收集倉(cāng)溫控AriaⅡ自動(dòng)無菌消毒清洗軟件向?qū)逑醋詣?dòng)執(zhí)行無菌分選結(jié)果保證，文獻(xiàn)支持

全自動(dòng)標(biāo)準(zhǔn)化的無菌清洗流程，密閉式的上樣和分選收集倉(cāng)，執(zhí)行一次可以保證整個(gè)管路系統(tǒng)在以后連續(xù)4天內(nèi)菌量為0的最佳效果。采用一管CS&T微球，方便檢測(cè)微球染料可以被任意激光激發(fā)，涵蓋常用染料熒光波譜自動(dòng)調(diào)整PMT報(bào)告儀器性能參數(shù)：Qr，Br，CV，跟蹤儀器狀態(tài)自動(dòng)調(diào)整激光延遲和面積因子BD公司專利技術(shù)CytometerSetup&TrackingSystemCS&T儀器質(zhì)控程序及儀器狀態(tài)監(jiān)控流式細(xì)胞術(shù)操作流程樣品制備流式染色、檢測(cè)數(shù)據(jù)分析細(xì)胞懸液的制備單細(xì)胞懸液（天然，機(jī)械研磨/消化）5×105～1×106cells/ml，約0.5～1ml，300目篩網(wǎng)過濾陰性對(duì)照：自發(fā)熒光，即不經(jīng)熒光染色細(xì)胞內(nèi)部熒光分子經(jīng)光照發(fā)出的熒光。自發(fā)熒光信號(hào)為噪聲信號(hào)。同型對(duì)照：自發(fā)熒光＋非特異熒光，使用與一抗相同種屬來源、相同亞型、相同劑量的免疫球蛋白，用于消除由于抗體非特異性結(jié)合產(chǎn)生的背景染色實(shí)驗(yàn)樣本：自發(fā)熒光＋特異熒光＋非特異熒光補(bǔ)償對(duì)照：雙色或多色分析中，熒光素發(fā)射光譜重疊時(shí)，使用單種熒光素標(biāo)記的單克隆抗體和其余熒光素對(duì)應(yīng)的同型對(duì)照抗體分別進(jìn)行染色，糾正熒光素發(fā)射光譜重疊，即從一個(gè)被檢測(cè)的熒光信號(hào)中去除任何其他的干擾熒光信號(hào)設(shè)置對(duì)照及染色用同型對(duì)照或陰性對(duì)照管調(diào)節(jié)電壓使陰性群位于“左下角”用單陽(yáng)性管依次調(diào)節(jié)相鄰熒光之間補(bǔ)償，如

FL1-%FL2，

FL2-%FL1染色體分選單克隆細(xì)胞分選腫瘤干細(xì)胞分選轉(zhuǎn)染細(xì)胞分選免疫或免疫相關(guān)細(xì)胞分選……細(xì)胞生理學(xué)研究細(xì)胞膜表面標(biāo)記細(xì)胞內(nèi)標(biāo)記細(xì)胞周期分析凋亡分析……流式細(xì)胞術(shù)的應(yīng)用細(xì)胞生理學(xué)研究細(xì)胞相對(duì)大小和顆粒性分析細(xì)胞生理學(xué)研究細(xì)胞內(nèi)PH值檢測(cè)細(xì)胞生理學(xué)研究Ca2+流動(dòng)性檢測(cè)：Ca2+是非常重要的細(xì)胞內(nèi)離子，在細(xì)胞膜到細(xì)胞漿的信號(hào)傳導(dǎo)中起重要的作用。細(xì)胞受到刺激后，胞內(nèi)Ca2+濃度會(huì)發(fā)生改變。最常用的染料：Indo-1,Fluo-3,Furared細(xì)胞生理學(xué)研究細(xì)胞活性分析：FluoresceinDiacetate進(jìn)入活細(xì)胞后，被胞內(nèi)酯酶講解，生成熒光底物，活細(xì)胞會(huì)發(fā)綠色熒光細(xì)胞膜表面標(biāo)記淋巴細(xì)胞亞群/活化分析血小板分析造血干細(xì)胞檢測(cè)腫瘤細(xì)胞標(biāo)志物檢測(cè)白血病免疫分型細(xì)胞內(nèi)標(biāo)記細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子細(xì)胞內(nèi)標(biāo)記基因編碼蛋白細(xì)胞內(nèi)標(biāo)記磷酸化蛋白：

接收刺激后細(xì)胞的動(dòng)態(tài)反應(yīng)

刺激因子對(duì)特異