凝膠層析(cénɡxī)法分離純化蛋白質(zhì)第一頁，共20頁?！灸康?mùdì)】掌握凝膠層析的基本原理學(xué)習(xí)利用凝膠層析法分離純化蛋白質(zhì)的實(shí)驗(yàn)(shíyàn)技能第二頁，共20頁?！驹?yuánlǐ)】凝膠層析也稱分子篩層析、排阻層析。是利用具有網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠的分子篩作用，根據(jù)被分離物質(zhì)的分子大小(dàxiǎo)不同來進(jìn)行分離的技術(shù)。第三頁，共20頁。凝膠層析是按照蛋白質(zhì)分子量大小進(jìn)行(jìnxíng)分離的技術(shù)，又稱之凝膠過濾、分子篩層析或排阻層析。單個(gè)凝膠珠本身象“篩子”。不同類型凝膠的篩孔的大小不同。凝膠過濾(guòl(fā)ǜ)層析第四頁，共20頁。帶網(wǎng)孔的葡聚糖珠小分子(fēnzǐ)進(jìn)入葡聚糖珠內(nèi)大分子不能進(jìn)入(jìnrù)珠內(nèi)，經(jīng)珠之間縫隙流出凝膠過濾層析(cénɡxī)過程示意圖第五頁，共20頁。凝膠過濾層析(cénɡxī)過程示意圖小分子(fēnzǐ)大分子凝膠基質(zhì)(jīzhì)凝膠珠第六頁，共20頁?？偨Y(jié)：相對(duì)分子質(zhì)量較大的物質(zhì)由于直徑大于凝膠網(wǎng)孔被完全排阻在孔外，只能在凝膠顆粒外的空間向下流動(dòng)，因此(yīncǐ)流程較短，移動(dòng)速度快；所以首先流出。相對(duì)分子質(zhì)量較小的物質(zhì)由于直徑小于凝膠網(wǎng)孔，可完全滲透進(jìn)入凝膠顆粒的網(wǎng)孔，在向下移動(dòng)過程中，因此(yīncǐ)流程較長，移動(dòng)速率慢；所以最后流出。中等大小的分子，它們?cè)谀z顆粒內(nèi)外部分滲透，滲透的程度取決于它們分子的大小，所以它們流出的時(shí)間介于二者之間，這樣分子大的組分先流出，分子小的組分后流出。這樣樣品經(jīng)過凝膠層析后，各個(gè)組分便按分子從大到小的順序依次流出，從而達(dá)到了分離的目的。第七頁，共20頁?！緦?shí)驗(yàn)(shíyàn)器材】層析柱恒流泵紫外檢測(cè)儀部分(bùfen)收集器試管等普通玻璃器皿第八頁，共20頁。第九頁，共20頁。第十頁，共20頁。第十一頁，共20頁。第十二頁，共20頁?！緦?shí)驗(yàn)(shíyàn)試劑】待分離樣品葡聚糖凝膠SephadexG-100洗脫(xǐtuō)液：0.1mol/LpH6.8磷酸緩沖液第十三頁，共20頁?！静僮鞣椒ā恳?、凝膠的處理SephadexG-100干粉經(jīng)蒸餾水室溫充分溶脹48h，或沸水浴中煮沸2h，冷卻至室溫后抽真空脫去顆粒(kēlì)空隙中的空氣。

第十四頁，共20頁。二、裝柱關(guān)閉出口，向柱內(nèi)加入(jiārù)洗脫液約1cm高，將濃漿狀的凝膠緩慢地傾入柱中，使之自然沉降，凝膠沉降約1㎝高度后打開出水口，繼續(xù)加入(jiārù)凝膠漿，直到凝膠沉積至一定高度即可。裝柱要求連續(xù)，均與，無氣泡，無“紋路”。第十五頁，共20頁。三、平衡將洗脫(xǐtuō)液與恒流泵相連，恒流泵出口端與層析柱入口相連，用2～3倍柱床體積的洗脫(xǐtuō)液平衡，流速為0.5ml/min。第十六頁，共20頁。四、加樣與洗脫將柱中多余的液體放掉出，使液面剛好蓋過凝膠，關(guān)閉出口，將1ml樣品沿層析柱管壁小心加入，加完后打開底端出口，使液面降至與凝膠面相平時(shí)關(guān)閉出口，加洗脫液至液層4cm左右(zuǒyòu)，接上恒流泵，開始洗脫（0.5ml/min）。第十七頁，共20頁。五、收集與測(cè)定用部分收集器收集洗脫(xǐtuō)液。紫外檢測(cè)儀280nm處檢測(cè)，將檢測(cè)信號(hào)輸入色譜工作站系統(tǒng)，繪制洗脫(xǐtuō)曲線。第十八頁，共20頁。六、凝膠柱的處理凝膠用過后，反復(fù)用蒸餾水通過(tōngguò)柱（2~3倍床體積）即可。第十九頁，共20頁。注意事項(xiàng)各接頭不能漏氣，連續(xù)用的小乳膠管不要有破損，否則造成漏氣、漏液。注意恒壓瓶內(nèi)的排氣管應(yīng)無液體，并隨著柱下口溶液的流出不斷有氣泡產(chǎn)生，則表示恒壓瓶不漏氣。操作過程中，層析柱內(nèi)液面不斷下降，則表示整個(gè)系統(tǒng)有漏氣之處，應(yīng)仔細(xì)檢查并加以糾正。始終保持柱內(nèi)液面