動物細胞工程離體植物器官、組織或細胞愈傷組織胚狀體脫（去）分化再分化（芽、根）植物細胞工程常用的技術(shù)手段有哪些？植物組織培養(yǎng)使用的培養(yǎng)基：

固體有機物（蔗糖）植物激素植物體復(fù)習目的植物體植物體細胞雜交植物細胞A

植物細胞B

去細胞壁原生質(zhì)體融合雜種細胞愈傷組織雜種植株植物組織培養(yǎng)植物細胞融合1、植物體細胞雜交的結(jié)果是產(chǎn)生了？2、這個過程中涉及的原理是？雜種植株細胞膜的流動性植物細胞的全能性目的植物體多莉克隆猴動物細胞工程常用的技術(shù)手段動物細胞培養(yǎng)動物細胞融合單克隆抗體核移植動物細胞培養(yǎng)技術(shù)是其他動物細胞工程技術(shù)的基礎(chǔ)。一、動物細胞培養(yǎng)動物細胞培養(yǎng)和核移植技術(shù)1.選材：動物胚胎或幼齡動物的組織、器官，它們細胞增殖能力強，分裂旺盛，分化程度低，容易培養(yǎng)。在進行動物細胞培養(yǎng)時，用胰蛋白酶分散細胞，說明細胞間的物質(zhì)主要是蛋白質(zhì)。動物細胞培養(yǎng)適宜的PH為7.2—7.4，此環(huán)境下胃蛋白酶（2.0）沒有活性，而胰蛋白酶(7.2-8.4)的活性較高。2.分散成單個細胞3.動物細胞生長特性：細胞貼壁：懸液中分散的細胞很快就貼附在瓶壁上，稱為細胞貼壁。要求：培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)皿的內(nèi)表面光滑、無毒、易于貼附。細胞的接觸抑制：當貼壁細胞分裂生長到表面相互接觸時，細胞就會停止分裂增殖，這種現(xiàn)象稱為細胞的接觸抑制。

動物細胞培養(yǎng)動物細胞培養(yǎng)就是從動物有機體中取出相關(guān)的組織,將它分散成單個細胞,然后,放在適宜的培養(yǎng)基中,讓這些細胞生長和增殖.2.原理：細胞增殖1.概念3.過程：動物胚胎或幼齡動物的組織、器官細胞懸浮液（單個細胞）胰蛋白酶動物組織細胞間隙中含有一定量的彈性纖維等蛋白質(zhì)，將細胞網(wǎng)絡(luò)起來形成具有一定彈性和韌性的組織和器官。（分解彈性纖維）10代細胞原代培養(yǎng)50代細胞傳代培養(yǎng)細胞株無限傳代細胞系遺傳物質(zhì)未改變遺傳物質(zhì)改變剪碎

細胞株：原代細胞一般傳至10代左右細胞生長停滯，大部分細胞衰老死亡，少數(shù)細胞存活到40~50代，這種傳代細胞為細胞株。

細胞系：細胞株傳代至50代后又出現(xiàn)細胞生長停滯狀態(tài)，只有部分細胞由于遺傳物質(zhì)的改變，使其在培養(yǎng)條件下可以無限制傳代，這種傳代細胞為細胞系。

細胞株和細胞系的區(qū)別：細胞系的遺傳物質(zhì)改變，具有癌細胞的特點，失去接觸抑制，容易傳代培養(yǎng)。解答概念原代培養(yǎng)：將動物組織消化后的初次培養(yǎng)至細胞貼壁,稱為原代培養(yǎng)。傳代培養(yǎng)：用胰蛋白酶將出現(xiàn)接觸抑制的貼壁細胞從培養(yǎng)瓶壁上脫離下來，制成細胞懸液，分裝到多個培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)，這個過程叫傳代培養(yǎng)。上述過程中，在第一培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)到接觸抑制就是原代培養(yǎng)，之后轉(zhuǎn)移到其它培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)就是傳代培養(yǎng)細胞接觸抑制

細胞在貼壁生長過程中，隨著細胞分裂，數(shù)量不斷增加，最后形成一個單層，此時細胞間相互接觸，細胞分裂和生長停止，數(shù)量不再增加。

細胞在體外培養(yǎng)中所需的條件

與體內(nèi)細胞基本相同。

【討論】多細胞動物和人體的細胞都生活在內(nèi)環(huán)境中，討論以下問題：1.體外培養(yǎng)細胞時需要提供哪些物質(zhì)？

提示：充足的營養(yǎng)供給、適宜的溫度、適宜的pH和氣體環(huán)境。2.體外培養(yǎng)的細胞需要什么樣的環(huán)境條件？

提示：無菌、無毒的環(huán)境。1、無菌、無毒的環(huán)境（添加一定量的抗生素，定期更換培養(yǎng)液）2、營養(yǎng)（葡萄糖、氨基酸、無機鹽、微量元素、動物血清、血漿、維生素、促生長因子等。）3、溫度和PH

36.5+0.5度；PH為7.2-7.4。4、氣體環(huán)境：O2和CO2（95%空氣和5%CO2）補充合成培養(yǎng)基中缺乏的物質(zhì)4.動物細胞培養(yǎng)的條件5.動物細胞培養(yǎng)的結(jié)果：獲得細胞群（1）生產(chǎn)蛋白質(zhì)生物制品：病毒疫苗、干擾素、單克隆抗體等。（2）獲得大量自身的皮膚細胞，用于植皮。還可作為基因工程中的受體細胞。（3）用于檢測有毒物質(zhì)，判斷某種物質(zhì)的毒性。（4）用于生理、病理、藥理等方面的研究，為治療和預(yù)防疾病提供理論依據(jù)5.動物細胞培養(yǎng)技術(shù)的應(yīng)用思考：2、為什么選用動物胚胎或幼齡個體的器官或組織做動物細胞培養(yǎng)材料？1、動物細胞培養(yǎng)液的主要成分是什么？較植物組培培養(yǎng)基有何獨特之處？3、為什么培養(yǎng)前要將組織細胞分散成單個細胞？4、動物細胞培養(yǎng)能否像綠色植物組織培養(yǎng)那樣最終培養(yǎng)成新個體？主要成分：葡萄糖、氨基酸、無機鹽、維生素和動物血清等。獨特之處有：1、液體培養(yǎng)基2、成分中有動物血清等因為這些組織或器官上的細胞生命力旺盛，分裂能力強使每一個細胞都能與培養(yǎng)液直接接觸并進行物質(zhì)交換，保證生命活動的正常進行。不能，動物細胞培養(yǎng)只能使細胞數(shù)目增多，不能發(fā)育成新的動物個體獲得細胞細胞的全能性細胞株、細胞系植物體培養(yǎng)結(jié)果或細胞分泌蛋白快速繁殖、培育無病毒植株等培養(yǎng)目的葡萄糖、動物血清蔗糖、植物激素培養(yǎng)基特有成分液體培養(yǎng)基固體培養(yǎng)基培養(yǎng)基性質(zhì)細胞增殖原理動物細胞培養(yǎng)植物組織培養(yǎng)比較項目2、植物組織培養(yǎng)和動物細胞培養(yǎng)的比較二、動物體細胞核移植技術(shù):將動物的一個細胞的細胞核，移入一個已經(jīng)去掉細胞核的卵母細胞中，使其重組并發(fā)育成一個新的胚胎，這個新的胚胎最終發(fā)育成動物個體。用核移植的方法得到的動物稱為克隆動物核移植胚胎細胞核移植體細胞核移植（難度高）受體細胞：MⅡ期的卵母細胞用核移植的方法得到的動物。供體細胞培養(yǎng)（MⅡ卵母細胞）減數(shù)第二次分裂中期去核的卵母細胞供體細胞注入去核卵母細胞受體細胞激活，完成分裂、發(fā)育胚胎移植卵細胞Ａ母綿羊Ｂ母綿羊乳腺細胞細胞質(zhì)細胞核細胞核移植早期胚胎卵裂C母綿羊子宮胚胎移植多莉羊分娩妊娠多莉羊的培育過程融合后的卵細胞克隆羊的成功證明了什么？1、動物體細胞核具有全能性；2、細胞質(zhì)具有調(diào)控細胞核發(fā)育的作用。體細胞核移植技術(shù)的應(yīng)用前景畜牧業(yè)、醫(yī)藥衛(wèi)生以及其他領(lǐng)域有著廣泛應(yīng)用前景1加速家畜遺傳改良進程，促進優(yōu)良畜群繁育2保護瀕危物種，增加動物的存活數(shù)量3可作為生物反應(yīng)器，生產(chǎn)醫(yī)用蛋白，克隆動物細胞、組織、器官可作為移植的供體，了解胚胎發(fā)育及衰老過程、做疾病模型等體細胞核移植技術(shù)存在的問題1.許多克隆動物表現(xiàn)出遺傳和生理缺陷，如體型過大，異常肥胖，發(fā)育困難，免疫失調(diào)等。2.成功率非常低及克隆動物食品的安全性問題。胚胎移植技術(shù)試管動物（嬰兒）培養(yǎng)過程卵細胞精子體外受精受精卵胚胎新個體母體子宮內(nèi)孕育、產(chǎn)出克隆動物的研究意義1.克隆動物作為生物反應(yīng)器，生產(chǎn)醫(yī)用蛋白2.改良動物品種3.治療人類疾病，作為供體4.保護瀕危動物2.某研究小組為測定藥物對體外培養(yǎng)細胞的毒性，準備對某種動物的肝腫瘤細胞(甲)和正常肝細胞(乙)進行動物細胞培養(yǎng)。下列說法正確的是()A．在利用兩種肝組織塊制備肝細胞懸液時，也可用胃蛋白酶處理B．細胞培養(yǎng)應(yīng)在含5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱中進行，CO2的作用是刺激細胞的呼吸C．甲、乙細胞在持續(xù)的原代培養(yǎng)過程中，乙會出現(xiàn)停止增殖的現(xiàn)象D．僅用該培養(yǎng)液也能用來培養(yǎng)乙肝病毒c1．(2009·浙江卷)用動、植物成體的體細胞進行離體培養(yǎng)，下列敘述正確的是()A．都需要用CO2培養(yǎng)箱B．都需要用液體培養(yǎng)基C．都要在無菌條件下進行D．都可體現(xiàn)細胞的全能性C誘導(dǎo)方式物理法化學(xué)法生物法：滅活的病毒仙臺病毒紫外線喪失感染性（不感染細胞）保留融合活性（誘導(dǎo)細胞融合）一、動物細胞融合1.方法2.滅活病毒誘導(dǎo)細胞融合的原理：病毒表面含有的糖蛋白和一些酶能夠與細胞膜上的糖蛋白發(fā)生作用，使細胞互相凝聚，細胞膜上的蛋白質(zhì)分子和脂質(zhì)分子重新排布，細胞膜打開，細胞發(fā)生融合。滅活是指用物理或化學(xué)手段使病毒或細菌失去感染能力，但并不破壞這些病原體的抗原結(jié)構(gòu)。3.用途：制備單克隆抗體滅活的病毒顆粒黏附于細胞表面細胞膜被病毒顆粒穿通細胞膜連接細胞融合，形成雜種細胞（細胞膜具有一定的流動性）細胞核病毒顆粒細胞核

動物細胞融合過程示意圖二、單克隆抗體什么是抗體？抗體是機體受抗原刺激后產(chǎn)生的、并能與該抗原發(fā)生特異性結(jié)合的具有免疫功能的球蛋白。B淋巴細胞產(chǎn)生抗體。B淋巴細胞與抗體１．B淋巴細胞受抗原刺激后，可以產(chǎn)生抗體。２．動物體內(nèi)的B淋巴細胞可以產(chǎn)生百萬種以上的抗體，每種抗體對特定的抗原具有特異性免疫作用。３．每一個淋巴細胞只能產(chǎn)生一種抗體。單克隆抗體由單個B淋巴細胞經(jīng)過無性繁殖（克?。纬苫蛐拖嗤募毎?，這一細胞群所產(chǎn)生的化學(xué)性質(zhì)單一、特異性強的抗體稱為單克隆抗體。

特點：特異性強、靈敏度高

單:單個細胞克隆:無性繁殖抗體:化學(xué)性質(zhì)單一、特異性強體外培養(yǎng)的條件下，一個B淋巴細胞是不可能無限增值的，如何使單個淋巴細胞增殖呢？如何大量生產(chǎn)單克隆抗體？利用淋巴細胞產(chǎn)生抗體的功能利用腫瘤細胞無限增殖的特性利用細胞融合的技術(shù)將兩種細胞融合獲得具有淋巴細胞和腫瘤細胞特性的雜交瘤細胞利用動物細胞培養(yǎng)技術(shù)大量培養(yǎng)雜交瘤細胞1、單克隆抗體制備過程

注射抗原效應(yīng)B淋巴細胞骨髓瘤細胞細胞融合、篩選雜交瘤細胞細胞培養(yǎng)篩選，繼續(xù)培養(yǎng)足夠數(shù)量的、能產(chǎn)生特定抗體的細胞群體外培養(yǎng)注射到小鼠腹腔單克隆抗體誘導(dǎo)其融合的方法有哪些？思考：1、本過程利用了哪些原理？免疫原理，細胞融合原理和動物細胞培養(yǎng)原理2、為什么選用小鼠骨髓瘤細胞與B細胞融合？這樣融合成的雜交瘤細胞，繼承了雙親細胞的遺傳物質(zhì)，不僅具有B細胞分泌抗體的能力，而且還有無限增殖的本領(lǐng)，因而可以獲得大量單克隆抗體單克隆抗體的應(yīng)用與常規(guī)抗體相比，單克隆抗體產(chǎn)量高，特異性強，靈敏度高，優(yōu)越性十分明顯。應(yīng)用主要有：1、臨床診斷2、作為載體，運載抗癌藥物，形成“生物導(dǎo)彈”治療腫瘤

資料：目前世界各國已經(jīng)研制出數(shù)以百計的單克隆抗體。許多缺乏良好診斷手段的傳染病、免疫性疾病、血液病、內(nèi)分泌疾病和遺傳病，用單克隆抗體作為診斷手段，是一個必然趨勢。另外，用單克隆抗體做體內(nèi)診斷，借以鑒別和定位體內(nèi)“病灶”也引起人們的注意，目前，主要用于腫瘤追蹤及心肌梗塞