第3章

培養(yǎng)基及其配制講授：白鳳麟

2013.09.26培養(yǎng)基的種類培養(yǎng)基的組成培養(yǎng)基的配制

本章主要內(nèi)容◆培養(yǎng)基形態(tài)不同：固體培養(yǎng)基、液體培養(yǎng)基◆培養(yǎng)過程不同：初代培養(yǎng)基、繼代培養(yǎng)基◆其作用不同：誘導培養(yǎng)基、增殖培養(yǎng)基、生根培養(yǎng)基

◆營養(yǎng)水平不同：基本培養(yǎng)基、完全培養(yǎng)基一、培養(yǎng)基的種類二、培養(yǎng)基的組成

植物體內(nèi)至少含有幾十種化學元素，其中大部分元素在植物體內(nèi)起到一定的生理作用：a、組成各種化合物，參與機體的建造，成為結(jié)構(gòu)物質(zhì)；b、構(gòu)成一些特殊的生理活性物質(zhì)，參與活躍的新陳代謝；c、元素之間相互協(xié)調(diào)，以維持離子濃度平衡、膠體穩(wěn)定、電荷平衡等點化學方面的作用；d、發(fā)育方面，特定的元素影響植物的形態(tài)發(fā)生和組織、器官建成。其它添加物固化劑植物生長調(diào)節(jié)劑有機營養(yǎng)成分無機營養(yǎng)成分培養(yǎng)基組成無機營養(yǎng)成分+有機營養(yǎng)成分=基本培養(yǎng)基Arnon和Stout（1939）提出的確定植物必需營養(yǎng)元素的3個標準A、缺乏該元素，植物生育發(fā)生障礙，不能完成其生活史。B、缺乏該元素，就表現(xiàn)為專一的病癥，且這種缺素癥可以用補充該元素來預防和恢復。C、該元素在植物營養(yǎng)生理上表現(xiàn)直接的效果，而不是由于土壤的物理、化學、微生物條件的改進而產(chǎn)生的間接效果。國內(nèi)外公認的高等植物所必需的營養(yǎng)元素有16（17）種：

C、H、O、N、P、K、Ca、Mg、S、Fe、B、Mn、Cu、Zn、Mo、Cl、（Ni）在植物中含量差別很大，同一元素在植物不同時期、不同條件下含量也不同。根據(jù)植物體內(nèi)含量多少，可把這些元素分為※大量營養(yǎng)元素：占干物質(zhì)重量的0.1%以上；

C、H、O、N、P、K、Ca、Mg、S9種※微量營養(yǎng)元素：占干物質(zhì)重量的0.1%以下有的只含0.1mg/kg

Fe、B、Mn、Cu、Zn、Mo、Cl7種按照國際植物生理協(xié)會的建議：所需濃度>0.5mmol/L的元素為大量元素所需濃度<0.5mmol/L的元素為微量元素1、大量元素N是蛋白質(zhì)、酶、葉綠素、維生素、核酸、磷脂、生物堿等的組成成分，在植物生命活動中占有重要的位置。

P是磷脂的主要成分。培養(yǎng)基中常用KH2PO4NaH2PO4等。

K對碳水化合物合成，轉(zhuǎn)移，以及氮素代謝等有密切關系。Mg、S、Ca是葉綠素的組成成分，又是激酶的活化劑，對核蛋白體結(jié)構(gòu)具有穩(wěn)定作用；S是含S氨基酸的蛋白質(zhì)的組成成分。Ca是構(gòu)成細胞壁的成分，對細胞分裂，穩(wěn)定質(zhì)膜結(jié)構(gòu)有顯著作用，此外，Ca及鈣調(diào)素在細胞信號轉(zhuǎn)導中起重要作用。2、微量元素

在微量元素中，鐵的使用最大：

◆一些氧化酶的組成成分

◆葉綠素形成的必要條件

◆使用乙二胺四乙酸鐵（EDTA-Fe）鰲合物防止鐵的沉淀

硼與蛋白質(zhì)合成、糖類運輸有著密切的關系

銅是某些氧化酶的成分，能夠促進離體根的生長

錳參與植物的光合、呼吸代謝

鉬參與氮素的代謝

氯是光合作用水光解的活化劑微量元素的主要作用是作為酶的輔助因子或激活劑參與代謝的調(diào)節(jié)。

缺鐵癥狀：葉面呈綠色網(wǎng)紋狀失綠。隨病勢發(fā)展，葉片失綠程度加重，出現(xiàn)整葉變?yōu)榘咨?，葉緣枯焦，引起落葉。嚴重缺鐵時，新梢頂端枯死。桃樹缺銅癥狀：新梢頂端葉片的葉尖失綠變黃，葉片出現(xiàn)褐色斑點至擴大變成深褐色，引起落葉。枝頂端生長不良，其下部的芽開始生長，形成叢生的細枝。菊花缺錳典型癥狀：葉脈間失綠褪色，但葉脈仍保持綠色，脈間出現(xiàn)壞死斑，缺素癥狀由幼葉開始。菜豆缺鉬典型癥狀：葉較小，葉脈間失綠,有壞死斑點，且葉邊緣焦枯，向內(nèi)卷曲。十字花科植物缺鉬時葉片卷曲畸形，老葉變厚且枯焦。白菜缺硼典型癥狀：受精不良,籽粒減少，“花而不實”，“蕾而不花”；根尖、莖尖的生長點停止生長，而形成簇生狀；常引起各種腐爛病。馬鈴薯3、碳源

碳源物質(zhì)包括糖類物質(zhì)、醇類物質(zhì)和有機酸，以糖類物質(zhì)最重要。糖類物質(zhì)特點：

◆具有熱易變的性質(zhì)◆利于吸收和利用

◆使用濃度一般在2%—5%

◆提供能源和調(diào)節(jié)滲透壓4、維生素類

◆以各種輔酶的形式存在

◆參與多種代謝活動

◆對生長，分化等有很好的促進作用

◆主要分為脂溶性維生素和水溶性維生素

◆常用維生素有VB1和VB6

5、肌醇

◆環(huán)己六醇

◆細胞壁的構(gòu)建材料

◆參與碳水化合物、磷脂代謝及離子平衡等生理活動

◆促進活性物質(zhì)發(fā)揮作用6、氨基酸

◆蛋白質(zhì)的組成成分

◆有機氮源

◆可直接被細胞吸收利用

◆培養(yǎng)基中常用的是甘氨酸7、天然復合物

◆促進某些愈傷組織和器官的生長

◆化學成分不明、復雜

◆天然營養(yǎng)混合物如：水解酪蛋白、玉米胚乳、酵母提取物8、瓊脂

◆是使用最普遍的凝固劑◆用量一般在6—10g/L之間◆顏色以淺、透明度高好，潔凈為上品

除了瓊脂外，在組織培養(yǎng)中還可以使用瓊脂糖、結(jié)冷膠等。9、活性炭

◆吸附培養(yǎng)基及培養(yǎng)物分泌物中的抑制物質(zhì)

◆抑制外植體褐變

◆防止玻璃苗的產(chǎn)生

◆促進培養(yǎng)物生長和分化

◆促進生根缺點：

◆沒有選擇性10、抗生素

◆防止外植體內(nèi)生菌造成的污染活性炭11、生長素類

◆促進細胞伸長和分裂

◆促進生根、抑制器官脫落、性別控制、延長休眠、頂端優(yōu)勢、單性結(jié)實

◆誘導愈傷組織形成

◆溶于95%酒精或0.1mol/L的NaOH中，后者的溶解效果更好

◆常用的生長素：

IAA(吲哆乙酸)NAA(奈乙酸)2,4-D(二氯苯氧乙酸)IBA(吲哆丁酸)生長素作用強弱順序：IAANAAIBA2,4-D強弱2，4-D常用于誘導愈傷組織，IBA和NAA常用于生根12、細胞分裂素類

◆促進細胞分裂和分化

◆誘導胚狀體和不定芽的形成

◆延緩組織的衰老并增強蛋白質(zhì)的合成

◆用于離體成花的調(diào)控

◆溶于0.5—1.0mol/L的鹽酸或稀薄的NaOH中

◆常用的細胞分裂素：

KT(激動素)BA(6-卞基腺嘌呤)ZT(異戊烯氨基嘌呤)玉米素13、赤霉素類和脫落酸

A、赤霉素類

◆組織培養(yǎng)中不常使用

◆加速細胞的伸長生長

◆促進細胞的分裂

◆主要是GA3

B、脫落酸

◆抑制細胞分裂和伸長

◆促進脫落和衰老

◆促進休眠和提高抗逆能力14、水作用：是植物原生質(zhì)體的組成成分，也是一切代謝過程的介質(zhì)和溶媒。注意：用蒸餾水，最好是雙蒸水；以保持培養(yǎng)基成分的精確性。大規(guī)模生產(chǎn)時可用自來水。1、MS培養(yǎng)基

◆無機鹽濃度高◆高含量的氮、鉀，尤其是硝酸鹽◆含有一定數(shù)量的銨鹽◆營養(yǎng)豐富◆不需要添加更多的有機附加物（一）、幾種常見培養(yǎng)基的特點（二）、White培養(yǎng)基

◆1943年由White為培養(yǎng)番茄根尖而設計

◆

1963年作了改良，提高MgSO4的濃度和增加硼元素

◆無機鹽濃度較低◆使用廣泛◆在生根培養(yǎng)、胚胎培養(yǎng)中有良好的效果（三）、B5培養(yǎng)基

◆1968年由Gamborg等為培養(yǎng)大豆根細胞而設計◆含有較低的銨鹽

◆較高的硝酸鹽和鹽酸硫胺素（四）、N6培養(yǎng)基◆1974年朱至清等為水稻等禾谷類作物花藥培養(yǎng)設計◆成分較簡單，KNO3和（NH4）2SO4含量高。在國內(nèi)已廣泛應用于小麥、水稻及其他禾谷類植物的花粉和花藥培養(yǎng)。AgNO3:作用：抑制乙烯活性，防止玻璃化苗的出現(xiàn)濃度：1-10mg/L抗生素：種類：青霉素、鏈霉素、慶大霉素等。作用：可防止外植體內(nèi)生菌污染。濃度：5—20mg/L。1、母液(stocksolution)的配制和保存所謂母液是欲配制液的濃縮液。意義:①保證各物質(zhì)成分的準確性②配制時的快速移?、郾阌诘蜏乇２?。三、培養(yǎng)基的配制單配法：將培養(yǎng)基配方中的各種成分分別配成一定濃度的母液。一般用mg/ml?；炫浞ǎ簩最悹I養(yǎng)成分按配方中的用量擴大一定倍數(shù)稱量，分別溶解后再混合成母液。母液配制時可分別配成大量元素、微量元素、鐵鹽、有機物和激素類等

母液的配制方法：ＭＳ培養(yǎng)基母液的配制MS母液配制：MSI 大量元素20X MSII 微量元素200X MSIII 鐵鹽 200X MSIV 有機物 200X MSV 肌醇 200X 激素 0.1mg/ml將1、2、4、5稱好放入燒杯分別溶解混合，將3最后混合，再定容到1L，放入試劑瓶貼標簽，備用500mL甲1、2、4、5500mL乙3＋

定容貼標簽1L

MSIX202013.9.26HXH注：Ca2+和S042-混合后易沉淀。將1～7稱好放入燒杯分別溶解混合，定容到1L，放入試劑瓶貼標簽，備用1000mL1～7

定容貼標簽1L

MSIIX2002013.9.26HXHMSⅢ(鐵鹽)配方用量mg/L200X（mg）稱量(g)1.FeSO4·7H2O27.855605.562.Na2·EDTA·2H2O37.374607.46將1稱好放入燒杯甲溶解，將2放入燒杯乙溶解，再混合定容到1L，放入試劑瓶貼標簽，備用1L500mL甲1500mL乙2＋混合定容貼標簽

MSIX2002013.9.26HXH將1、2、3、4稱好放入燒杯分別溶解混合，定容到1L，放入試劑瓶貼標簽，備用1000mL1～4

定容貼標簽1L

MSIVX2002013.9.26HXH將肌醇稱好放入燒杯溶解定容到1L，放入試劑瓶貼標簽，備用1000mL1溶解定容貼標簽1L

MSVX2002013.9.26HXH母液配制時應注意事項：①母液配好后放人冰箱內(nèi)低溫保存（4℃），用時再按比例稀釋。②其中III、IV、以及激素類物質(zhì)應以棕色瓶盛裝。③母液使用前搖動瓶子，如有沉淀、絮狀物、微生物污染應停止使用④取樣時移液管要對應取樣，防止交叉污染2、培養(yǎng)基的配制：MS＋BA2＋NAA0.2＋糖3.0％＋瓊脂0.7％pH=5.8

MS： MSI50ml MSII5ml MSIII5ml MSIV5ml MSV5ml BA： 20ml;NAA：2ml 糖： 30g;瓊脂：7gV貯備液用量＝V配制/濃縮倍數(shù)V激素貯備液＝C激素*V配制/0.1mg/ml培養(yǎng)基的選擇培養(yǎng)基＝基本培養(yǎng)基＋植物激