第十一章

細(xì)胞衰老與凋亡●細(xì)胞衰老(cellularaging或cellsenescence)

●細(xì)胞凋亡(Apoptosis)

●癌細(xì)胞人的壽命應(yīng)該有多長？哺乳類動物的壽命應(yīng)該是其生長期的7倍。人的生長期是最后一顆牙齒長出來的時(shí)間(20-25歲)。因此人的壽命應(yīng)該為100-175歲，正常應(yīng)該是120歲。第一節(jié)細(xì)胞衰老

(cellularaging或cellsenescence)“衰”與“老”“衰”是指功能或體力的減退?！袄稀笔侵改挲g超過某一界限。衰老是機(jī)體在退化時(shí)期生理功能下降和紊亂的綜合表現(xiàn)，是不可逆的生命過程。衰老是客觀存在的，是細(xì)胞生命活動的客觀規(guī)律。機(jī)體的衰老與細(xì)胞的衰老是相關(guān)聯(lián)的。衰老有三種表現(xiàn)形式：生理性衰老、病理性衰老、心理性衰老●Hayflick界限(HayflickLimitation）●衰老細(xì)胞結(jié)構(gòu)的變化●細(xì)胞衰老的分子機(jī)理一、Hayflick界限(HayflickLimitation）●概念：關(guān)于細(xì)胞增殖能力和壽命是有限的觀點(diǎn)。細(xì)胞，至少是培養(yǎng)的二倍體細(xì)胞，不是不死的，而是有一定的壽命；它們的增殖能力不是無限的，而是有一定的界限，這就是Hayflick界限◆癌細(xì)胞或培養(yǎng)的細(xì)胞系是不正常細(xì)胞，其染色體數(shù)目或形態(tài)已經(jīng)不同于原先的細(xì)胞◆細(xì)胞的增殖能力與供體年齡有關(guān)◆物種壽命與培養(yǎng)細(xì)胞壽命之間存在著一定的關(guān)系 ●二倍體細(xì)胞的衰老是由細(xì)胞本身決定的 ◆決定細(xì)胞衰老的因素在細(xì)胞內(nèi)部，而不是外部的環(huán)境 ◆是細(xì)胞核而不是細(xì)胞質(zhì)決定了細(xì)胞衰老細(xì)胞來源人胚肺成纖維細(xì)胞中年人成纖維細(xì)胞老年人成纖維細(xì)胞可增殖代數(shù)40-60202-4不同年齡來源的人成纖維細(xì)胞的增殖代數(shù)二、衰老細(xì)胞結(jié)構(gòu)的變化●細(xì)胞核的變化●內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的變化:衰老動物內(nèi)質(zhì)網(wǎng)成分彌散性地分散于核周胞質(zhì)中，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的總量似乎是減少了●線粒體的變化:通常，細(xì)胞中線粒體的數(shù)量隨齡減少，而其體積則隨齡增大●致密體的生成●膜系統(tǒng)的變化

細(xì)胞核的變化◆體外培養(yǎng)的二倍體細(xì)胞，細(xì)胞核隨著細(xì)胞分裂次數(shù)的增加不斷增大◆細(xì)胞核的核膜內(nèi)折（invagination）、染色質(zhì)固縮化

膜系統(tǒng)的變化◆衰老的細(xì)胞，其膜流動性降低、韌性減小◆衰老細(xì)胞間間隙連接;細(xì)胞膜內(nèi)（P面）顆粒的分布也發(fā)生變化三、細(xì)胞衰老的分子機(jī)理●氧化性損傷學(xué)說：代謝過程中產(chǎn)生的活性氧基團(tuán)或分子（ROS---O2-，OH-，H2O2），引發(fā)的氧化性損傷的積累，最終導(dǎo)致衰老?！穸肆Ｅc衰老：發(fā)現(xiàn)端粒長度確實(shí)與衰老有著密切的關(guān)系，提出細(xì)胞衰老的“有絲分裂鐘”學(xué)說（Harley,1990）。端粒由富含G、C簡單重復(fù)順序所組成，其長度隨細(xì)胞衰老過程而逐漸縮短，但端粒酶卻可維持端粒的長度?！駌DNA與衰老:酵母染色體外rDNA環(huán)（ERC）的積累，導(dǎo)致細(xì)胞衰老?！癯聊畔⒄{(diào)節(jié)蛋白復(fù)合物（Sircomplex）與衰老：Sircomplex存在于異染色質(zhì)區(qū)，其作用在于阻斷所在位點(diǎn)DNA轉(zhuǎn)錄?！馭GS1基因和WRN基因與衰老：SGS1基因和WRN基因同源,編碼解旋酶;酵母sgs1突變體壽命明顯短于野生型（平均9.5代:24.5代）;wrn突變引發(fā)早老癥.●發(fā)育程序與衰老●線粒體DNA與衰老：Sen-DNA(80年代);mtDNA突變積累與細(xì)胞衰老●衰老因子積累說：亦稱“蛋白質(zhì)合成差錯(cuò)成災(zāi)說”Megbegeeb（1962）orgel（1973）提出，認(rèn)為有缺陷的酶→干擾復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、翻譯等水平→錯(cuò)誤積累→直至成災(zāi)●基因調(diào)節(jié)

第二節(jié)細(xì)胞凋亡(Apoptosis)●細(xì)胞凋亡的概念及其生物學(xué)意義●細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)和生物化學(xué)特征●細(xì)胞凋亡的分子調(diào)控機(jī)理一、細(xì)胞凋亡的概念及其生物學(xué)意義●概念：細(xì)胞凋亡是一個(gè)主動的由基因決定的自動結(jié)束生命的過程，所以也常常被稱為細(xì)胞編程死亡（programmedcelldeath,PCD）。凋亡細(xì)胞將被吞噬細(xì)胞吞噬。 ●生物學(xué)意義：細(xì)胞凋亡對于多細(xì)胞生物個(gè)體發(fā)育的正常進(jìn)行，自穩(wěn)平衡的保持以及抵御外界各種因素的干擾方面都起著非常關(guān)鍵的作用：

蝌蚪尾的消失，骨髓和腸的細(xì)胞凋亡，

脊椎動物的神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育，

發(fā)育過程中手和足的成形過程。二、細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)和生物化學(xué)特征●細(xì)胞凋亡與壞死(necrosis)●細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)特征●細(xì)胞凋亡的檢測方法●誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的因子細(xì)胞凋亡與壞死(necrosis)●二者的主要區(qū)別是，細(xì)胞凋亡過程中，細(xì)胞質(zhì)膜反折，包裹斷裂的染色質(zhì)片段或細(xì)胞器，然后逐漸分離，形成眾多的凋亡小體（apoptoticbodies），凋亡小體則為鄰近的細(xì)胞所吞噬。整個(gè)過程中，細(xì)胞質(zhì)膜的整合性保持良好，死亡細(xì)胞的內(nèi)容物不會逸散到胞外環(huán)境中去，因而不引發(fā)炎癥反應(yīng)。相反，在細(xì)胞壞死時(shí)，細(xì)胞質(zhì)膜發(fā)生滲漏，細(xì)胞內(nèi)容物，包括膨大和破碎的細(xì)胞器以及染色質(zhì)片段，釋放到胞外，導(dǎo)致炎癥反應(yīng)細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)特征◆凋亡的起始：細(xì)胞表面的特化結(jié)構(gòu)如微絨毛消失，細(xì)胞間接觸的消失，但細(xì)胞膜依然完整；線粒體大體完整，但核糖體逐漸從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上脫離，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)囊腔膨脹，并逐漸與質(zhì)膜融合；染色質(zhì)固縮，形成新月形帽狀結(jié)構(gòu)等形態(tài)，沿著核膜分布

◆凋亡小體的形成：核染色質(zhì)斷裂為大小不等的片段，與某些細(xì)胞器如線粒體一起聚集，為反折的細(xì)胞質(zhì)膜所包圍。細(xì)胞表面產(chǎn)生了許多泡狀或芽狀突起，逐漸形成單個(gè)的凋亡小體 ◆凋亡小體逐漸為鄰近的細(xì)胞吞噬并消化細(xì)胞凋亡的檢測方法◆形態(tài)學(xué)觀察：染色法、電鏡◆DNA電泳：細(xì)胞凋亡的主要特征是形成大小為180～200bp特征性的DNAladders ◆TUNEL測定法（DNA斷裂的原位末端標(biāo)記法）◆彗星電泳法：將單個(gè)細(xì)胞懸浮于瓊脂糖凝膠中，經(jīng)裂解處理后，再在電場中；進(jìn)行短時(shí)間的電泳，并用熒光燃料染色?！袅魇郊?xì)胞分析：根據(jù)凋亡細(xì)胞DNA斷裂和丟失，采用碘化丙啶使DNA產(chǎn)生激發(fā)熒光，用流式細(xì)胞儀檢出凋亡的亞二倍體細(xì)胞，同時(shí)又能觀察細(xì)胞的周期狀態(tài)。誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的因子◆物理性因子，包括射線（紫外線，射線等），較溫和的溫度刺激（如熱激，冷激）等◆化學(xué)及生物因子：包括活性氧基團(tuán)和分子，DNA和蛋白質(zhì)合成的抑制劑，激素，細(xì)胞生長因子，腫瘤壞死因子（TNF），抗Fas/Apo-1/CD95抗體等三、細(xì)胞凋亡的分子調(diào)控機(jī)理

●線蟲(C.elegans)凋亡研究發(fā)現(xiàn)ced3,ced4基因促進(jìn)細(xì)胞凋亡，ced9基因阻止ced3/ced4的激活，抑制細(xì)胞凋亡。Ced3哺乳類同源物是ICE(Interleukin-1-convertingenzyme)，即Caspase1 ●Caspase家族與凋亡 ●Bcl-2家族、線粒體與細(xì)胞凋亡●細(xì)胞凋亡的分子機(jī)理Caspase家族與凋亡

◆Caspase家族·Caspase活性位點(diǎn)是半胱氨酸(Cysteine)，裂解靶蛋白位點(diǎn)是天冬氨酸殘基后的肽鍵，因此稱為Cysteineasparticacicspecificprotease，即Caspase◆Caspase活化◆胞外信號分子誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡途徑Caspase活化

Caspase自身以非活化的Procaspase存在，其激活依賴于其他的Caspase在它的天冬氨酸位點(diǎn)裂解活化或自身活化胞外信號分子誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡途徑·凋亡信號通路當(dāng)細(xì)胞接受凋亡信號分子(Fas,TNF等)后，凋亡細(xì)胞表面信號分子受體相互聚集并與細(xì)胞內(nèi)的銜接蛋白(Adaptorprotein)結(jié)合，這些銜接蛋白又募集Procaspases聚集在受體部位，Procaspase相互活化并產(chǎn)生級聯(lián)反應(yīng)，使細(xì)胞凋亡，下游Caspases活化后，作用底物：裂解核纖層蛋白，導(dǎo)致細(xì)胞核形成凋亡小體；裂解DNase結(jié)合蛋白，使DNase釋放，降解DNA形成DNALadder;裂解參與細(xì)胞連接或附著的骨架和其他蛋白，使凋亡細(xì)胞皺縮、脫落，便于細(xì)胞吞噬；導(dǎo)致膜脂PS重排，便于吞噬細(xì)胞識別并吞噬。Bcl-2家族、線粒體與細(xì)胞凋亡◆Bcl-2是一種原癌基因，是ced-9在哺乳類中的同源物，能抑制細(xì)胞凋亡；與線粒體及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜相結(jié)合；Bcl-2蛋白的羧基末端有一穿膜的結(jié)構(gòu)域；Bcl-2家族成員的基因中，常常含有三個(gè)保守的Bcl-2同源區(qū)，即BH1，BH2和BH3 ◆Bcl-2、線粒體與細(xì)胞凋亡 ◆哺乳動物細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的Apaf2即是CytCBcl-2、線粒體與細(xì)胞凋亡◆當(dāng)Caspase8活化后，它一方面作用于Procaspase3，另一方面使Bid裂解成2個(gè)片段，其中含BH3結(jié)構(gòu)域的C-端片段被運(yùn)送到線粒體，與Bcl-2/Bax的BH3結(jié)構(gòu)域形成復(fù)合物，導(dǎo)致細(xì)胞色素C釋放。CytC與胞質(zhì)中Ced4同源物Apaf-1(凋亡蛋白酶活化因子apoptosisproteaseactivatingfactor)結(jié)合并活化Apaf-1，活化的Apaf-1再活化Procaspase9，最后引起細(xì)胞凋亡

a正常T細(xì)胞雜交瘤細(xì)胞b凋亡細(xì)胞(掃描電鏡)c凋亡細(xì)胞(透射電鏡)caspase超家族成員及其相應(yīng)底物BCL-2家族成員壞死細(xì)胞凋亡細(xì)胞細(xì)胞色素c誘導(dǎo)的凋亡細(xì)胞DNA電泳圖1．細(xì)胞色素c誘導(dǎo)0h2．細(xì)胞色素c誘導(dǎo)1h3．細(xì)胞色素c誘導(dǎo)2h4．細(xì)胞色素c誘導(dǎo)3h5．細(xì)胞色素c誘導(dǎo)4h6．陰性對照7．Marker（自趙允、翟中和）第三節(jié)癌細(xì)胞●癌細(xì)胞的基本特征●致癌因素●癌癥產(chǎn)生是基因突變積累和自然選擇的結(jié)果●癌癥能治療嗎？一．癌細(xì)胞的基本特征

癌癥是一種嚴(yán)重威脅人類生命安全的疾病。動物體內(nèi)細(xì)胞分裂調(diào)節(jié)失控而無限增殖的細(xì)胞稱為腫瘤細(xì)胞(tumorcell)。具有轉(zhuǎn)移能力的腫瘤稱為惡性腫瘤（malignancy）。上皮組織的惡性腫瘤稱癌。

●基本生物學(xué)特征●體外培養(yǎng)的惡性轉(zhuǎn)化細(xì)胞的特征基本生物學(xué)特征◆細(xì)胞生長與分裂失去控制，具有無限增殖能力，成為“永生”細(xì)胞。◆具有擴(kuò)散性·癌細(xì)胞的細(xì)胞間粘著性下降，具有侵潤性和擴(kuò)散性，這是癌細(xì)胞的基本特征。 ·在分化程度上癌細(xì)胞低于良性腫瘤細(xì)胞，且失去了許多原組織細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能◆細(xì)胞間相互作用改變（識別改變；表達(dá)水解酶類；產(chǎn)生新的表面抗原）◆蛋白表達(dá)譜系或蛋白活性改變（胚胎細(xì)胞蛋白、端粒酶活性升高）◆mRNA轉(zhuǎn)錄譜系的改變（少數(shù)基因表達(dá)不同；突變位點(diǎn)不同，表型多變）體外培養(yǎng)的惡性轉(zhuǎn)化細(xì)胞的特征

◆惡性轉(zhuǎn)化細(xì)胞同癌細(xì)胞一樣具有無限增殖的潛能◆在體外培養(yǎng)時(shí)貼壁性下降◆失去接觸抑制◆培養(yǎng)時(shí)對血清依賴性降低◆當(dāng)將惡性轉(zhuǎn)化細(xì)胞注入易感動物體內(nèi)，往往會形成腫瘤二、致癌因素●多種理化因子致癌 ●DNA腫瘤病毒與RNA腫瘤病毒致癌

三、癌癥產(chǎn)生是基因突變積累和自然選擇的結(jié)果

癌癥主要是體細(xì)胞突變產(chǎn)生的遺傳病，涉及到兩大類與細(xì)胞增殖相關(guān)的基因的突變?！翊龠M(jìn)細(xì)胞增殖相關(guān)基因突變：原癌基因(proto-oncogene)突變形成癌基因(oncogene)●抑制細(xì)胞增殖相關(guān)基因突變：腫瘤抑制基因(tumor-suppressorgene)●細(xì)胞癌變是基因突變累積和自然選擇的結(jié)果，所以患者多為年長者?！裨┗蚺c腫瘤抑制基因產(chǎn)物協(xié)調(diào)作用，避免細(xì)胞癌變◆原癌基因存在于細(xì)胞基因組中(c-onc)，是控制細(xì)胞生長和分裂的基因。

編碼多種類型的蛋白質(zhì)---細(xì)胞生長和分裂的調(diào)控因子。癌基因是控制細(xì)胞生長和分裂的原癌基因的一種突變形式。

◆這類基因功能獲得性突變，其產(chǎn)物量增加或活性升