突變類型：簡(jiǎn)單的插入或缺失系統(tǒng)的缺失、插入或成串堿基的置換單個(gè)堿基的置換第七章

定點(diǎn)誘變site-directedmutagenesisofclonedDNA第一節(jié)

寡核苷酸介導(dǎo)的誘變oligonucleotide-mediatedmutagenesis70年代初

×174DNA(ssDNA5386bp),當(dāng)用帶琥珀突變的ssDNA與變性的野生型DNA片段一起轉(zhuǎn)染細(xì)菌時(shí),觀察到“標(biāo)記獲救”現(xiàn)象即產(chǎn)生帶野生型基因組的噬菌體，原因是野生型DNA片段與突變體的相應(yīng)序列退火，形成錯(cuò)配的異源雙鏈體，后者可被宿主編碼的錯(cuò)配修復(fù)系統(tǒng)轉(zhuǎn)變?yōu)槿L(zhǎng)的野生型基因組。由此可利用突變的DNA片段將突變引入到野生型DNA中。dut-/ung-

合成的DNA含有尿嘧啶，M13噬菌體DNA中將含有20-30個(gè)尿嘧啶堿基E.coliCJ236dut,ung,thi,relA;pCJ105(Cmr)pCJ105isaF’plasmidVectorM13mp18pTZ18U/19U2860bpUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUInserttargetDNA轉(zhuǎn)化E.coliCJ236M13K07感染IsolatephagemidssDNA與突變寡核苷酸退火T4orT7DNApolymerase/ligase轉(zhuǎn)化MV1190dut+/ung+2．原理(1)DNApolymeraseT4,T7,Klenow(可能會(huì)替換引物)65%11/13(84.6%)36%突變率(2)ligase3U/13l可有可無，有則效率高

(3)T4gene32protein

提高含二級(jí)結(jié)構(gòu)的ssDNA的突變率3.酶和primerA.單核苷酸置換插入or缺失5’端完全配對(duì)，使得上游(引物)起始的DNA合成不容易將誘變寡核苷酸取代，約需8-10bp3’端所形成的雜交體足以引導(dǎo)DNA合成。如果錯(cuò)配核苷酸太靠近3’端，3’端將不能形成穩(wěn)定的雜交體，易被外切活性降解。所以3’端需有7-9bp完全配對(duì);為便于篩選，應(yīng)選用可形成穩(wěn)定雜交體而長(zhǎng)度最短的誘變寡核苷酸。一般17-19bp,錯(cuò)配在中央，使得完全配對(duì)的雜交體與錯(cuò)配雜交體之間的熱穩(wěn)定性差異足夠大。B.多處缺失或變換2個(gè)bp以上的oligo

兩側(cè)需12-15bp

側(cè)翼雙鏈區(qū)的Tm應(yīng)約為35-40℃Tm=4(G+C)+2(A+T)=36℃

(3each)突變區(qū)域大,效率越低(兩側(cè)形成穩(wěn)定雜交體的能力是突變區(qū)長(zhǎng)度的函數(shù)→

越低）二、AlteredSites?IIinvitroMutagenesisSystem三、TransformerSite-Directedmutagenesis四

、

PCR定點(diǎn)誘變1．同源重組法2．DpnI法3.重疊延伸Overlapextension(二)PCR定點(diǎn)誘變1．同源重組法2．DpnI法3.重疊延伸Overlapextension(三)SOE重疊延伸剪接術(shù)Splicingbyoverlapextension2.BAL31的消化主要活性為3’外切核酸酶活性，可從線性DNA兩條鏈的3’端去掉除單核苷酸，還是一個(gè)內(nèi)切核酸(單鏈，nick,gap)

依賴Ca++