微生物的遺傳和變異第三節(jié)第一頁，共六十四頁，2022年，8月28日第二節(jié)細菌基因轉移的方式細菌的三種水平基因轉移形式接合轉導轉化p.237第二頁，共六十四頁，2022年，8月28日接合(conjugation)：細胞與細胞的直接接觸（由F因子介導）轉導(transduction)：由噬菌體作為載體介導轉化(transformation)：游離DNA分子+感受態(tài)細胞第三頁，共六十四頁，2022年，8月28日一細菌的接合作用(conjugation)接合作用：通過細胞與細胞的直接接觸而產(chǎn)生的遺傳信息轉移和重組過程第四頁，共六十四頁，2022年，8月28日證實接合過程需要細胞間的直接接觸的“U”型管實驗（BernardDavis，1950）第五頁，共六十四頁，2022年，8月28日2.機制接合作用是由一種被稱為F因子的質粒介導F因子的分子量通常為5×107Da

，上面有編碼細菌產(chǎn)生性菌毛（sexpili）及控制接合過程進行的20多個基因。含有F因子的細胞：“雄性”菌株（F+），其細胞表面有性菌毛

不含F(xiàn)因子的細胞：“雌性”菌株（F-），細胞表面沒有性菌毛第六頁，共六十四頁，2022年，8月28日第七頁，共六十四頁，2022年，8月28日F因子的四種細胞形式a）F-菌株，不含F(xiàn)因子，沒有性菌毛，但可以通過接合作用接收F因子而變成雄性菌株（F+）；b）F+菌株，F(xiàn)因子獨立存在，細胞表面有性菌毛。c）Hfr菌株，F(xiàn)因子插入到染色體DNA上，細胞表面有性菌毛。d）F′菌株，Hfr菌株內(nèi)的F因子因不正常切割而脫離染色體時，形成游離的但攜帶一小段染色體基因的F因子，特稱為F′因子。細胞表面同樣有性菌毛。第八頁，共六十四頁，2022年，8月28日第九頁，共六十四頁，2022年，8月28日1）F+×F-雜交雜交的結果：供體細胞和受體細胞均成為F+細胞F+菌株的F因子向F-細胞轉移，但含F(xiàn)因子的宿主細胞的染色體DNA一般不被轉移。第十頁，共六十四頁，2022年，8月28日第十一頁，共六十四頁，2022年，8月28日Hfr菌株的F因子插入到染色體DNA上，因此只要發(fā)生接合轉移轉移過程，就可以把部分甚至全部細菌染色體傳遞給F-細胞并發(fā)生重組，由此而得名為高頻重組菌株（Highfrequencyofrecombination）。2）Hfr×F-雜交Hfr菌株仍然保持著F+細胞的特征，具有F性菌毛，并象F+一樣與F-細胞進行接合。所不同的是在發(fā)生轉移時，由于F因子除先導區(qū)(leadingregion)以外，其余絕大部分是處于轉移染色體的末端，因此F因子的轉移是先導區(qū)結合著染色體DNA向受體細胞轉移的。由于轉移過程常被中斷，因此F因子不易轉入受體細胞中，故Hfr×F-雜交后的受體細胞(或接合子)大多數(shù)仍然是F-。第十二頁，共六十四頁，2022年，8月28日染色體上越靠近F因子的先導區(qū)的基因，進入的機會就越多，在F-中出現(xiàn)重組子的的時間就越早，頻率也高。F因子不易轉入受體細胞中，故Hfr×F-雜交后的受體細胞（或稱接合子）大多數(shù)仍然是F-。第十三頁，共六十四頁，2022年，8月28日3）F′×F-雜交Hfr菌株內(nèi)的F因子因不正常切割而脫離染色體時，形成游離的但攜帶一小段染色體基因的F因子，特稱為F′因子。F′×F-與F+×F-的不同：給體的部分染色體基因隨F′一起轉入受體細胞a）與染色體發(fā)生重組；b）繼續(xù)存在于F′因子上，形成一種部分二倍體；細胞基因的這種轉移過程又常稱為性導（sexduction）、F因子轉導（F-duction），或F因子媒介的轉導（F-mediatedtransduction）。第十四頁，共六十四頁，2022年，8月28日二細菌的轉導（transduction）由噬菌體介導的細菌細胞間進行遺傳交換的一種方式：一個細胞的DNA通過病毒載體的感染轉移到另一個細胞中能將一個細菌宿主的部分染色體或質粒DNA帶到另一個細菌的噬菌體稱為轉導噬菌體細菌轉導的二種類型：普遍性轉導局限性轉導第十五頁，共六十四頁，2022年，8月28日1普遍性轉導（generalizedtransduction）噬菌體可以轉導供體細菌染色體的任何部分到受體細胞中的轉導過程1951年，JoshuaLederberg和NortonZinder為了證實大腸桿菌以外的其它菌種是否也存在接合作用，用二株具不同的多重營養(yǎng)缺陷型的鼠傷寒沙門氏菌進行類似的實驗：用“U”型管進行同樣的實驗時，在給體和受體細胞不接觸的情況下，同樣出現(xiàn)原養(yǎng)型細菌！第十六頁，共六十四頁，2022年，8月28日沙門氏菌LT22A是攜帶P22噬菌體的溶源性細菌另一株是非溶源性細菌一個表面看起來的常規(guī)研究卻導致一個驚奇和十分重要發(fā)現(xiàn)的重要例證！基因的傳遞很可能是由可透過“U”型管濾板的P22噬菌體介導的（普遍性轉導這一重要的基因轉移途徑的發(fā)現(xiàn)）第十七頁，共六十四頁，2022年，8月28日普遍性轉導過程第十八頁，共六十四頁，2022年，8月28日2局限性轉導（specializedtransduction）把供體菌的少數(shù)特定基因轉移到受體菌中的過程第十九頁，共六十四頁，2022年，8月28日溫和噬菌體感染整合到細菌染色體的特定位點上宿主細胞發(fā)生溶源化溶源菌因誘導而發(fā)生裂解時，在前噬菌體二側的少數(shù)宿主基因因偶爾發(fā)生的不正常切割而連在噬菌體DNA上部分缺陷的溫和噬菌體把供體菌的少數(shù)特定基因轉移到受體菌中的過程第二十頁，共六十四頁，2022年，8月28日溫和噬菌體λ裂解時的不正常切割：包含gal或bio基因（幾率一般僅有10-6）缺陷噬菌體在宿主細胞內(nèi)能夠象正常的λDNA分子一樣進行復制、包裝，提供所需要的裂解功能，形成轉導顆粒。但沒有正常噬菌體的溶源性和增殖能力，感染受體細胞后，通過DNA整合進宿主染色體而形成穩(wěn)定的轉導子。第二十一頁，共六十四頁，2022年，8月28日3局限性轉導與普遍性轉導的主要區(qū)別：a）普遍性轉導是誤包；局限性轉導是誤切。b）局限性轉導顆粒攜帶特定的染色體片段并將固定的個別基因導入受體，故稱為局限性轉導。而普遍性轉導攜帶的宿主基因具有隨機性，包裝的可能全部是宿主菌的基因。第二十二頁，共六十四頁，2022年，8月28日三細菌的遺傳轉化（genetictransformation）定義：游離DNA分子(質粒和染色體DNA)被自然或人工感受態(tài)細胞攝取，并得到表達的基因轉移過程。第二十三頁，共六十四頁，2022年，8月28日1、轉化1928年，Griffith發(fā)現(xiàn)肺炎鏈球菌（Streptococcuspneumoniae）的轉化現(xiàn)象目前已知有二十多個種的細菌具有自然轉化的能力進行轉化，需要二方面必要的條件：受體細胞處于感受態(tài)：最容易接受外源DNA的一種生理狀態(tài)。轉化因子：外源游離dsDNA分子第二十四頁，共六十四頁，2022年，8月28日

以革蘭氏陽性的肺炎鏈球菌為材料，其轉化過程大體是：1、雙鏈DNA片段與感受態(tài)受體菌的細胞表面特定位點結合。2、在位點上的DNA發(fā)生酶促分解，形成平均分子量為（4~5)x106D的DNA片段。3、DNA雙鏈中的一條單鏈逐步降解，同時，另一條單鏈逐步進入細胞。第二十五頁，共六十四頁，2022年，8月28日4、轉化DNA單鏈與受體菌染色體組上的同源區(qū)段配對，接著受體染色體組的相應單鏈片段被切除，并被外來的單鏈DNA所交換和取代，于是形成了雜種DNA區(qū)段。5、受體菌染色體組進行復制，雜合區(qū)段分離成兩個，其中之一類似供體菌，另一類似受體菌。當細胞分裂后，此染色體分離形成了一個轉化子。第二十六頁，共六十四頁，2022年，8月28日轉化全過程第二十七頁，共六十四頁，2022年，8月28日轉化整合過程第二十八頁，共六十四頁，2022年，8月28日轉化過程的特點：a）對核酸酶敏感；c）轉化是否成功及轉化效率的高低主要取決于轉化（DNA）給體菌株和轉化受體菌株之間的親源關系；d）通常情況下質粒的自然轉化效率低b）不需要活的DNA供體細胞；第二十九頁，共六十四頁，2022年，8月28日人工轉化用CaCl2處理細胞，電穿孔等是常用的人工轉化手段。在自然轉化的基礎上發(fā)展和建立的一項細菌基因重組手段，是基因工程的奠基石和基礎技術,該過程與細菌自身的遺傳控制無關.用多種不同的技術處理受體細胞，使其人為地處于一種可以攝取外源DNA的“人工感受態(tài)”。第三十頁，共六十四頁，2022年，8月28日接合(conjugation)：細胞與細胞的直接接觸（由F因子介導）轉導(transduction)：由噬菌體介導自然遺傳轉化(naturalgenetictransformation)：游離DNA分子+感受態(tài)細胞第三十一頁，共六十四頁，2022年，8月28日第三節(jié)基因克隆及重組DNA技術利用DNA體外重組技術，將一個特定的基因或DNA序列插入一個載體DNA分子上，導入宿主細胞內(nèi)，使其擴增和表達。基因克隆第三十二頁，共六十四頁，2022年，8月28日是指對遺傳信息的分子操作和施工，即把分離到的或合成的基因經(jīng)過改造，插入載體中，導入宿主細胞內(nèi)，使其擴增和表達，從而獲得大量基因產(chǎn)物，或者令生物表現(xiàn)出新的性狀?；蚬こ蹋╣eneticengineering）或重組DNA技術(recombinantDNAtechnology)二十世紀生物科學具有劃時代意義的巨大事件，推動了生物科學的迅猛發(fā)展，并帶動了生物技術產(chǎn)業(yè)的興起。第三十三頁，共六十四頁，2022年，8月28日微生物在基因工程的興起和發(fā)展過程中起著不可替代的作用！“微生物與基因工程”第三十四頁，共六十四頁，2022年，8月28日一、基因工程的基本過程1.基因分離：a）分別提取供體DNA和載體DNA2.體外重組b）用專一性很強的限制性核酸內(nèi)切酶分別切割供體和載體DNA在DNA連接酶的作用下使具有相同粘性末端的供體DNA片段和載體連接，成為重組載體。3.重組載體的傳遞與篩選用人工轉化的方法將重組載體導入受體細胞中，并通過一定的篩選標記篩選得到含有目的外源片段的重組子.4.在特定的宿主中表達,得到基因工程產(chǎn)品第三十五頁，共六十四頁，2022年，8月28日第三十六頁，共六十四頁，2022年，8月28日大腸桿菌生產(chǎn)胰島素第三十七頁，共六十四頁，2022年，8月28日假單胞菌生產(chǎn)毒素蛋白第三十八頁，共六十四頁，2022年，8月28日二、基因工程的發(fā)展歷史對基因工程的建立與發(fā)展具有重要意義的幾項關鍵技術：DNA的特異切割DNA的分子克?。ㄈ斯まD化方法的建立）DNA的快速測序聚合酶鏈式反應（PCR）（DNA的體外擴增）DNA合成技術DNA的定點誘變技術第三十九頁，共六十四頁，2022年，8月28日基因工程工具酶基因工程所用到的絕大多數(shù)工具酶都是從不同微生物中分離和純化而獲得的一、限制性核酸內(nèi)切酶（restrictionendonuclease）能識別雙鏈DNA分子的特定序列，并在識別位點或其附近切割DNA的一類內(nèi)切酶。簡稱為限制性酶（restritionenzyme）。在細菌細胞內(nèi)限制性酶與DNA甲基化酶共同構成細菌的限制–修飾系統(tǒng)，利用限制酶降解進入細胞內(nèi)的外源DNA，同時用甲基化酶修飾細菌本身DNA，以避免被酶降解。第四十頁，共六十四頁，2022年，8月28日

限制性內(nèi)切酶I型：單一多功能(限制-修飾)的酶，不是特異性的切割，所以用處不大。III型：雙功能的酶，特異性的切割，用處不大。

II型：分開的核酸內(nèi)切酶和甲基化酶(EcoRI,MEcoRI)。特異性的切割，十分有用。識別序列通常由4-8個堿基對組成，具有回文結構。EcoRI:EscherichiacoliRY13,識別序列:GAATTCCTTAAGBamHI:BacillusamyloliquefaciensH,識別序列:GGATCCCCTAGG第四十一頁，共六十四頁，2022年，8月28日限制性內(nèi)切酶的剪切方式第四十二頁，共六十四頁，2022年，8月28日常用限制性內(nèi)切酶第四十三頁，共六十四頁，2022年，8月28日

酶連

DNA連接酶(1967,許多實驗室同時發(fā)現(xiàn))的發(fā)現(xiàn)和應用對于重組DNA技術的創(chuàng)立和發(fā)展也具有頭等重要的意義。將兩段DNA拼接起來的酶叫連接酶，目前已知有三種方法可以用來在體外連接DNA片段：第一種：粘性末端連接；第二種：平端連接；第三種：先在DNA末端加上化學合成的銜接物或接頭，使之形成粘性末端，再進行連接。

T4噬菌體DNA連接酶：它催化DNA的5’磷酸基與3’羥基之間形成磷酸二酯鍵（Weiss等，1968）第四十四頁，共六十四頁，2022年，8月28日轉化重組質粒DNA進入受體細胞，并在受體細胞內(nèi)穩(wěn)定維持和表達的過程。感受態(tài)細胞的轉化電穿孔轉化第四十五頁，共六十四頁，2022年，8月28日抗生素篩選第四十六頁，共六十四頁，2022年，8月28日

能夠把脫氧核糖核苷酸連續(xù)地加到雙鏈DNA分子引物鏈的3’-OH末端,催化核苷酸的聚合作用,而不發(fā)生從引物模板上解離的情況.

常見的DNA聚合酶：最常用的依賴于DNA的DNA聚合酶是大腸桿菌DNA聚合酶I（全酶）（DNA聚合酶；5’-3’外切核酸酶；3’-5’外切核酸酶）;大腸桿菌DNA聚合酶I的Klenow片段，（沒有5’-3’外切核酸酶的活性）；TaqDNA聚合酶(Thermusaquaticus;1976;Chien),能耐高溫；pfuDNA聚合酶(Pyrococcusfuriosus),高保真性。DNA聚合酶第四十七頁，共六十四頁，2022年，8月28日DNA擴增PCR反應第四十八頁，共六十四頁，2022年，8月28日PCR的基本反應體系

（以DNA為模板的反應：

10×緩沖液10l

4種dNTP混合物

各200mol/L

引物

各10～100pmol

模板DNA

0.1～2g

TaqDNA聚合酶

2.5u

Mg2+

1.5mmol/L

加雙或三蒸水至100l

第四十九頁，共六十四頁，2022年，8月28日TaqDNA聚合酶來自水生棲熱菌Thermusaquaticus良好的耐熱性Mg2+依賴性無校正功能PfuDNA聚合酶來自Pyrococcusfuriosus(激烈火球菌“Pfu”)糾錯功能，高保真性第五十頁，共六十四頁，2022年，8月28日基因工程的常用載體：質粒載體λ噬菌體載體柯斯質粒載體M13噬菌體載體真核細胞的克隆載體人工染色體噬菌粒載體第五十一頁，共六十四頁，2022年，8月28日一、質?？寺≥d體a）低分子量有利于DNA的分離和操作；特點：b）具有較高拷貝數(shù)；c）易于導入細胞；d）具有安全性；質粒載體克隆外源DNA片段的大小一般不超過15Kb第五十二頁，共六十四頁，2022年，8月28日第五十三頁，共六十四頁，2022年，8月28日第五十四頁，共六十四頁，2022年，8月28日二、λ噬菌體克隆載體將野生型λ噬菌體DNA進行改造后建成，主要是去掉噬菌體DNA上過多的常用限制酶的酶切位點，及對非必要基因區(qū)域進行改造。特點：1）它的分子遺傳學背景十分清楚2）λ噬菌體載體的容量較大。一般質粒載體只能容納10多個kb。而λ噬菌體載體卻能容納大約23kb的外源DNA片段。3）具有較高的感染效率。其感染宿主細胞的效率幾乎可達100％，而質粒DNA的轉化率卻只有0.1％。4）和質粒相比，λ噬菌體具有更為狹窄的寄主范圍，因此更加安全第五十五頁，共六十四頁，2022年，8月28日經(jīng)過體外基因操作和包裝后形成重組噬菌體，可以通過正常的感染途徑進入宿主細胞；重組噬菌體DNA也可不經(jīng)過體外包裝而直接通過轉染（轉化）方式進入宿主細胞；第五十六頁，共六十四頁，2022年，8月28日質粒和噬菌體載體都可用于構建基因文庫；但后者更有優(yōu)勢：容納的外源DNA片段較大；以感染途徑進入宿主細胞的效率比轉化高；第五十七頁，共六十四頁，2022年，8月28日三、柯斯質粒載體柯斯質粒載體（cosmidvector），又稱粘粒，是由λ噬菌體的粘性末端和質粒構建而成。Cosmid(cossite-carryingplasmid)帶有粘性末端位點(cos)的質粒第五十八頁，共六十四頁，2022年，8月28日特點：1）具有λ噬菌體的特性：在克隆了外源片段后可在體外被包裝成噬菌體顆粒，高效地感染對λ噬菌體敏感的大腸桿菌細胞。進入寄主的柯斯質粒DNA分子，按照λ噬菌體DNA的方式環(huán)化，但無法按噬菌體的方式生活，更無法形成子代噬菌體顆粒。2）具有質粒載體的特性：在寄主細胞內(nèi)如質粒一樣進行復制，攜帶有抗性基因和克隆位點，并具氯霉素擴增效應。3）具有高容量的克隆能力：柯斯質粒本身一般只有5～7kb左右，而它克隆外源DNA片段的極限值竟高達45kb.柯斯質粒用于克隆大片段的DNA分子特別有效，而這種特性對于研究高等生物的基因組十分重要。第五十九頁，共六十四頁，2022年，8月28日四、微生物作為克隆載體的宿主一、宿主的基本要求與性質①能夠高效吸收外源DNA