概論第一頁，共97頁?；蛑亟M：不同的DNA分子間發(fā)生共價連接形成重組DNA分子。重組DNA質(zhì)粒DNA基因片段第二頁，共97頁。重組DNA技術(shù)發(fā)展史第三頁，共97頁。pSC101EcoRIBoyer和Cohen的實驗Boyer和Cohen的實驗pR6-5大腸桿菌第四頁，共97頁。pSC101pR6-5抗四環(huán)素抗卡那霉素EcoRI抗卡那霉素基因DNA連接酶重組DNA分子第五頁，共97頁。培養(yǎng)平皿四環(huán)素平板卡那霉素基因四環(huán)素\卡那霉素基因大腸桿菌第六頁，共97頁。人體生長激素釋放激素(SS)抑制和調(diào)節(jié)多種激素的作用從動物腦中提取:5mg---50萬只羊腦基因工程9升大腸桿菌培養(yǎng)液第七頁，共97頁。

SS基因基因載體重組體分切接轉(zhuǎn)篩表SS第八頁，共97頁。第一節(jié)

DNA的重組

DNARecombination

第九頁，共97頁。DNA重組接合作用(conjugation)轉(zhuǎn)化作用(transformation)轉(zhuǎn)導(dǎo)作用(transduction)轉(zhuǎn)座(transposition)同源重組(homologousrecombination)位點特異的重組(site-specificrecombination)第十頁，共97頁。發(fā)生在同源序列間的重組稱為同源重組(homologousrecombination)，又稱基本重組。是最基本的DNA重組方式，通過鏈的斷裂和再連接，在兩個DNA分子同源序列間進行單鏈或雙鏈片段的交換。一、同源重組第十一頁，共97頁。二、細菌的基因轉(zhuǎn)移與重組（一）接合作用當(dāng)細胞與細胞、或細菌通過菌毛相互接觸時，質(zhì)粒DNA從一個細胞（細菌）轉(zhuǎn)移至另一細胞（細菌）的DNA轉(zhuǎn)移稱為接合作用(conjugation)。第十二頁，共97頁?？山雍腺|(zhì)粒如F因子(Ffactor)質(zhì)?！毦旧w外的小型環(huán)狀雙鏈DNA分子第十三頁，共97頁。（二）轉(zhuǎn)化作用通過自動獲取或人為地供給外源DNA，使細胞或培養(yǎng)的受體細胞獲得新的遺傳表型，稱為轉(zhuǎn)化作用(transformation)。第十四頁，共97頁。例：溶菌時，裂解的DNA片段被另一細菌攝取。第十五頁，共97頁。第十六頁，共97頁。（三）轉(zhuǎn)導(dǎo)作用當(dāng)病毒從被感染的（供體）細胞釋放出來、再次感染另一（供體）細胞時，發(fā)生在供體細胞與受體細胞之間的DNA轉(zhuǎn)移及基因重組即為轉(zhuǎn)導(dǎo)作用(transduction)。第十七頁，共97頁。λ噬菌體的生活史溶菌生長途徑(lysispathway)溶源菌生長途徑(lysogenicpathway)例第十八頁，共97頁。第十九頁，共97頁。第二節(jié)

重組DNA技術(shù)DNARecombinationTechnique第二十頁，共97頁。相關(guān)概念DNA克隆工具酶目的基因基因載體基本原理重組DNA技術(shù)與醫(yī)學(xué)的關(guān)系本節(jié)主要內(nèi)容第二十一頁，共97頁。一、重組DNA技術(shù)相關(guān)概念克隆(clone)來自同一始祖的相同副本或拷貝的集合。獲取同一拷貝的過程稱為克隆化(cloning)，即無性繁殖。（一）DNA克隆第二十二頁，共97頁。技術(shù)水平：分子克隆(molecularclone)即DNA克隆

細胞克隆個體克?。▌游锘蛑参铮┑诙?，共97頁。DNA克隆應(yīng)用酶學(xué)的方法，在體外將各種來源的遺傳物質(zhì)（同源的或異源的、原核的或真核的、天然的或人工的DNA）與載體DNA接合成一具有自我復(fù)制能力的DNA分子——復(fù)制子(replicon)，繼而通過轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染宿主細胞，篩選出含有目的基因的轉(zhuǎn)化子細胞，再進行擴增提取獲得大量同一DNA分子，也稱基因克隆或重組DNA(recombinantDNA)。第二十四頁，共97頁。生物技術(shù)工程:

基因工程、蛋白質(zhì)工程、酶工程、細胞工程等目的①分離獲得某一感興趣的基因或DNA②獲得感興趣基因的表達產(chǎn)物（蛋白質(zhì)）基因工程(geneticengineering)

——實現(xiàn)基因克隆所用的方法及相關(guān)的工作稱基因工程，又稱重組DNA工藝學(xué)。第二十五頁，共97頁。（二）工具酶限制性核酸內(nèi)切酶DNA聚合酶Ⅰ逆轉(zhuǎn)錄酶T4DNA連接酶堿性磷酸酶末端轉(zhuǎn)移酶

TaqDNA聚合酶第二十六頁，共97頁。重組DNA技術(shù)中常用的工具酶工具酶功能限制性核酸內(nèi)切酶識別特異序列，切割DNADNA連接酶催化DNA中相鄰的5′磷酸基和3′羥基末端之間形成磷酸二酯鍵，使DNA切口封合或使兩個DNA分子或片段連接DNA聚合酶Ⅰ合成雙鏈cDNA分子或片段連接缺口平移制作高比活探針DNA序列分析填補3′末端Klenow片段又名DNA聚合酶I大片段，具有完整DNA聚合酶I的53聚合、35外切活性，而無53外切活性。常用于cDNA第二鏈合成，雙鏈DNA3末端標記等反轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA替代DNA聚合酶I進行填補，標記或DNA序列分析多聚核苷酸激酶催化多聚核苷酸5′羥基末端磷酸化，或標記探針末端轉(zhuǎn)移酶在3′羥基末端進行同質(zhì)多聚物加尾堿性磷酸酶切除末端磷酸基第二十七頁，共97頁。限制性核酸內(nèi)切酶定義限制性核酸內(nèi)切酶(restrictionendonuclease,RE)是識別DNA的特異序列,并在識別位點或其周圍切割雙鏈DNA的一類內(nèi)切酶。GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCCG+BamHⅠ第二十八頁，共97頁。作用與甲基化酶共同構(gòu)成細菌的限制修飾系統(tǒng)，限制外源DNA，保護自身DNA。分類Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ（基因工程技術(shù)中常用Ⅱ型）第二十九頁，共97頁。第一個字母取自產(chǎn)生該酶的細菌屬名，用大寫；第二、第三個字母是該細菌的種名，用小寫；第四個字母代表株；用羅馬數(shù)字表示發(fā)現(xiàn)的先后次序。命名HindⅢ屬

系

株序Haemophilusinfluenzaed株流感嗜血桿菌d株的第三種酶第三十頁，共97頁。Ⅱ類酶識別序列特點——

回文結(jié)構(gòu)(palindrome)

切口：平端切口、粘端切口GGATCCCCTAGG第三十一頁，共97頁。BamHⅠGTCCAGGCCTAGGATCCG+GGATCCCCTAGGHindⅡGTCGACCAGCTGGACCTG+平端切口粘端切口第三十二頁，共97頁。同功異源酶來源不同的限制酶，但能識別和切割同一位點，這些酶稱同功異源酶。GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCCG+BamHⅠGGATCCCCTAGGGCCTAGGATCCG+BstⅠ第三十三頁，共97頁。有些限制性內(nèi)切酶雖然識別序列不完全相同，但切割DNA后，產(chǎn)生相同的粘性末端，稱為同尾酶。這兩個相同的粘性末端稱為配伍未端(compatibleend)。BamHⅠBglⅡGGATCCCCTAGGAGATCTTCTAGAGCCTAGGATCCG++ATCTAG

GATCTA同尾酶第三十四頁，共97頁。（三）目的基因目的基因需要克隆的DNA片段。編碼某種蛋白質(zhì)研究某基因結(jié)構(gòu)和功能的關(guān)系研究某基因與疾病的關(guān)系第三十五頁，共97頁。

按照人的愿望設(shè)計和建造非天然的基因表達體系。某功能蛋白宿主細胞基因工程產(chǎn)品重組體目的基因第三十六頁，共97頁。cDNA：

經(jīng)反轉(zhuǎn)錄合成的、與mRNA互補的DNA鏈?；蚪MDNA：

代表一個細胞或生物體整套遺傳信息的所有DNA序列。第三十七頁，共97頁。（四）基因載體定義：為攜帶目的基因，實現(xiàn)其無性繁殖或表達有意義的蛋白質(zhì)所采用的一些DNA分子?？寺≥d體(cloningvector)-----為使插入的外源DNA序列被擴增而特意設(shè)計的載體。表達載體(expressionvector)-----為使插入的外源DNA序列可轉(zhuǎn)錄翻譯成多肽鏈而特意設(shè)計的載體。常用載體

質(zhì)粒DNA、噬菌體DNA、病毒DNA第三十八頁，共97頁。宿主細胞基因載體第三十九頁，共97頁。載體的選擇標準能自主復(fù)制；具有兩個以上的遺傳標記物，便于重組體的篩選和鑒定；有克隆位點（外源DNA插入點）即多個單一酶切位點；分子量小，以容納較大的外源DNA。第四十頁，共97頁。存在于細菌染色體外的小型環(huán)狀DNA分子。

具有自我復(fù)制功能。帶有抗性基因及表型識別等遺傳性標記物。經(jīng)改造后具有多克隆位點。舉例：pBR322質(zhì)粒質(zhì)粒第四十一頁，共97頁。第四十二頁，共97頁。宿主細胞ori第四十三頁，共97頁?？笰mp宿主細菌含Amp培養(yǎng)基第四十四頁，共97頁。多克隆位點+第四十五頁，共97頁。多種酶切口多克隆位點限制性內(nèi)切酶單一酶切口第四十六頁，共97頁。多克隆位點ori復(fù)制起始點遺傳標記Amppolylinker基因載體第四十七頁，共97頁。第四十八頁，共97頁。第四十九頁，共97頁。λ噬菌體DNA改造系統(tǒng)λgt系列（插入型，適用cDNA克隆）EMBL系列（置換型，適用基因組克?。┦删w(phage)

M13噬菌體DNA改造系統(tǒng)（含lacZ基因）M13mp系列pUC系列第五十頁，共97頁。粘性質(zhì)粒(cosmid)第五十一頁，共97頁。酵母人工染色體(yeastartificialchromosome,YAC)細菌人工染色體(bacterialartificialchromosome,BAC)動物病毒DNA改造的載體（如腺病毒，腺病毒相關(guān)病毒，逆轉(zhuǎn)錄病毒）其他第五十二頁，共97頁。二、重組DNA技術(shù)基本原理基本原理目的基因的獲取DNA導(dǎo)入受體菌外源基因與載體的連接克隆載體的選擇和構(gòu)建重組體的篩選克隆基因的表達

第五十三頁，共97頁。以質(zhì)粒為載體的DNA克隆過程第五十四頁，共97頁。（一）目的基因的獲取1.化學(xué)合成法要求：已知目的基因的核苷酸序列或其產(chǎn)物的氨基酸序列。2.基因組DNA文庫(genomicDNAlibrary)3.cDNA文庫(cDNAlibrary)4.聚合酶鏈反應(yīng)(polymerasechainreaction,PCR)（見第22章）第五十五頁，共97頁。*化學(xué)合成法獲取目的基因由已知氨基酸序列推測可能的DNA序列第五十六頁，共97頁。組織或細胞染色體DNA基因片斷克隆載體重組DNA分子含重組分子的轉(zhuǎn)化菌限制性內(nèi)切酶受體菌基因組DNA文庫存在于轉(zhuǎn)化細胞內(nèi)由克隆載體所攜帶的所有基因組DNA的集合*從基因組DNA文庫獲取目的基因第五十七頁，共97頁。第五十八頁，共97頁。cDNA文庫以mRNA為模板，利用反轉(zhuǎn)錄酶合成與mRNA互補的DNA，再復(fù)制成雙鏈cDNA，與適當(dāng)載體連接后轉(zhuǎn)入受體菌，即獲得cDNA文庫。DNAmRNAmRNA反轉(zhuǎn)錄酶cDNA第五十九頁，共97頁。mRNA的提取與純化從mRNA制備cDNA逆轉(zhuǎn)錄酶ＤＮＡ聚合酶mRNAcDNA雜化雙鏈cDNA文庫法第六十頁，共97頁。cDNA基因重組轉(zhuǎn)化核酸探針cDNA文庫第六十一頁，共97頁。第六十二頁，共97頁。聚合酶鏈式反應(yīng)（PCR）第六十三頁，共97頁。目的基因基因載體重組體（二）克隆載體的選擇和構(gòu)建第六十四頁，共97頁。（三）外源基因與載體的連接1.粘性末端連接方式：(1)同一限制酶切位點連接(2)不同限制酶切位點連接配伍末端連接非配伍末端連接第六十五頁，共97頁。BamHⅠ切割反應(yīng)

GGATCCCCTAGGT4

DNA連接酶15oCGATCCGGCCTAG+目的基因用BamHⅠ切割載體DNA用BamHⅠ切割重組體載體自連目的基因自連同一限制酶切位點連接第六十六頁，共97頁。不同限制酶切位點（非配伍末端）的連接EcoRⅠ切割位點BglⅡ切割位點+EcoRⅠ+BglⅡ雙酶切EcoRⅠ+BglⅡ雙酶切T4

DNA連接酶15oC重組體配伍末端的連接情況和同一限制酶切位點連接相似。第六十七頁，共97頁。2.平端連接適用于：限制性內(nèi)切酶切割產(chǎn)生的平端粘端補齊或切平形成的平端第六十八頁，共97頁。目的基因載體限制性內(nèi)切酶限制性內(nèi)切酶T4DNA連接酶15oC重組體載體自連目的基因自連第六十九頁，共97頁。3.同聚物加尾連接在末端轉(zhuǎn)移酶(terminaltransferase)的作用下，在DNA片段末端加上同聚物序列、制造出粘性末端，再進行粘端連接。第七十頁，共97頁。5′3′3′5′載體DNA5′3′3′5′目的基因限制酶或機械剪切限制酶5′3′3′5′5′3′T(T)nT

T(T)nT3′5′5′

3′3′5′5′3′A(A)nA

A(A)nA3′5′λ-核酸外切酶λ-核酸外切酶末端轉(zhuǎn)移酶+dATP末端轉(zhuǎn)移酶+dTTPT(T)nTA(A)nAA(A)nAT(T)nTT4

DNA連接酶15oC重組體第七十一頁，共97頁。4.人工接頭(linker)連接由平端加上新的酶切位點，再用限制酶切除產(chǎn)生粘性末端，而進行粘端連接。

第七十二頁，共97頁。人工接頭及其應(yīng)用CCGAATTCGGGCTTAAGC5′-3′-EcoRⅠEcoRⅠEcoRⅠEcoRⅠ第七十三頁，共97頁。受體菌條件安全宿主菌限制酶和重組酶缺陷處于感受態(tài)(competent)

導(dǎo)入方式轉(zhuǎn)化(transformation)轉(zhuǎn)染(transfection)感染(infection)（四）重組DNA導(dǎo)入受體菌第七十四頁，共97頁。（五）重組體的篩選

1.直接選擇法(1)

抗藥性標記選擇(2)標志補救(markerrescue)(3)分子雜交法原位雜交Southern印跡2.免疫學(xué)方法如免疫化學(xué)方法及酶免檢測分析等第七十五頁，共97頁。(插入失活法)抗藥性標記選擇第七十六頁，共97頁。α互補第七十七頁，共97頁。α互補的檢測第七十八頁，共97頁。原位雜交第七十九頁，共97頁。Southern印跡第八十頁，共97頁。雞的β肌球蛋白的克隆和檢出第八十一頁，共97頁。重組DNA技術(shù)操作過程可形象歸納為小結(jié)分分離目的基因切限制酶切目的基因與載體接拼接重組體轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)入受體菌篩篩選重組體第八十二頁，共97頁。重組DNA技術(shù)操作的主要步驟載體質(zhì)粒噬菌體病毒目的基因（外源基因）基因組DNAcDNA人工合成PCR產(chǎn)物限制酶消化開環(huán)載體DNA目的基因連接酶重組體轉(zhuǎn)化體外包裝，轉(zhuǎn)染帶重組體的宿主篩選表型篩選酶切電泳鑒定菌落原位雜交第八十三頁，共97頁。表達體系的建立表達載體的構(gòu)建受體細胞的建立表達產(chǎn)物的分離純化（六）克隆基因的表達第八十四頁，共97頁。1.原核表達體系（E.coli表達體系最為常用）標準：選擇標志 強啟動子翻譯調(diào)控序列 多接頭克隆位點E.coli表達體系的不足

不宜表達真核基因組DNA不能加工表達的真核蛋白質(zhì)表達的蛋白質(zhì)常形成不溶性包涵體(inclusionbody)

很難表達大量可溶性蛋白第八十五頁，共97頁。大鼠胰島素原cDNA的表達和分泌 第八十六頁，共97頁。第八十七頁，共97頁。優(yōu)點：可表達克隆的cDNA及真核基因組DNA可適當(dāng)修飾表達的蛋白質(zhì)表達產(chǎn)物分區(qū)域積累缺點：操作技術(shù)難、費時、經(jīng)濟轉(zhuǎn)染

——將表達載體導(dǎo)入真核細胞的過程方法：磷酸鈣轉(zhuǎn)染DEAE葡聚糖介導(dǎo)轉(zhuǎn)染電穿孔脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染顯微注射

2.真核表達體系

酵母、昆蟲、乳類動物細胞第八十八頁，共97頁。表達載體pFASTBACI的物理圖譜第八十九頁，共97頁。第九十頁，共97頁。（一）