微生物常規(guī)實(shí)驗(yàn)操作與菌種保藏第一頁，共三十八頁，2022年，8月28日1、實(shí)驗(yàn)器皿的準(zhǔn)備試管、培養(yǎng)皿、三角瓶等玻璃器皿的準(zhǔn)備新的玻璃器皿，一般先用濃度為5%~6%的鹽酸浸泡6hs以上，再用自來水沖洗干凈，最后用蒸餾水沖洗2~3遍。舊的玻璃器皿，只需洗干凈，同樣用蒸餾水沖洗2~3遍即可。洗干凈的玻璃器皿倒置晾干或烘干后備用。包裝、滅菌。第二頁，共三十八頁，2022年，8月28日第三頁，共三十八頁，2022年，8月28日第四頁，共三十八頁，2022年，8月28日第五頁，共三十八頁，2022年，8月28日干熱滅菌原理：利用高溫使微生物細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)凝固變性而達(dá)到滅菌的目的。所需溫度（160-170℃）一般165℃，時(shí)間2小時(shí)。注：干熱滅菌溫度不能超過180℃，否則包器皿的紙或棉塞會燒焦，甚至引起燃燒。濕熱滅菌（高壓蒸汽滅菌）一般培養(yǎng)基用121℃，滅菌30min。滅菌結(jié)束后先斷電源，等壓力降為零后再開蓋。一般在壓力降為零，溫度降至約60℃時(shí)開蓋。滅菌：干熱滅菌、濕熱滅菌第六頁，共三十八頁，2022年，8月28日第七頁，共三十八頁，2022年，8月28日第八頁，共三十八頁，2022年，8月28日2、培養(yǎng)基的制備制備過程：稱量，配制，調(diào)pH，分裝，滅菌。建議所有藥品分別用水溶解后再混合，若藥品種類較多則建議前一種藥品充分溶解后再加另一種藥品，且要邊加邊用玻璃棒攪勻，待藥品完全溶解后，補(bǔ)充水分至所需體積。如果配制固體培養(yǎng)基，需等藥品充分溶解好以后，再加入瓊脂，并充分?jǐn)嚢?，防止糊底，最后補(bǔ)足所需水分。如果配方中含有淀粉，需先將淀粉用少量冷水調(diào)成糊狀，然后再在火上加熱攪拌并補(bǔ)充水分，待完全溶解后使用。第九頁，共三十八頁，2022年，8月28日調(diào)節(jié)pH：培養(yǎng)基溶解均勻后，冷卻至室溫時(shí)用pH試紙測定pH值，然后根據(jù)要求加酸或堿（一般用1mol的HCl或NaOH）,要緩慢少量且多加攪拌。培養(yǎng)基配方為自然pH時(shí)，不用調(diào)pH。培養(yǎng)基的分裝：將制好的培養(yǎng)基分裝入試管內(nèi)或三角瓶內(nèi)，管（瓶）口塞上棉塞。固體培養(yǎng)基要趁熱分裝。分裝時(shí)要避免培養(yǎng)基沾染管（瓶）口，引起污染。分裝量可分為以下幾方面：（1）斜面：裝量為管長的1/4~1/5。（2）液體、半固體培養(yǎng)基裝載量不超過管長的1/3。（3）三角瓶：裝量不超過容積的1/2。第十頁，共三十八頁，2022年，8月28日第十一頁，共三十八頁，2022年，8月28日3、斜面擺放斜面擺放時(shí)，斜面不超過試管長度的1/2。培養(yǎng)基充滿試管底部約1cm，然后再形成斜面。第十二頁，共三十八頁，2022年，8月28日4、平板的制備一般每皿需培養(yǎng)基約15~20mL。手持培養(yǎng)皿在酒精燈火焰附近打開皿蓋，倒入培養(yǎng)基，當(dāng)培養(yǎng)基覆蓋培養(yǎng)皿2/3面積時(shí)停止傾倒培養(yǎng)基，蓋上皿蓋，平放在桌面上。第十三頁，共三十八頁，2022年，8月28日第十四頁，共三十八頁，2022年，8月28日5、接種與培養(yǎng)接種方式：斜面接種、液體接種、平板接種。

1、斜面接種左手持菌種管和斜面管，使斜面向上。用右手先將棉塞擰轉(zhuǎn)松動，再拿接種環(huán)，并用右手的小指、無名指和手掌拔下棉塞并夾緊，同時(shí)將管口在火焰上燒一圈，接種環(huán)灼燒滅菌后插入試管內(nèi)、冷卻、挑菌，立即轉(zhuǎn)入斜面底部，沿斜面劃線。第十五頁，共三十八頁，2022年，8月28日第十六頁，共三十八頁，2022年，8月28日第十七頁，共三十八頁，2022年，8月28日2、液體接種由斜面菌種接種到液體培養(yǎng)基中的方法。操作與固體接種方法基本固體接種相似，只是在將接種環(huán)送入液體培養(yǎng)基中時(shí)，使環(huán)在液體與管壁接觸的地方輕輕磨擦，使菌體分散，然后塞上棉塞，輕輕搖勻，即可培養(yǎng)?；蛘呦仍陂L好菌種的斜面試管中加入無菌水，然后用接種環(huán)將菌體輕輕洗下，混合均勻后直接倒入液體培養(yǎng)基中。如果菌種是培養(yǎng)在液體培養(yǎng)基中時(shí)，一般用移液管或滴管接種。第十八頁，共三十八頁，2022年，8月28日第十九頁，共三十八頁，2022年，8月28日3、平板接種將菌種接至培養(yǎng)皿的方法，平板接種的目的是觀察菌落形態(tài)、分離純化菌種，活菌計(jì)數(shù)以及在平板上進(jìn)行各種試驗(yàn)時(shí)采用的一種接種方法，可分為下面幾種：劃線法：見平板劃線操作。點(diǎn)種法：一般用于觀察絲狀真菌，點(diǎn)接于平板表面即可。第二十頁，共三十八頁，2022年，8月28日第二十一頁，共三十八頁，2022年，8月28日6、微生物菌種保藏斜面保藏液體石蠟保藏甘油保藏冷凍干燥保藏液氮保藏第二十二頁，共三十八頁，2022年，8月28日斜面保藏

此方法的優(yōu)點(diǎn)時(shí)簡便、可行，使用方便，缺點(diǎn)是保藏時(shí)間不長，每隔一段時(shí)間需重新移植培養(yǎng)。傳代多了，菌種易變異。液體石蠟保藏

液體石蠟需間隙滅菌2~3次，最后于105℃烘干水分。保藏時(shí)，液體石蠟液面高出斜面最頂端1cm以上。第二十三頁，共三十八頁，2022年，8月28日第二十四頁，共三十八頁，2022年，8月28日甘油保藏，一般甘油的最終濃度為40%，置于-20℃保存。冷凍干燥保藏，先使微生物在極低溫度下（-70℃左右）快速冷凍，然后在減壓下利用升華現(xiàn)象除去水分。一般用脫脂牛奶作為保護(hù)劑，濃度為10%~12%，8磅（112℃，不超過113℃）滅菌20分鐘。液氮保藏，一般用10%的甘油或二甲基亞砜作為保護(hù)劑。此外，程序降溫過程與步驟十分重要。第二十五頁，共三十八頁，2022年，8月28日第二十六頁，共三十八頁，2022年，8月28日第二十七頁，共三十八頁，2022年，8月28日第二十八頁，共三十八頁，2022年，8月28日第二十九頁，共三十八頁，2022年，8月28日第三十頁，共三十八頁，2022年，8月28日7、微生物的分離、純化第三十一頁，共三十八頁，2022年，8月28日涂布操作時(shí)，用力要均勻，以防劃破培養(yǎng)基。要涂布到菌（土壤）懸液全部滲入培養(yǎng)基方能結(jié)束。第三十二頁，共三十八頁，2022年，8月28日厭氧微生物的分離和培養(yǎng)

Hungate滾管法：Hungate和Bryant等人在分離家畜瘤胃中微生物和沼氣微生物時(shí)均采用此法。第三十三頁，共三十八頁，2022年，8月28日8、注意事項(xiàng)酒精燈的使用酒精燈添加酒精時(shí)，必須先將火焰熄滅。酒精裝量不超過總?cè)莘e的2/3。實(shí)驗(yàn)過程中切勿使酒精等易燃藥品接近火焰。如遇火險(xiǎn)，應(yīng)先關(guān)掉火源，在用濕布掩蓋滅火，必要時(shí)用滅火器。微生物實(shí)驗(yàn)操作,首要的是要保證安全，包括實(shí)驗(yàn)室安全、人身安全等。第三十四頁，共三十八頁，2022年，8月28日化培養(yǎng)基時(shí)，不要從上面握三角瓶的瓶口，要從側(cè)面捏住三角瓶的瓶口，并且不要從上方觀察培養(yǎng)基融化情況，以防培養(yǎng)基噴出傷人。每種培養(yǎng)基不是可以培養(yǎng)所有的微生物的，每種菌種都有適宜的培養(yǎng)基。當(dāng)我們拿到一個(gè)菌種后，一定要將其接種到最適培養(yǎng)基上進(jìn)行活化。活化好后，用其中的1~2支進(jìn)行擴(kuò)繁，再進(jìn)行下一步試驗(yàn)操作。其它活化好的菌種一定要妥善保藏。第三十五頁，共三十八頁，2022年，8月28日無菌操作環(huán)境的控制微生物無菌操作對環(huán)境要求嚴(yán)格，最好設(shè)有專門的實(shí)驗(yàn)室或無菌操作室。要求環(huán)境清潔，人員流動少。超凈工作臺的使用：細(xì)菌、酵母菌與小型絲狀真菌要分開在不同的超凈臺上操作，建議每類菌固定在某個(gè)超凈臺上操作。使用前后開紫外滅菌30分鐘左右，并且用之前后都要用75%的酒精擦拭一遍。實(shí)驗(yàn)操作后要及時(shí)將培養(yǎng)物移出無菌操作臺，不要將無菌操作臺作為臨時(shí)培養(yǎng)箱。同時(shí)無菌操作垃圾要及時(shí)清除，千萬不