二次普通微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)第1頁/共18頁二、基本原理是1884年由丹麥病理學(xué)家C.Gram所創(chuàng)立的。革蘭氏染色法是細(xì)菌學(xué)上最常用的鑒別染色法。革蘭氏染色是是根據(jù)革蘭氏陽性細(xì)菌、陰性細(xì)菌細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)、組成的不同而使用一系列的染色處理使之差別顯色。其染色方法是先將細(xì)菌分別用結(jié)晶紫和碘液初染媒染后，乙醇脫色，再經(jīng)復(fù)染劑復(fù)染。最終被染成紅色的是革蘭氏陰性細(xì)菌；被染成紫色的是革蘭氏陽性細(xì)菌。第2頁/共18頁革蘭氏染色原理：第一步：結(jié)晶紫使菌體著上紫色第二步：碘和結(jié)晶紫形成大分子復(fù)合物，分子大，能被細(xì)胞壁阻留在細(xì)胞內(nèi)。第三步：酒精脫色，細(xì)胞壁成分和構(gòu)造不同，出現(xiàn)不同的反應(yīng)。G+菌：細(xì)胞壁厚，肽聚糖含量高，交聯(lián)度大，當(dāng)乙醇脫色時，肽聚糖因脫水而孔徑縮小，故結(jié)晶紫-碘復(fù)合物被阻留在細(xì)胞內(nèi)，細(xì)胞不能被酒精脫色，仍呈紫色。Gˉ菌：肽聚糖層薄，交聯(lián)松散，乙醇脫色不能使其結(jié)構(gòu)收縮，因其含脂量高,乙醇將脂溶解，縫隙加大，結(jié)晶紫-碘復(fù)合物溶出細(xì)胞壁，酒精將細(xì)胞脫色，細(xì)胞無色，蕃紅復(fù)染后呈紅色。第3頁/共18頁第4頁/共18頁1234結(jié)晶紫碘液酒精復(fù)紅第5頁/共18頁三、實(shí)驗(yàn)材料大腸桿菌（24h培養(yǎng)）斜面菌種枯草桿菌（12h培養(yǎng)）斜面菌種第6頁/共18頁四、方法步驟1涂片、干燥、固定：同簡單染色。2初染：滴加結(jié)晶紫染色1min，后用水沖洗。3媒染：滴加碘液染色1~2min，后用水沖洗，甩盡殘余水4脫色：用95%乙醇沖洗30秒（需要嚴(yán)格控制時間和濃度），然后立即用水沖洗。5復(fù)染：用蕃紅或石炭酸復(fù)紅覆蓋涂片進(jìn)行復(fù)染，蕃紅染2~3min，如果石炭酸復(fù)紅染1min。水洗，晾干。6鏡檢：先用低倍鏡觀察，后用油鏡觀察1第7頁/共18頁

革蘭氏陰性桿菌革蘭氏陽性桿菌第8頁/共18頁1、載玻片要潔凈無油跡。涂片時，滴水不要過多，挑菌量宜少，涂片要均勻，菌膜宜薄。2、革蘭氏染色成敗的關(guān)鍵是酒精脫色。五、注意事項(xiàng)3、染色過程中勿使染色液干涸。4、選用幼齡的細(xì)菌。第9頁/共18頁實(shí)驗(yàn)六

微生物細(xì)胞大小測定一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶W(xué)習(xí)用鏡臺測微尺校正目鏡測微尺的方法★學(xué)習(xí)并掌握用目鏡測微尺測定細(xì)菌細(xì)胞大小的方法★★鞏固顯微鏡油鏡的使用方法第10頁/共18頁二、實(shí)驗(yàn)原理測定微生物細(xì)胞大小是在顯微鏡下利用測微尺進(jìn)行。測微尺可分為目鏡測微尺和鏡臺測微尺。目鏡測微尺是特制的圓形玻片，中央有一刻度尺（100等分），可放入目鏡鏡筒內(nèi)，用于測定細(xì)胞大小。鏡臺測微尺為一載玻片，上貼有圓形蓋片，中央有總長度為1mm(100等分)，每小格長0.01mm(10μm)。目鏡測微尺每小格大小隨顯微鏡放大倍數(shù)不同而改變，使用目鏡測微尺進(jìn)行測量之前必須用鏡臺測微尺標(biāo)定，以求出在某一放大倍數(shù)下目鏡測微尺每小格所代表的長度，然后用標(biāo)定好的目鏡測微尺進(jìn)行測量。第11頁/共18頁第12頁/共18頁三、實(shí)驗(yàn)材料

枯草桿菌標(biāo)本片第13頁/共18頁四、實(shí)驗(yàn)方法步驟1）用鏡臺測微尺標(biāo)定目鏡測微尺。2）用目鏡測微尺測定枯草桿菌大小。第14頁/共18頁（1）用鏡臺測微尺標(biāo)定目鏡測微尺。放置目尺：取出目鏡，旋開接目鏡，將目尺放在目鏡鏡筒的中間隔板上（有刻度的一面朝下），旋上接目鏡，并插入鏡筒。放置臺尺：將臺尺放置于顯微鏡的載物臺上，使刻度面朝上。標(biāo)定目尺：先用低倍鏡觀察，找到臺尺刻度，轉(zhuǎn)動目鏡使目尺與臺尺的刻度軸線相平行，移動臺尺使目尺與臺尺某一區(qū)間的兩對刻度線完全重合，然后計(jì)數(shù)出兩重合線間各自所占格數(shù)，通過如下公式計(jì)算：

數(shù)標(biāo)定低倍鏡目尺每小格所代表的實(shí)際長度目尺每小格長度（um）=兩對重合刻度線之間臺尺所占格數(shù)×10兩對重合刻度線之間目尺所占格數(shù)第15頁/共18頁（2）用目鏡測微尺測定枯草桿菌大小取下臺尺，將染色片放在載物臺上，先用低倍鏡觀察，后換油鏡觀測，計(jì)量細(xì)菌長和寬所占小格數(shù)，將測得格數(shù)乘以已標(biāo)定的目尺每小格長，即得菌體實(shí)際大小。分別選擇5個大的和5個小的菌體，并測量其長、寬數(shù)值，求出平均值，以正確格式表示細(xì)菌大小。第16頁/共18頁①將浸過油的鏡頭按下述方法擦拭干凈：a.先用擦鏡紙將油鏡頭上的油擦去，擦1次。b.用擦鏡紙沾少許擦鏡液將鏡頭擦1次。c.再用干凈的擦鏡紙將鏡頭擦1次。注意擦