植物基因功能研究策略第1頁，共157頁，2023年，2月20日，星期四目錄基因功能研究的內(nèi)容基因功能研究的意義基因功能研究的現(xiàn)狀基因功能研究策略正向遺傳學(xué)策略反向遺傳學(xué)策略第2頁，共157頁，2023年，2月20日，星期四Whatisgene?InGenetics–

thebasicunitofhereditythatistransmittedfromparentstooffspringinreproduction,whichdeterminesinheritedtraits.InMolecularBiology-entirenucleicacidsequencenecessaryforthesynthesisofafunctionalpolypeptide(proteinchain)orfunctionalRNA現(xiàn)代對基因的定義是DNA分子中含有特定遺傳信息的一段核苷酸序列總稱，是遺傳物質(zhì)的最小功能單位。

第3頁，共157頁，2023年，2月20日，星期四WhatisGeneexpression?第4頁，共157頁，2023年，2月20日，星期四基因功能研究的內(nèi)容基因功能研究內(nèi)容功能基因鑒定基因表達規(guī)律基因產(chǎn)物生化功能基因表達的生理功能第5頁，共157頁，2023年，2月20日，星期四植物基因功能研究的目標(biāo)

確定和理解決定植物生命活動的所有基因，從分子、生化和生理水平上揭示植物生命活動機理。這些知識最終將會提高人類駕馭植物生產(chǎn)的能力。第6頁，共157頁，2023年，2月20日，星期四植物基因功能研究的重要意義提高利用常規(guī)方法培育新品種的能力；提高利用基因工程手段改良植物品種的能力；采取更有針對性的栽培生產(chǎn)措施，提高生產(chǎn)效率；更有效的利用植物資源生產(chǎn)人類所需要的產(chǎn)品；提高對珍稀植物的保護能力。第7頁，共157頁，2023年，2月20日，星期四植物基因功能研究的現(xiàn)狀在擬南芥、水稻基因組和其它作物已完成測定的序列中，只有部分基因進行了功能研究。多數(shù)只通過ESTs和OFR等進行了鑒定。許多基因在植物生長發(fā)育中的確切功能和作用還不清楚?；驕y序的步伐遠大于基因功能研究的腳步，公共數(shù)據(jù)庫的DNA序列每天都以數(shù)萬核苷酸的速度增加。第8頁，共157頁，2023年，2月20日，星期四DNA序列的主要數(shù)據(jù)庫/

NationalCenterforBiotechnologyInformation

/

MaizeGDBisfundedbyacooperativeagreementthroughthe

USDAAgriculturalResearchService.植物基因功能研究的現(xiàn)狀第9頁，共157頁，2023年，2月20日，星期四植物基因功能研究的現(xiàn)狀第10頁，共157頁，2023年，2月20日，星期四DNA序列的主要數(shù)據(jù)庫/

SGDTM（SaccharomycesGenomeDatabase）isascientificdatabaseofthemolecularSaccharomycesbiologyandgeneticsoftheyeastSaccharomycescerevisiae,whichiscommonlyknownasbaker'sorbuddingyeast.植物基因功能研究的現(xiàn)狀第11頁，共157頁，2023年，2月20日，星期四第12頁，共157頁，2023年，2月20日，星期四第13頁，共157頁，2023年，2月20日，星期四第14頁，共157頁，2023年，2月20日，星期四植物基因功能研究策略正向遺傳學(xué)策略

forwardgeneticsstrategy反向遺傳學(xué)策略

reversegeneticsstrategy第15頁，共157頁，2023年，2月20日，星期四正向遺傳學(xué)策略

forwardgeneticsstrategy表現(xiàn)型基因型PhenotypeGenotype第16頁，共157頁，2023年，2月20日，星期四正向遺傳學(xué)策略

誘變

突變體篩選克隆基因基因功能技術(shù)路線第17頁，共157頁，2023年，2月20日，星期四正向遺傳學(xué)策略基因突變基因失活或產(chǎn)物無功能recessive基因表達減弱或產(chǎn)物活性降低基因表達加強或產(chǎn)物具有新功能dominant基因突變類型第18頁，共157頁，2023年，2月20日，星期四正向遺傳學(xué)策略誘變劑Mutagenesis化學(xué)誘變劑

Chemicalmutagens輻射

RadiationTDNA和轉(zhuǎn)座子插入

TDNAortransposoninsertion

誘變第19頁，共157頁，2023年，2月20日，星期四基因突變的分子基礎(chǔ)按突變發(fā)生的原因分類

自發(fā)突變(spontaneousmutation):在自然狀況下發(fā)生的突變。

誘發(fā)突變(inducedmutation):有機體暴露在誘變劑中引起的突變。一.自發(fā)突變的分子基礎(chǔ)自發(fā)突變可能由DNA復(fù)制錯誤,自發(fā)損傷和轉(zhuǎn)座因子等多種原因引起。(一)DNA復(fù)制中的錯誤遺傳物質(zhì)是DNA,DNA復(fù)制是半保留復(fù)制,如果發(fā)生錯誤,引起堿基替換(basesubstitution),即一對堿基被另一對堿基替換，造成DNA遺傳信息的改變。從而導(dǎo)致基因突變。第20頁，共157頁，2023年，2月20日，星期四

正常情況下,A-T配對,氨基態(tài)的腺嘌呤(A)只與胸腺嘧啶(T)配對,但有時可轉(zhuǎn)變成稀有的亞氨基形式,可以與胞嘧啶配對,形成A-C,再經(jīng)一次復(fù)制,DNA分子中的A-T對變成了G-C對.這種互變異構(gòu)可以在DNA復(fù)制中自發(fā)產(chǎn)生。第21頁，共157頁，2023年，2月20日，星期四堿基替換可以分為轉(zhuǎn)換和顛換:1.轉(zhuǎn)換(transitions):嘌呤替代嘌呤,或嘧啶替代嘧啶。

AG或GA,TC或CT

2.顛換(Tranversions):嘌呤替代嘧啶,或嘧啶替代嘌呤。

AC,AT,CA,TA

3.移碼突變（frame-shiftmutation）:在DNA復(fù)制中發(fā)生增加或減少一個或幾個堿基對所造成的突變。移碼突變可造成蛋白質(zhì)分子發(fā)生較大的結(jié)構(gòu)改變。

第22頁，共157頁，2023年，2月20日，星期四(二)自發(fā)損傷(spontaneouslesions)

即自然產(chǎn)生的DNA損傷引起突變,如脫嘌呤和脫氨基等。

1.脫嘌呤：最為常見，由于DNA分子中堿基和脫氧核糖間的糖苷鍵受到破壞，從而引起一個鳥嘌呤(G)或腺嘌呤(a)從DNA分子上脫落下來。造成DNA損傷，產(chǎn)生無嘌呤位點，在DNA復(fù)制中引入錯誤；或由修復(fù)系統(tǒng)移去無嘌呤位點或插入一個堿基而引起突變。

2.脫氨基：胞嘧啶脫氨基變成U,U與A配對，結(jié)果使G-C對變成A-T對（轉(zhuǎn)換)。

3.氧化性損傷：個體自然產(chǎn)生的氧化基，氧化物如超氧自由基,氫氧自由基及過氧化基等，能對DNA造成氧化性損傷，引起突變，導(dǎo)致人類疾病。第23頁，共157頁，2023年，2月20日，星期四烯醇式結(jié)構(gòu)第24頁，共157頁，2023年，2月20日，星期四玉米中控制分枝的tb1基因是一個轉(zhuǎn)錄因子，該基因上游>41kb作為順式調(diào)控因子，調(diào)控tb1基因的表達，玉米中tb1的表達量是大芻草中的2倍，該基因表達上的變化造成玉米和大芻草形態(tài)上的巨大差異。Nature,1997,386:485-488第25頁，共157頁，2023年，2月20日，星期四玉米中tga1基因控制穎殼的有無，該性狀只有一個基因控制，由于tga1基因一個氨基酸的替換，造成玉米和大芻草如此巨大的表型差異。Nature,2005,436:714-719第26頁，共157頁，2023年，2月20日，星期四水稻落?；蛟?006年的science上有兩篇文章，一篇是比較indica和野生稻sh4，是由于一個氨基酸的替換造成的，另一篇是日本人做的，比較indica和japonica的qSH1，此基因是由于調(diào)控區(qū)一個SNP引起的。

Science,2006,311:1936-1939第27頁，共157頁，2023年，2月20日，星期四小麥的Q基因具有多效性，影響到脫粒、小穗長度，株高和抽穗等一系列性狀。該基因也是一個轉(zhuǎn)錄因子。也是由于一個氨基酸的替換影響了同源二聚體的形成。Genetics,2006,172:547-555第28頁，共157頁，2023年，2月20日，星期四小麥中的Gpc-B1基因，NAC類轉(zhuǎn)錄因子，在野生小麥中由于該基因的表達，籽粒蛋白含量、鋅和鐵含量較栽培小麥提高很大，而栽培小麥中，該基因由于一個堿基的插入造成移碼突變而失活，但卻使持綠性增強。Science,2006,314:1298-1301第29頁，共157頁，2023年，2月20日，星期四擬南芥中控制種子大小的AP2基因突變體中在第一個AP2結(jié)構(gòu)域有一個11bp的缺失，造成nullmutation，結(jié)果種子增大，細胞數(shù)增大，細胞體積增大。PNAS,2005,102:3123-3128第30頁，共157頁，2023年，2月20日，星期四控制番茄果型大小的fw2.2是最早克隆的QTL，僅僅因為成熟晚期表達豐度的不同，造成野生型和栽培型果型大小的如此大的差別。Science,2000,289:85-88第31頁，共157頁，2023年，2月20日，星期四

二誘發(fā)突變的分子基礎(chǔ)

各種誘變劑（物理或化學(xué)的）可誘發(fā)基因的突變。誘變劑可以取代堿基，改變堿基或破壞堿基，使DNA發(fā)生錯配，而引起基因突變。(一)堿基類似物：與堿基結(jié)構(gòu)類似，可替代正常堿基摻入DNA分子，引起堿基替換。如5-溴尿嘧啶（BU）是胸腺嘧啶T的類似物，可摻入DNA分子中。BU有兩種互變異構(gòu)體酮式和烯醇式。酮式與A配對，而烯醇式與G配對，這樣很容易引起G-C對與A-T對的互相轉(zhuǎn)換。除BU外，5-溴脫氧尿苷（BrdU），5-尿嘧啶，5-氯尿嘧啶及其脫氧核苷。2-氨基嘌呤（2-AP）等都是堿基類似物。第32頁，共157頁，2023年，2月20日，星期四正向遺傳學(xué)策略mispairingATABuGBuGCBumutation堿基類似物誘變機制誘變

第33頁，共157頁，2023年，2月20日，星期四(二)烷化劑：常用的烷化劑有硫酸二乙脂（DES）、甲基磺酸乙酯（EMS）、甲基磺酸甲酯（MMS）、異丙基甲烷磺酸酯（iPMS）、芥子氣類。另外，亞硝基乙基脲烷（NEU）、亞硝基乙基脲（NEH）、亞硝基甲基脲烷（NMU）、乙烯亞胺（EI）、1,4-雙重氮乙酰丁烷，也是有效的誘變劑，但是有毒，應(yīng)用危險，是潛在致癌物質(zhì)第34頁，共157頁，2023年，2月20日，星期四(三)嵌合劑：吖啶類染料的分子為平面結(jié)構(gòu)，大小與堿基對差不多，可插入DNA雙鏈核心堆積的堿基對之間，在嵌入的位置引起單個堿基對的插入或缺失，造成移碼突變。如口丫啶橙，溴化已啶（EB），原黃素和黃素等。(四)紫外線（UV）:可使DNA產(chǎn)生很多光生成物，如環(huán)丁烷嘧啶二聚體。(五)電離輻射：使DNA分子發(fā)生氫鍵斷裂，DNA單鏈或雙鏈斷裂，堿基或糖基損傷，DNA，蛋白質(zhì)相互交聯(lián)等。x射線，γ射線等，具有較高的能量可引起原子的電離，導(dǎo)致DNA的損傷，基因突變和染色體結(jié)構(gòu)變異。(六)黃曲霉素B1(AFB1)：霉變的花生等食物中含有大量的AFB1，AFB1是一種強致癌劑?？稍贕的N-T位形成一個加成復(fù)合物即產(chǎn)生無嘌呤位點，使GC顛換為T-A，引起基因突變?？蓪?dǎo)致肝癌。第35頁，共157頁，2023年，2月20日，星期四其它誘變劑：如亞硝酸、羥胺（NH2OH）、氮蒽、疊氮化鈉（NaN3）等物質(zhì)，均能引起染色體畸變和基因突變。尤其是疊氮化物在一定條件下可獲得較高的突變頻率，而且相當(dāng)安全，無殘毒。亞硝酸可以使堿基發(fā)生氧化脫氨作用。

HNO2胞嘧啶（C）尿嘧啶（U）

HNO2腺嘌呤（A）次黃嘌呤（H）

HNO2鳥嘌呤（G）黃嘌呤（X）這些反應(yīng)及形成物均可在DNA復(fù)制中產(chǎn)生影響，主要是使堿基對發(fā)生轉(zhuǎn)換。第36頁，共157頁，2023年，2月20日，星期四正向遺傳學(xué)策略ATHTHCGCHNO2mispairingmutation化學(xué)誘變機制誘變第37頁，共157頁，2023年，2月20日，星期四基因突變對遺傳信息的影響(一）堿基替換的影響：單個堿基替換如果發(fā)生在基因編碼區(qū)，則會改變一個密碼子，可以引起蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)中某個氨基酸的變化。

1同義突變(samesensemutation)：由于遺傳密碼具有簡并性。所以有時堿基替換密碼子改變但并不改變氨基酸。如GAU→GAC，但仍是天冬AA，無突變效應(yīng)，密碼子的簡并性大大削弱了突變的危害性，是DNA的容錯機制。

2錯義突變（missensemutation）：指堿基替換密碼子改變引起氨基酸的改變。錯義突變使蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)改變，導(dǎo)致蛋白質(zhì)活性和功能不同程度的改變。一般性質(zhì)相似的氨基酸替換對蛋白質(zhì)的影響小，而性質(zhì)不同的氨基酸的替換可能強烈的影響蛋白質(zhì)的功能。

第38頁，共157頁，2023年，2月20日，星期四3無義突變（nonsensemutation):堿基替換使編碼氨基酸的密碼子突變?yōu)榻K止密碼子，轉(zhuǎn)錄出的mRNA在翻譯時提前終止，形成的肽鏈不完全，一般沒有活性。形成的終止密碼子為UAG、UAA或UGA。

4通讀（readingthrough):堿基替換使終止密碼子突變?yōu)榫幋a氨基酸的密碼子，轉(zhuǎn)錄出的mRNA在翻譯時不能適時終止，直到另一終止密碼子為止。

移碼突變的影響：在DNA分子的外顯子中遺傳信息是按三聯(lián)體密碼子排列的，插入或缺失１個或２個或４個堿基會改變閱讀框架，結(jié)果翻譯出來的蛋白質(zhì)的氨基酸序列也完全改變，但如果插入或缺失３個堿基，則在翻譯出的多肽鏈上只是多或少一個AA，而不會完全打亂AA序列。第39頁，共157頁，2023年，2月20日，星期四

突變熱點和增變基因：理論上，DNA任何位點都可以發(fā)生突變，但實際上DNA分子上不同部位有著不同的突變率。

1突變熱點：突變率大大高于平均突變率的位點。如５－甲基胞嘧啶（MeC）的存在，MeC脫氨后生成T，不可被校正，而引起突變，C脫氨后變成U，容易被校正。另外一些短的重復(fù)系列也易形成突變熱點，易發(fā)生嵌入和缺失，因DNA復(fù)制前模板鏈與新生鏈之間的滑動造成。

2增變基因（mutatorgene）：指某些基因突變后可使整個基因組中的突變率明顯上升的基因。如DNA聚合酶基因突變，3‘－５’校正功能降低或喪失，是基因突變率升高。另如dam基因突變，則錯配修復(fù)功能喪失，引起突變率升高。第40頁，共157頁，2023年，2月20日，星期四第41頁，共157頁，2023年，2月20日，星期四第42頁，共157頁，2023年，2月20日，星期四第43頁，共157頁，2023年，2月20日，星期四第44頁，共157頁，2023年，2月20日，星期四γ射線誘變第45頁，共157頁，2023年，2月20日，星期四正向遺傳學(xué)策略

在基因工程中，T-DNA中的基因被除掉，保留兩側(cè)的重復(fù)序列，加入欲轉(zhuǎn)移的基因。在用T-DNA誘導(dǎo)突變時，不用加入其它基因。Transpositionandtransposableelements(Ac/Ds)T-DNA插入突變誘變第46頁，共157頁，2023年，2月20日，星期四Tiplasmid~130bpTDNALBRB正向遺傳學(xué)策略

TDNA誘變virgenesTDNA插入突變第47頁，共157頁，2023年，2月20日，星期四第48頁，共157頁，2023年，2月20日，星期四InsertionalmutagenesisbyT-DNA第49頁，共157頁，2023年，2月20日，星期四第50頁，共157頁，2023年，2月20日，星期四WhenandWhereMutationsHappenIneukaryotes,mutationsthatoccurinthesomaticcells(somaticmutations)arenotinherited;mutationsthatoccuranytimeinthegermlineareinherited.WeusuallymeasuretherateinmutationspergametesomaticmutationgermlinemutationGermlineSoma第51頁，共157頁，2023年，2月20日，星期四突變體的篩選方法第52頁，共157頁，2023年，2月20日，星期四第53頁，共157頁，2023年，2月20日，星期四第54頁，共157頁，2023年，2月20日，星期四受細胞核內(nèi)遺傳物質(zhì)控制的遺傳現(xiàn)象，叫做細胞核遺傳（核遺傳）。細胞核遺傳母本父本母本父本正交子代反交子代正向遺傳學(xué)策略第55頁，共157頁，2023年，2月20日，星期四細胞質(zhì)遺傳

受細胞質(zhì)內(nèi)遺傳物質(zhì)控制的遺傳現(xiàn)象，叫做細胞質(zhì)遺傳。母本父本母本父本正交子代反交子代正向遺傳學(xué)策略第56頁，共157頁，2023年，2月20日，星期四正向遺傳學(xué)策略根據(jù)發(fā)生突變基因的性質(zhì)，將眾多突變體分成不同的突變系。稱為突變體篩選。常用的篩選方法是互補檢驗（complementationtest）突變體篩選第57頁，共157頁，2023年，2月20日，星期四正向遺傳學(xué)策略互補檢驗（complementationtest）以豌豆花色為例，野生型為紫色，現(xiàn)有一批突變體花色為白色，它們是相同基因突變，還是不同基因突變？假定突變都是隱性（recessive）突變。突變體篩選第58頁，共157頁，2023年，2月20日，星期四正向遺傳學(xué)策略

互補檢驗假定兩個突變體基因型分別為aa

和bb突變體篩選如果a與b是等位基因aaBBAAbb×AaBb紫色wildtype白色mutant如果a與b不是等位基因第59頁，共157頁，2023年，2月20日，星期四基因組圖譜遺傳圖譜（geneticmap）物理圖譜（physicalmap）第60頁，共157頁，2023年，2月20日，星期四遺傳圖譜（geneticmap）

采用遺傳分析的方法將基因或其它DNA序列標(biāo)定在染色體上構(gòu)建連鎖圖。第61頁，共157頁，2023年，2月20日，星期四遺傳標(biāo)記有可以識別的標(biāo)記，才能確定目標(biāo)的方位及彼此之間的相對位置。構(gòu)建遺傳圖譜就是尋找基因組不同位置上的特征標(biāo)記。包括：形態(tài)標(biāo)記細胞學(xué)標(biāo)記生化標(biāo)記DNA分子標(biāo)記第62頁，共157頁，2023年，2月20日，星期四多態(tài)性（polymophism）所有的標(biāo)記都必須具有多態(tài)性！花色：白色、紅色株高：高、矮血型：A、B、O型淀粉：糯、非糯所有多態(tài)性都是基因突變的結(jié)果！第63頁，共157頁，2023年，2月20日，星期四形態(tài)標(biāo)記形態(tài)性狀：株高、顏色、白化癥等又稱表型標(biāo)記數(shù)量少很多突變是致死的受環(huán)境、生育期等因素的影響第64頁，共157頁，2023年，2月20日，星期四

最早建立的果蠅連鎖圖，就是利用控制果蠅眼睛的形狀、顏色，軀體的顏色、翅膀的形狀等形態(tài)性狀作為標(biāo)記，分析它們連鎖關(guān)系及遺傳距離，繪制而成的。控制性狀的其實是基因，所以形態(tài)標(biāo)記實質(zhì)上就是基因標(biāo)記。第65頁，共157頁，2023年，2月20日，星期四果蠅連鎖圖第66頁，共157頁，2023年，2月20日，星期四細胞學(xué)標(biāo)記明確顯示遺傳多態(tài)性的染色體結(jié)構(gòu)特征和數(shù)量特征染色體的核型染色體的帶型染色體的結(jié)構(gòu)變異染色體的數(shù)目變異優(yōu)點：不受環(huán)境影響缺點：數(shù)量少、費力、費時、對生物體的生長發(fā)育不利第67頁，共157頁，2023年，2月20日，星期四生化標(biāo)記

又稱蛋白質(zhì)標(biāo)記就是利用蛋白質(zhì)的多態(tài)性作為遺傳標(biāo)記。

如：同工酶、貯藏蛋白優(yōu)點：數(shù)量較多，受環(huán)境影響小缺點：受發(fā)育時間的影響、有組織特異性、只反映基因編碼區(qū)的信息第68頁，共157頁，2023年，2月20日，星期四DNA分子標(biāo)記簡稱分子標(biāo)記以DNA序列的多態(tài)性作為遺傳標(biāo)記優(yōu)點：不受時間和環(huán)境的限制遍布整個基因組，數(shù)量無限不影響性狀表達自然存在的變異豐富，多態(tài)性好共顯性，能鑒別純合體和雜合體第69頁，共157頁，2023年，2月20日，星期四限制性片段長度多態(tài)性

（restrictionfragmentlengthpolymorphism，RFLP）

DNA序列能或不能被某一酶酶切，相當(dāng)于一對等位基因的差異。

如有兩個DNA分子（一對染色體），一個具有某一種酶的酶切位點，而另一個沒有這個位點，酶切后形成的DNA片段長度就有差異，即多態(tài)性?？蓪FLP作為標(biāo)記，定位在基因組中某一位置上。人類基因組中有105個RFLP位點，每一位點只有兩個等位基因。第70頁，共157頁，2023年，2月20日，星期四RFLP分析第71頁，共157頁，2023年，2月20日，星期四微衛(wèi)星（microsatellite）標(biāo)記微衛(wèi)星又稱為簡單重復(fù)序列（simplesequencerepeat，SSR）。這種重復(fù)序列的重復(fù)單位很短，常常只有2個、3個或4個核苷酸如一條染色體TCTGAGAGAGACGC另一染色體TCTGAGAGAGAGAGAGAGACGC，就構(gòu)成了多態(tài)性。第72頁，共157頁，2023年，2月20日，星期四遺傳圖譜的構(gòu)建方法

理論基礎(chǔ):連鎖與交換基本方法:兩點測驗法和三點測驗法第73頁，共157頁，2023年，2月20日，星期四植物遺傳圖譜的構(gòu)建選擇研究材料（親本）構(gòu)建分離群體遺傳標(biāo)記檢測標(biāo)記間的連鎖分析第74頁，共157頁，2023年，2月20日，星期四選擇親本

要求親緣關(guān)系遠，遺傳差異大但又不能相差太大以導(dǎo)致引起子代不育。對備選材料進行多態(tài)(差異)性檢測，綜合測定結(jié)果，選擇有一定量多態(tài)性的一對或幾對材料作為遺傳作圖親本。第75頁，共157頁，2023年，2月20日，星期四構(gòu)建作圖群體

第76頁，共157頁，2023年，2月20日，星期四標(biāo)記間的連鎖分析利用在兩個親本間有多態(tài)性的標(biāo)記分析分離群體中所有個體的基因型根據(jù)連鎖交換的情況，確定標(biāo)記之間的連鎖關(guān)系和遺傳距離有計算機軟件可以應(yīng)用第77頁，共157頁，2023年，2月20日，星期四遺傳圖譜的缺陷

分別率有限人類只能研究少數(shù)減數(shù)分裂事件，不能獲得大量子代個體測序要求每個標(biāo)記的間隔小于100kb實際是599kb精確性不夠經(jīng)典遺傳學(xué)認為，交換是隨機發(fā)生的基因組中有些區(qū)域是重組熱點倒位、重復(fù)等染色體結(jié)構(gòu)變異會限制交換重組第78頁，共157頁，2023年，2月20日，星期四物理圖譜的構(gòu)建

用分子生物學(xué)方法直接檢測DNA標(biāo)記在染色體上的實際位置繪制成的圖譜稱為物理圖譜。有遺傳圖譜為什么還要構(gòu)建物理圖譜？

遺傳連鎖圖。它是通過計算連鎖的遺傳標(biāo)志之間的重組頻率，確定他們的相對距離，一般用厘摩(cM，即每次減數(shù)分裂的重組頻率為1%)來表示。物理圖譜是利用限制性內(nèi)切酶將染色體切成片段，再根據(jù)重疊序列確定片段間連接順序，以及遺傳標(biāo)志之間物理距離〔堿基對(bp)或千堿基(kb)或兆堿基(Mb)〕的圖譜。第79頁，共157頁，2023年，2月20日，星期四酵母遺傳圖與物理圖比較A遺傳圖B物理圖第80頁，共157頁，2023年，2月20日，星期四Comparisonofgenetic(likage)andphysicalmapsphysical(bp)genetic(cM)ArabidopsischromosomIV第81頁，共157頁，2023年，2月20日，星期四基于基因圖譜的基因分離技術(shù)圖譜定位克隆，簡稱圖位克?。∕ap-basedcloning)第82頁，共157頁，2023年，2月20日，星期四1、原理：

利用同源染色體的隨機交換和連鎖不平衡的原理，先將與某一特定性狀相關(guān)聯(lián)的目的基因定位到染色體上，在目的基因的兩側(cè)確定一對與目的基因緊密連鎖的分子標(biāo)記，接著將位于兩個分子標(biāo)記間的候選基因DNA片段分離出來，最后再通過遺傳互補試驗鑒定出目的基因。第83頁，共157頁，2023年，2月20日，星期四特點：在不知道基因所編碼蛋白信息的條件下分離基因。要求：

1、需要構(gòu)建性狀上存在分離的群體；

2、高密度的分子標(biāo)記圖譜進行連鎖分析；

3、需要獲得與性狀緊密連鎖的分子標(biāo)記；

4、高質(zhì)量的基因組文庫；第84頁，共157頁，2023年，2月20日，星期四植物基因組遺傳圖譜的構(gòu)建A、選擇親本B、構(gòu)建作圖群體C、遺傳標(biāo)記的染色體定位D、標(biāo)記間的連鎖分析第85頁，共157頁，2023年，2月20日，星期四第86頁，共157頁，2023年，2月20日，星期四分子標(biāo)記(Molecularmarkers)

ADNAsequencethatexistsastwoormorereadilydistinguishedversionsandwhichcanthereforebeusedtomarkamappositiononagenetic,physicalorintegratedgenomemap.即：同源染色體之間DNA序列上的差異，用來表示某個特定的染色體區(qū)段。第87頁，共157頁，2023年，2月20日，星期四第88頁，共157頁，2023年，2月20日，星期四第89頁，共157頁，2023年，2月20日，星期四第90頁，共157頁，2023年，2月20日，星期四Indica(1)Japonica(1)CGGCATATGCTATTTTCTTTGCATCTTTTAACTCTTTATG-----------CGGCATATGCTATTTTCTTTGCATCTTTTAACTCTTTATGGTTCTCTCATSTSs–Sequencetaggedsites

LeftprimerIndica(40)---------------------------------------------------------Japonica(51)TCCATCTTTTGTAGGCTATTTGAAGTTTGGGATTAATACAGTTGATGGTGIndica(40)----------------------------------------------------------Japonica(101)CCACAATATATCGTGAATGGGCGCCTGCTGCACAGTAAGTTCTAATGTAGIndica(41)TCATCCAGCTATTCGCTAATGTTTATGTGTTGTAGGAAATATGGATCACTJaponica(151)TCATCCAGCTATTCGCTAATGTTTATGTGTTGTAGGAAATATGGATCACT

RightprimerInDels:insertionsanddeletions第91頁，共157頁，2023年，2月20日，星期四第92頁，共157頁，2023年，2月20日，星期四網(wǎng)站網(wǎng)址Supplementalmaterialforthispaper/methods/ppsuppl.htmlNottinghamStockCentre（U.K.）http://nasc.nott.ac.uk/RecombinantInbredmaphttp://nasc.nott.ac.uk/new_ri_map.htmlOhioStockCenter（U.S.A.）/aims/TAIRdatabase*，homepageRecombinantInbredmap（mirrorsite）/cgi-bin/maps/RiintromapCAPSmarkers/aboutcaps.htmlSequencetable/cgi-bin/maps/Seqtable.plSNPcollection/SNPs.htmlCEREONcollectionofpolymorphisms/cereonSSLPmarkers/SSLP_info/SSLP.htmlTIGR，genomeannotations/tdb/athl/htmls/index.htmlDatabaseofLersequences/tdb/atgenome/Ler.htmlKasuzaDNAResearchInstitute，genomeannotationshttp://www.kazusa.or.jp/kaos/MIPSgenomeannotationshttp://websvr.mips.biochem.mpg.de/proj/thal/SINSdatabaseoftransposoninsertionshttp://www.jic.bbsrc.ac.uk/sainsbury-lab/jonathan-jones/jjhome.htm*注：TheArabidopsisInformationResource（TAIR）第93頁，共157頁，2023年，2月20日，星期四第94頁，共157頁，2023年，2月20日，星期四第95頁，共157頁，2023年，2月20日，星期四Marker1ACAGAGTAGGAGGCAAACGTCGCGCGTAACGTCACGCGTAACGCTACTTACACGGACAACAGAGTAGGAGGCAAAC………GCTACTTACACGGACAACAGAGTAGGAGGCAAAC………………..GCTACTTACACGGACAPrimerPrimer第96頁，共157頁，2023年，2月20日，星期四雜合=1-(1/2*1/2+1/2*1/2)10-20MarkerP1P2P1P2PoolPool第97頁，共157頁，2023年，2月20日，星期四Chr-1Chr-2Chr-3Chr-4Chr-5第98頁，共157頁，2023年，2月20日，星期四交換率≧50%自由組合交換率＜50%

F1F2第99頁，共157頁，2023年，2月20日，星期四Marker1Marker第100頁，共157頁，2023年，2月20日，星期四第101頁，共157頁，2023年，2月20日，星期四PoolF1PMarker1第102頁，共157頁，2023年，2月20日，星期四第103頁，共157頁，2023年，2月20日，星期四第104頁，共157頁，2023年，2月20日，星期四AGeneBCPCR1….300PCR1….300第105頁，共157頁，2023年，2月20日，星期四第106頁，共157頁，2023年，2月20日，星期四Marker1Marker2第107頁，共157頁，2023年，2月20日，星期四第108頁，共157頁，2023年，2月20日，星期四第109頁，共157頁，2023年，2月20日，星期四RRTargetgeneM1M2RRRRRRRRRRTargetgeneM1M2初步定位精細定位第110頁，共157頁，2023年，2月20日，星期四水稻半矮稈基因sd1的克隆圖位克隆法舉例1：

水稻半矮稈基因sd1被稱為“綠色革命基因”，Monna等人通過圖位克隆的方法克隆到，它是編碼赤霉素代謝合成途徑中一個關(guān)鍵的酶—GA20氧化酶。第111頁，共157頁，2023年，2月20日，星期四第112頁，共157頁，2023年，2月20日，星期四水稻高桿和半矮桿植株第113頁，共157頁，2023年，2月20日，星期四半矮桿IndicajaponicaHabatakiSasanishikiF1正常株高SasanishikiSBIL5MarkerassistedSelection(MAS)Chr1SBIL5F2segregatingpopulation(n=263)第114頁，共157頁，2023年，2月20日，星期四sd-1canbetreatedasamendelianfactorinthispopulation第115頁，共157頁，2023年，2月20日，星期四第116頁，共157頁，2023年，2月20日，星期四第117頁，共157頁，2023年，2月20日，星期四第118頁，共157頁，2023年，2月20日，星期四第119頁，共157頁，2023年，2月20日，星期四第120頁，共157頁，2023年，2月20日，星期四水稻半矮桿基因的精細定位通過對3477個分離單株的分子標(biāo)記檢測（CAPS、SNP等）找到了一個6kb的候選基因區(qū)域。第121頁，共157頁，2023年，2月20日，星期四水稻分蘗基因的克隆圖位克隆法舉例2：理想株型是當(dāng)前國內(nèi)外超級稻研究中的一個核心領(lǐng)域，即通過改變水稻在分蘗、莖稈、穗粒等方面的結(jié)構(gòu)特點，提高水稻產(chǎn)量。對于分蘗基因的克隆及機理研究有助于促進水稻稈壯穗大的理想株型的實現(xiàn)，在高產(chǎn)育種中具有重要應(yīng)用前景。

第122頁，共157頁，2023年，2月20日，星期四水稻分蘗是在基部不延長的節(jié)間形成，并獨立與主桿生長。水稻分蘗的發(fā)生分二個階段：腋芽形成和生長。第123頁，共157頁，2023年，2月20日，星期四我國李家洋實驗室克隆到了控制水稻分蘗的基因MONOCULM1（MOC1）。Themoc1突變體只有一根主桿，沒有分蘗，因為不能形成分蘗芽。第124頁，共157頁，2023年，2月20日，星期四第125頁，共157頁，2023年，2月20日，星期四

通過PCR方法將MOC1和moc1基因擴增出，序列比較后發(fā)現(xiàn)有一個1.9kb的反向轉(zhuǎn)座因子插入到moc1突變體的ORF中。功能互補試驗證明帶有完整的ORF和1.5kb上游啟動子序列的克隆pC8247能恢復(fù)分蘗性狀（圖1）。但是，C-端截短的克隆pC8247S不能恢復(fù)分蘗特性。第126頁，共157頁，2023年，2月20日，星期四第127頁，共157頁，2023年，2月20日，星期四第128頁，共157頁，2023年，2月20日，星期四第129頁，共157頁，2023年，2月20日，星期四總結(jié)1、從性狀的差異到基因，屬于正向遺傳學(xué)范疇；2、親本選擇性狀上存在顯著差異的材料，獲得性狀分離的后代群體；3、親本選擇秈稻、粳稻亞種，便于發(fā)展高密度的分子標(biāo)記；4、通過尋找交換單株來確定緊密連鎖的兩側(cè)分子標(biāo)記；5、利用基因組文庫或PCR的方法分離獲得特殊功能的基因。第130頁，共157頁，2023年，2月20日，星期四存在的問題圖位克隆也有其自身的局限性，在某些情況下，就很難或者不能通過圖位克隆技術(shù)來定位基因。在分析自然發(fā)生的變異的時候，我們最有可能遇到的復(fù)雜情況是一個給定的性狀是由不止一個的基因位點控制的。例如，在Kashmir-1（有抗性的）和Columbia（敏感的）株系之間的雜交實驗中，我們發(fā)現(xiàn)粉狀霉菌抗性基因至少涉及三個遺傳位點，它們是以附加的方式起作用的（I.Wilson，C.Schiff，和S.Somerville，個人交流）。對這些抗性基因中的任何一個作精細定位都要求降低作圖群體的遺傳復(fù)雜性，例如通過創(chuàng)造只有一個位點保持多態(tài)性的重組近交系。在擬南芥的株系之間雜交時，很多種性狀是由一個或多個遺傳位點控制的，其中包括開花時間，種子大小，冬眠，生理節(jié)律，次生代謝以及表皮毛的密度（綜述見Alonso-Blanco和Koornneef，2000）。無論何時，當(dāng)影響這些性狀的自然或者誘導(dǎo)的突變被定位的時候，第二位點修飾成分會干擾這些分析。第131頁，共157頁，2023年，2月20日，星期四表觀（上位）遺傳突變這個術(shù)語是描述一個基因在表達和功能上的可遺傳改變，而不涉及DNA序列的改變（綜述見Wolffe和Matzke,1999），已有文獻很好地證明的是花發(fā)育基因SUPERMAN的后生clarkkant等位基因（Jacobson和Meyerowitz，1997）。這些等位基因是可遺傳的，但它們不穩(wěn)定有一個小的回復(fù)率。它們在SUPERMAN基因的DNA序列中都具有相似的胞嘧啶甲基化現(xiàn)象，結(jié)果，有可能減少了SUPERMAN基因轉(zhuǎn)錄子的表達。它們中沒有一個是和SUPERMAN的DNA序列改變聯(lián)系在一起的；盡管如此，它們能被帶有SUPERMAN基因的轉(zhuǎn)基因所補充。目前，對于這種表觀遺傳突變是怎么產(chǎn)生的以及它們出現(xiàn)的頻率知道的不多。第132頁，共157頁，2023年，2月20日，星期四關(guān)于染色體上位點的物理和遺傳距離的比值是變化的。通常這種變化是比較小的，對作圖的分辨率也只有較小的影響（Copenhaver等，1998）。但是，有證據(jù)表明有些染色體區(qū)域是例外的。例如，對GURKE基因的圖位克隆就非常困難，這個基因的定位接近于第一條染色體的著絲粒；在著絲粒附近重組是嚴格限制的，使得對它精細定位的努力非常無效。而且，在這個區(qū)域中重復(fù)DNA單元的廣泛分布使我們辨認出散布的單拷貝序列，這些單拷貝序列能產(chǎn)生有疑問的遺傳標(biāo)記（R.TorresRuiz，個人交流）。這個發(fā)現(xiàn)是經(jīng)過對第二條染色體上的物理和遺傳距離之間的比值的系統(tǒng)地分析之后確認的（Lin等，1999）。對這條染色體的幾乎全序列，1%重組的遺傳距離相當(dāng)于100~400Kb的物理距離，平均是250Kb。然而著絲粒區(qū)域是一個顯著的例外，在這里1%重組的遺傳距離相當(dāng)于1000~2500Kb?？磥碇档弥赋龅氖窃诂F(xiàn)存的物理圖譜中，擬南芥的五個著絲粒是沒有一個被完全覆蓋的。最近對著絲粒區(qū)域的分析顯示這些區(qū)域通常包含重復(fù)的DNA和幾乎不含表達的基因（Copenhaver等，1999）。因此，由于接近著絲粒，應(yīng)該沒有擬南芥基因是不服從圖位克隆策略的。第133頁，共157頁，2023年，2月20日，星期四除了著絲粒，第二條染色體上也有一個小片段上1%重組的遺傳距離相當(dāng)于1000Kb甚至更多。根據(jù)推測，觀察到的低重組率現(xiàn)象可能是由于被用于作圖分析的株系的DNA序列的重排（Lin等，1999；Mayer等，1999）。第二和第四條染色體的DNA序列的比較顯示有些基因片段是在這兩條染色體之間被復(fù)制的（其中一個片段的大小是4.6Mb），還有一個從線粒體基因組向第二條染色體轉(zhuǎn)移的DNA片段（Lin等，1999）。這些發(fā)現(xiàn)清楚地證明了擬南芥基因組的結(jié)構(gòu)是可以不斷改變的。因此，不同株系之間的遺傳變異可能不僅僅是由點突變和DNA重排導(dǎo)致的，這就從根本上給圖位克隆工程造成了嚴重的問題。舉例來說，如果在兩個株系之間發(fā)生倒轉(zhuǎn)的一個大約500Kb的序列被用于形成的一個作圖群體，所有發(fā)生在這個倒轉(zhuǎn)內(nèi)的重組事件將產(chǎn)生不育的減數(shù)分裂產(chǎn)物。因此，不可能在這個倒轉(zhuǎn)序列內(nèi)對突變進行作圖。到目前為止，發(fā)生在常見株系之間的這樣的DNA重排還沒有被報道過，確實應(yīng)該是這樣，因為它們很難被檢測到。在一個作圖實驗中，它們的出現(xiàn)將很有可能被忽視直到最后一步。

第134頁，共157頁，2023年，2月20日，星期四反向遺傳學(xué)策略

ReverseGeneticsStrategy基因型表現(xiàn)型GenotypePhenotype第135頁，共157頁，2023年，2月20日，星期四反向遺傳學(xué)策略

已知序列

預(yù)測蛋白基因突變

異體表達表達抑制

表現(xiàn)型變化

基因功能技術(shù)路線第136頁，共157頁，2023年，2月20日，星期四反向遺傳學(xué)策略

基因組測序擬南芥、水稻cDNA文庫差示法

PCR法探針法

ESTs法其它分子標(biāo)記法已知序列來源第137頁，共157頁，2023年，2月20日，星期四反向遺傳學(xué)策略

已知序列來源基因組測序DNAsegmentsGenomeDNAvectorshostReproductionclonesequencing第138頁，共157頁，2023年，2月20日，星期四YAC-basedphysicalmapofricechromosome1已知序列來源反向遺傳學(xué)策略

基因組測序第139頁，共