毛細(xì)管電泳分離條件

選擇策略

CE分離條件的優(yōu)化方法共65頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第1頁!概述毛細(xì)管電泳分離條件選擇的內(nèi)容很多，且與樣品、分離模式、檢測(cè)方式、進(jìn)樣方法乃至儀器系統(tǒng)結(jié)構(gòu)等相關(guān)，但有許多共同之處，這里將對(duì)普遍性的問題進(jìn)行考察，包括毛細(xì)管電泳模式選定、儀器操作條件確定、介質(zhì)選擇等。CE分離條件的優(yōu)化方法共65頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第2頁!毛細(xì)管電泳模式的選定

毛細(xì)管電泳有許多不同的模式，因而在分離樣品前必需很好選擇分離模式，以達(dá)到最佳的分離結(jié)果。毛細(xì)管電泳模式的選擇，可以有不同的原則，比如簡單性、目的性、普適性、選擇性、樣品特異性等。CE分離條件的優(yōu)化方法共65頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第3頁!毛細(xì)管電泳模式的選定以簡單性為原則時(shí)，所選分離模式的操作、條件優(yōu)化、分離控制等必需是最簡單和最容易的，而且富于后續(xù)變化。根據(jù)這一道理，首先應(yīng)該考慮自由溶液分離模式，最后才考慮填充形式的分離模式。簡單性原則是毛細(xì)管電泳模式選擇的一般規(guī)則。CE分離條件的優(yōu)化方法共65頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第4頁!毛細(xì)管電泳模式的選定我們的分析目的可能并不是單一的，這時(shí)的分離模式選擇，就應(yīng)該注意考慮其通用性。CZE、MEKC和CEC的通用性和可調(diào)節(jié)性都較大，但根據(jù)簡單性原則，還以CZE或MEKC為優(yōu)。注意，填充型毛細(xì)管電泳不適合于顆粒樣品的分離，甚至也不適合于大分子分離。

CE分離條件的優(yōu)化方法共65頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第5頁!毛細(xì)管電泳模式的選定實(shí)際樣品五花八門，性質(zhì)各異，分離模式的選擇是可變的和靈活的。這種靈活性恰好與毛細(xì)管電泳模式間的易換性相吻合。CE分離條件的優(yōu)化方法共65頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第6頁!電泳電壓

理論和實(shí)驗(yàn)均表明，效率與電壓間存在極大值。極大電壓通常也是最佳工作電壓。在實(shí)際分離中，如果所用的毛細(xì)管很細(xì)或緩沖液的電導(dǎo)很低，則極大電壓可能會(huì)超出儀器的控制范圍，此時(shí)沒有最佳電壓，可選用儀器允許的最大輸出電壓。當(dāng)毛細(xì)管較粗或緩沖液電導(dǎo)較高時(shí)，極大電壓有可能很小，若此時(shí)的分離度很高，也可以選擇大于極大值的電壓進(jìn)行分離。CE分離條件的優(yōu)化方法共65頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第7頁!電泳電壓方法如下：①在電泳條件下，改變電壓（或電流）測(cè)定對(duì)應(yīng)的電流（或電壓）；②做電壓～電流曲線；③取線性關(guān)系中的最大電壓（或電流），作為分離電壓（或電流）。線性以上的電壓，焦耳熱效應(yīng)過大，一般不宜選用。但如果分離效率很高，就可以選用，以便加快分離速度。在做CGE時(shí)，電場強(qiáng)度應(yīng)控制在150～400V/cm之間，否則容易導(dǎo)致凝膠的破壞。CE分離條件的優(yōu)化方法共65頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第8頁!電泳溫度

電泳溫度的選擇，主要是指毛細(xì)管外表溫度的選擇與控制。溫度變化不僅影響分離的重現(xiàn)性，而且影響分離效率。溫度選擇應(yīng)考慮：熱效應(yīng)控制、重現(xiàn)性控制、分離效率控制和分離介質(zhì)對(duì)溫度的限制等因素。熱效應(yīng)控制旨在避免管內(nèi)溶液因過熱而出氣泡或沸騰，顯然溫度越低越好；重現(xiàn)性控制意在避免溫度波動(dòng)；分離效率控制的目的在于提高分離度，依據(jù)樣品性質(zhì)的變化而高低不等，需由實(shí)驗(yàn)來測(cè)定。此外，某些介質(zhì)對(duì)工作溫度有一定的限制，比如凝膠介質(zhì)不能適應(yīng)忽高忽低的溫度變化，也不宜在過高或過低的溫度中電泳。CE分離條件的優(yōu)化方法共65頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第9頁!電泳溫度毛細(xì)管電泳溫度的選擇，目前還受到儀器條件的限制，大多數(shù)商品儀器只能在20～50℃之間進(jìn)行選擇，而且不能實(shí)現(xiàn)溫度梯度控制。此方面的研究還有待進(jìn)一步展開。CE分離條件的優(yōu)化方法共65頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第10頁!簡單電場聚焦

設(shè)樣品中的電解質(zhì)濃度比電泳緩沖液低得多，則在進(jìn)行電動(dòng)進(jìn)樣時(shí)，電場就會(huì)基本加在樣品與管口之間，而很少加在毛細(xì)管中。如此，樣品就會(huì)快速遷移到管口并突然減速堆積。僅需把樣品配制在低濃度緩沖液或純水中就能降低樣品中的電解質(zhì)濃度。此法可提高檢測(cè)靈敏度2～10倍。用水配制樣品，由壓力進(jìn)樣，也可在電泳初期產(chǎn)生聚焦現(xiàn)象，但聚焦時(shí)間很短，檢測(cè)靈敏度的提高有限（不大于2倍）。CE分離條件的優(yōu)化方法共65頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第11頁!增強(qiáng)電場聚焦

本進(jìn)樣法成功的關(guān)鍵在于水區(qū)帶和樣品區(qū)帶長度比的控制，一般需通過實(shí)驗(yàn)來優(yōu)化。研究表明，水區(qū)帶最好不要長于2mm，電遷移進(jìn)樣時(shí)間應(yīng)控制在1min以內(nèi)。在優(yōu)化條件下，本法可提高檢測(cè)靈敏度102～103倍而不損失分離效率。一種簡化的方法是：用壓力法順序引入水、樣品和電泳緩沖液區(qū)帶，然后加電壓分離。在分離初期，正負(fù)離子各自聚焦在水區(qū)帶的前沿和后沿。本方法可提高檢測(cè)靈敏度一倍以上。

CE分離條件的優(yōu)化方法共65頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第12頁!pH聚焦

本法適用于弱解離樣品，尤其適用于兩性樣品。這類樣品在經(jīng)過pH突變界面時(shí)，會(huì)因解離度變化而發(fā)生遷移速度乃至遷移方向突變，產(chǎn)生堆積現(xiàn)象。設(shè)電滲流向負(fù)極，我們從正極進(jìn)樣且樣品區(qū)帶的pH高于背景，則酸性樣品會(huì)高速向后遷移并在區(qū)帶后沿減速和集結(jié)，而堿性樣品則向前加速，不能聚焦。如果樣品區(qū)帶pH低于背景，則酸性樣品不聚焦而堿性樣品向前減速，集結(jié)于區(qū)帶前沿。CE分離條件的優(yōu)化方法共65頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第13頁!色譜濃集利用色譜原理讓樣品先在柱頭吸著，而后進(jìn)行在線洗脫分離，可以大幅度提高毛細(xì)管電泳的進(jìn)樣體積（至微升級(jí)）。有三類在線柱頭濃集方法：①涂層法，即在進(jìn)樣端鍵合一段色譜固定相，此法流動(dòng)阻力小、易于操作，但濃縮量有限；②填充法，即在管頭填充色譜填料，其優(yōu)劣與①相反，注意，一旦填充處被堵，就需切去重裝；③拼接法，即將填充好的色譜小柱拼接到毛細(xì)管頭上，本法可使進(jìn)樣量達(dá)到10μl以上。拼接法亦有多種，建議將色譜填料充填在內(nèi)徑等于分離管外徑的塑料管中，這樣只須將分離管插入填好的小柱中即可，能隨時(shí)更換。CE分離條件的優(yōu)化方法共65頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第14頁!檢測(cè)條件毛細(xì)管電泳檢測(cè)方法的選擇也比較有限，商品儀器中通常只有紫外吸收檢測(cè)方法，有些廠家如Beckman與Agilent等出口的儀器還配有激光誘導(dǎo)熒光檢測(cè)器，也可以和質(zhì)譜聯(lián)用。由于激光誘導(dǎo)熒光具有極高的檢測(cè)靈敏度，所以只要有條件，就應(yīng)當(dāng)盡量選用它。不過，激光誘導(dǎo)熒光檢測(cè)系統(tǒng)比較昂貴，而且通常需要對(duì)樣品進(jìn)行衍生方能實(shí)現(xiàn)檢測(cè)，所以大家還是普遍采用紫外檢測(cè)方法。CE分離條件的優(yōu)化方法共65頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第15頁!檢測(cè)條件

在多數(shù)毛細(xì)管電泳中，使用200nm或205nm附近的檢測(cè)波長，能對(duì)絕大多數(shù)的樣品提供高靈敏度的檢測(cè)條件。如果毛細(xì)管中填有凝膠，則檢測(cè)波長需選在210nm以上，否則會(huì)因背景太強(qiáng)而測(cè)不出峰。紫外波長選擇參數(shù)可參見表27,P64。CE分離條件的優(yōu)化方法共65頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第16頁!毛細(xì)管區(qū)帶電泳介質(zhì)選擇

毛細(xì)管區(qū)帶電泳是CE中最基本的方式，其介質(zhì)的選擇與控制也是其他分離模式的基礎(chǔ)。毛細(xì)管區(qū)帶電泳介質(zhì)實(shí)際上是一種具有pH緩沖能力的均勻的自由溶液，通常稱為電泳緩沖液（Runningbuffer）,簡稱緩沖液（Buffer）,由緩沖試劑、pH調(diào)節(jié)劑、溶劑和添加劑組成。緩沖液的選擇，可分為pH與緩沖試劑選擇、添加劑選擇等部分。CE分離條件的優(yōu)化方法共65頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第17頁!pH及其緩沖試劑

計(jì)算方法顯然很吸引人，但實(shí)際樣品的解離常數(shù)大多未知，做不了計(jì)算。此外，pH除控制弱電解質(zhì)樣品的有效淌度外，還控制著電滲甚至樣品在管壁上的吸附水平，這就難以計(jì)算了。如此，就必需通過實(shí)驗(yàn)的搜尋和優(yōu)化來選擇最佳pH?？上扔昧姿峋彌_體系為搜尋基礎(chǔ)，初步確定（最佳）pH范圍后，再進(jìn)一步細(xì)選出更好pH和緩沖試劑。磷酸鹽是毛細(xì)管電泳中最常用的緩沖體系之一，它的紫外吸收低，pH緩沖范圍比較寬（pH=1.5～13），但電導(dǎo)也比較大。毛細(xì)管電泳中常用的緩沖體系還有硼酸或硼砂等，詳見表28，P65。CE分離條件的優(yōu)化方法共65頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第18頁!pH及其緩沖試劑pH的選擇也和所用的毛細(xì)管種類有關(guān)，許多涂層毛細(xì)管只能在一定的pH范圍內(nèi)工作，例如聚丙烯酰胺涂層毛細(xì)管，在4＜pH＜9的范圍以外工作，其涂層容易水解失效。CE分離條件的優(yōu)化方法共65頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第19頁!pH及其緩沖試劑

與緩沖試劑一樣，pH調(diào)節(jié)劑也會(huì)顯著影響分離效率。由于多數(shù)緩沖試劑屬酸性物質(zhì)，所以pH調(diào)節(jié)劑主要是堿類，常用的有KOH、NaOH、Tris等。如果這些堿不能給出理想的分離結(jié)果，則可以考慮使用胺或醇胺等有機(jī)堿，它們本身可以作為緩沖試劑（表29，P66）。若緩沖試劑為堿類，則對(duì)應(yīng)的pH調(diào)節(jié)劑即為酸，建議盡量采用弱酸。CE分離條件的優(yōu)化方法共65頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第20頁!添加劑

如果緩沖體系各種參數(shù)經(jīng)優(yōu)化后仍不能給出良好的分離結(jié)果，就應(yīng)該考慮使用添加劑。最簡單的添加劑是無機(jī)電解質(zhì)如NaCI、KCI等。較高濃度的電解質(zhì)可以壓縮區(qū)帶，甚至抑制蛋白質(zhì)等分子在管壁上的吸附。不過，高濃度電解質(zhì)容易導(dǎo)致過熱，使分離效率反而下降。過熱嚴(yán)重時(shí)，管內(nèi)會(huì)出現(xiàn)氣泡，分離不能進(jìn)行。用兩性有機(jī)電解質(zhì)代替無機(jī)電解質(zhì)可克服過熱問題。在pH=pI時(shí)，兩性電解質(zhì)凈電荷為零，不參與導(dǎo)電。實(shí)驗(yàn)證明，兩性電解質(zhì)是分離蛋白質(zhì)的有效添加劑。CE分離條件的優(yōu)化方法共65頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第21頁!添加劑在功能性添加劑中，手性添加劑主要針對(duì)手性分離，在第七章中將有專門討論。環(huán)糊精及其衍生物是主要的手性拆分添加劑，此外還能夠破壞神經(jīng)節(jié)苷脂等形成的混合膠束，使之產(chǎn)生電泳分離；二胺類常用于電滲控制或抑制蛋白質(zhì)吸附；動(dòng)態(tài)網(wǎng)絡(luò)形成劑如纖維素、聚氧乙烯等能產(chǎn)生篩分效果，稍后再來討論。CE分離條件的優(yōu)化方法共65頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第22頁!添加劑高分子類添加劑可以形成分子團(tuán)或特殊的局部結(jié)構(gòu)，從而影響樣品的遷移過程，改善分離。高分子也可以強(qiáng)烈吸附在毛細(xì)管壁上，影響電滲以及分離過程。由于此類添加劑種類繁多，正是改善分離大有文章可做的地方，但也是最難掌握的部分。CE分離條件的優(yōu)化方法共65頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第23頁!毛細(xì)管凝膠電泳與非膠篩分介質(zhì)選擇

毛細(xì)管凝膠電泳實(shí)際上是一增加了凝膠支持介質(zhì)的區(qū)帶電泳，因而其介質(zhì)的選擇包含緩沖體系和凝膠體系兩類。CGE所用的凝膠主要是聚丙烯酰胺和瓊脂糖凝膠。凝膠支持介質(zhì)主要依據(jù)樣品的尺寸或大小來選擇，在分離DNA小片斷或進(jìn)行DNA測(cè)序時(shí)，通常使用T=5%～10%之間的交聯(lián)或線性聚丙烯酰胺凝膠。在分離大片斷DNA、雙鏈DNA或某些蛋白質(zhì)時(shí)，需采用瓊脂糖凝膠。表30，P68列出了不同樣品種類和分子量范圍的凝膠參考選擇方案。CE分離條件的優(yōu)化方法共65頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第24頁!毛細(xì)管凝膠電泳與非膠篩分介質(zhì)選擇CGE緩沖液的選擇，由于受凝膠介質(zhì)對(duì)pH的限制，可變性遠(yuǎn)小于CZE。典型的緩沖液種類及其組成請(qǐng)參見表31，P69。當(dāng)使用非膠篩分介質(zhì)時(shí)，緩沖液的選擇和CZE沒有差別，實(shí)際上，此時(shí)的篩分網(wǎng)絡(luò)對(duì)應(yīng)于CZE中的添加劑。CE分離條件的優(yōu)化方法共65頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第25頁!表面活性劑選擇原則

表面活性劑可分為陰離子型、陽離子型、兩性離子型和中性分子等不同種類（參見表32）。原則上凡能在水或極性有機(jī)溶劑中形成膠束的物質(zhì)，都可用于MEKC，但是在實(shí)際工作中，由于毛細(xì)管電泳分離及其檢測(cè)等方面的限制，可選的表面活性劑數(shù)量相當(dāng)有限，目前比較常用的幾種表面活性劑列在表32，P70。CE分離條件的優(yōu)化方法共65頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第26頁!表面活性劑搜尋策略

根據(jù)上述原則，碳鏈較短的陰離子表面活性劑為優(yōu)先選擇對(duì)象。在實(shí)際工作中，由于SDS容易獲得且紫外吸收較低，通常被首先選用。當(dāng)其效果不好時(shí)，再換用具有不同碳鏈長度或結(jié)構(gòu)的其他陰離子表面活性劑。若還得不到好的結(jié)果，就應(yīng)該考慮使用其他類型的表面活性劑了。CE分離條件的優(yōu)化方法共65頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第27頁!膠束修飾及其他

通過添加重金屬離子可以改變膠束表面的電荷數(shù)量，進(jìn)而改變分離選擇性；使用混合表面活性劑，可以調(diào)節(jié)分離度或峰分布；在表面活性劑中加入手性中心，則可對(duì)光學(xué)活性分子進(jìn)行選擇分離。除表面活性劑所形成的膠束相外，還可以設(shè)法增加其他的作用相，比如另一種膠束（不同于由混合表面活性劑所形成的單相膠束）。CE分離條件的優(yōu)化方法共65頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第28頁!微乳液毛細(xì)管電動(dòng)色譜

MEEKC所用的微乳液是一種光學(xué)透明和熱力學(xué)穩(wěn)定的水包油（O/W）型分散體系，通常由緩沖溶液、不溶于水的有機(jī)液機(jī)（油）和乳化劑構(gòu)成。緩沖液的選擇原理同CZE。有機(jī)液體有丁烷、戊烷等。乳化劑包括表面活性劑和助表面活性劑。通過改變油和乳化劑的組成，可以改變峰容量、分離效率和分離選擇性。CE分離條件的優(yōu)化方法共65頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第29頁!毛細(xì)管電動(dòng)色譜由于毛細(xì)管填充柱的制備需要專門的技術(shù)，頻繁更換固定相的機(jī)會(huì)比較小，所以主要考慮淋洗液的選擇。淋洗液的選擇因素包括淋洗強(qiáng)度、導(dǎo)電大小、pH、散熱能力、背景吸收等，因此原則上是CZE和HPLC的合并。不過，開管電色譜模式與CZE更為接近，其差別主要在于毛細(xì)管的涂層。CE分離條件的優(yōu)化方法共65頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第30頁!親和毛細(xì)管電泳

當(dāng)在CZE緩沖液或凝膠或色譜固定相中引入抗原或抗體時(shí)，便可以用于研究和分析抗體或抗原，也可以利用這種方法對(duì)電泳峰進(jìn)行特異性定性。顯然除抗原與抗體的選擇需要應(yīng)用生化知識(shí)外，其他方面的選擇與CZE等相同。CE分離條件的優(yōu)化方法共65頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第31頁!等電聚焦CIEF中，正極溶液通常是20～50mmol/L的磷酸，負(fù)極溶液是10～50mmol/L的NaOH,兩性電解質(zhì)和傳統(tǒng)的等電聚焦相同。兩性電解質(zhì)通常先選用pH=3～９者，但如選用更窄的pH梯度試劑則可獲得更精細(xì)的分離結(jié)果。一般地，為了不使形成的pH梯度被電滲泵出毛細(xì)管，需要使用涂層技術(shù)。沒有電滲時(shí)，聚焦區(qū)帶就需要通過壓力或別的方法才能推過檢測(cè)窗口。CE分離條件的優(yōu)化方法共65頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第32頁!條件選擇流程第三步，根據(jù)樣品性質(zhì)確定檢測(cè)方法，一般先選直接紫外吸收；第四步，確定樣品處理方式，包括衍生方案以及離心過濾除蛋白等；第五步，根據(jù)樣品解離常數(shù)計(jì)算最佳pH，或利用50μmID毛細(xì)管和磷酸緩沖體系確定pH范圍;CE分離條件的優(yōu)化方法共65頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第33頁!條件選擇流程在毛細(xì)管電泳條件選擇中，還應(yīng)充分注意下列操作事項(xiàng)：①最好對(duì)樣品和緩沖液進(jìn)行過濾或離心處理。這對(duì)CGE和CEC尤其重要。②毛細(xì)管的洗滌或平衡，與緩沖體系、pH以及柱子有關(guān)。磷酸根與石英和玻璃之間存在慢相互作用，需要延長平衡或沖洗時(shí)間，處長的時(shí)值應(yīng)由分離重現(xiàn)性決定；填充毛細(xì)管最好采用空白電泳方式進(jìn)行平衡。CE分離條件的優(yōu)化方法共65頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第34頁!毛細(xì)管電泳模式的選定在分離生物樣品時(shí)，通常需要根據(jù)分離的目的來選擇分離模式：欲測(cè)定樣品的尺寸，就須選NGCE或CGE，偶可選用CZE或MEKC；要測(cè)定樣品的等電點(diǎn)，則應(yīng)選用CIEF；在進(jìn)行親和作用研究時(shí)，則應(yīng)當(dāng)首先選用ACE。CE分離條件的優(yōu)化方法共65頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第35頁!毛細(xì)管電泳模式的選定有時(shí)，我們會(huì)特別注重分離的選擇性，即只希望把目標(biāo)組分分離出來。此時(shí)應(yīng)優(yōu)先考慮選擇性高的分離模式，如ACE等。如果已知樣品的某些特性，也可以據(jù)此選擇分離模式，比如在分離蛋白質(zhì)和多肽等兩性樣品時(shí)，可以優(yōu)先考慮CIEF；在分離中性分子時(shí)，優(yōu)先考慮MEKC；在分離水難溶組分時(shí)，優(yōu)先考慮非水毛細(xì)管電泳形式等。CE分離條件的優(yōu)化方法共65頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第36頁!基本操作條件選擇

這里所謂的操作條件包括：電泳電壓、溫度、毛細(xì)管尺寸、進(jìn)樣方法、檢測(cè)條件等，下面分別討論之。CE分離條件的優(yōu)化方法共65頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第37頁!電泳電壓極大電壓可以利用理論計(jì)算或?qū)嶒?yàn)測(cè)定來獲得。利用理論效率方程，通過求極值的方法可以確定極大電壓。理論計(jì)算過程往往繁瑣，而且也不很可靠，通過實(shí)驗(yàn)測(cè)定來確定工作電壓其實(shí)非常簡單。根據(jù)歐姆定律，電流和電壓具有線性關(guān)系，如能測(cè)定電壓與電流的關(guān)系曲線就不難確定工作電壓。

CE分離條件的優(yōu)化方法共65頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第38頁!電泳電壓除工作電壓選擇外，還應(yīng)考慮電壓施加方式的選擇。理論上，毛細(xì)電泳可有恒流、恒壓、恒功率、梯度升（降）壓分離等不同的工作方式。目前，絕大多數(shù)分離采用瞬間升壓的恒壓工作方式。實(shí)際上，采用恒流工作方式有利于提高分離的重現(xiàn)性，在沒有良好恒溫控制的系統(tǒng)上進(jìn)行電泳時(shí)，建議采用恒流或恒功率操作。經(jīng)驗(yàn)表明，采用升壓（升流）分離，可以有效提高分離度，有條件時(shí)，應(yīng)當(dāng)充分考慮線性升壓的工作方式。在微量制備研究中，還需要考慮降壓分離過程，以便于餾分的準(zhǔn)確收集。CE分離條件的優(yōu)化方法共65頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第39頁!電泳溫度多數(shù)情況下，在20～30℃之間進(jìn)行電泳，就能獲得良好的分離結(jié)果。如若不然，便需調(diào)整或優(yōu)化溫度。優(yōu)化多從室溫開始，向上搜尋，若無結(jié)果，再向下搜尋。不少糖類樣品需要高于室溫的分離環(huán)境，有些樣品如蛋白等則可能需要低于室溫的分離條件。CE分離條件的優(yōu)化方法共65頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第40頁!電聚焦

當(dāng)離子從高電場突然進(jìn)入低電場時(shí)，會(huì)因減速而堆集在電場交界處，導(dǎo)致區(qū)帶縮短、濃度提高，進(jìn)而提高檢測(cè)靈敏度和分離效率。電場聚焦進(jìn)樣需要至少一個(gè)臺(tái)階電場梯度。利用溫度梯度、粘度變化（CGE）、電解質(zhì)濃度梯度等方法都能構(gòu)建出電場梯度，其中電解質(zhì)濃度梯度法最簡便實(shí)用，可分簡單電聚焦、增強(qiáng)電聚焦和整管進(jìn)樣聚焦等方法。CE分離條件的優(yōu)化方法共65頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第41頁!增強(qiáng)電場聚焦

利用壓力法先進(jìn)一段水區(qū)帶，然后用電遷移法正常進(jìn)樣，可以增強(qiáng)聚焦效果。純水區(qū)帶的電導(dǎo)趨于零，在電動(dòng)進(jìn)樣期間將承受所有的電場，而管內(nèi)其他部位電場趨于零。在此情形下，不產(chǎn)生電滲（不滿足電滲產(chǎn)生的個(gè)條件），僅一種符號(hào)的離子（取決于電場方向）可遷入管中并迅速穿過水區(qū)帶、濃集于它的前沿。如想同時(shí)分離異號(hào)離子，則需用正負(fù)電場順序進(jìn)樣各一次。CE分離條件的優(yōu)化方法共65頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第42頁!整管進(jìn)樣

如果樣品溶液過稀，則可將其灌滿整根毛細(xì)管，并施加反向分離電壓至電流上升到正常值的95%，然后改變電壓方向進(jìn)行正常電泳分離。其機(jī)制是：在反向電壓下，電滲將電泳緩沖液從毛細(xì)管的（正常）出口泵入并引起此部位電場突降，這時(shí)，逆電滲而動(dòng)的離子，在逾越突降面時(shí)就會(huì)減速、堆積，同時(shí)又被快速的電滲推回。這種過程連續(xù)不斷地進(jìn)行，直至緩沖液到達(dá)進(jìn)口時(shí)才被強(qiáng)行停止。本聚焦方法具有方向性，如毛細(xì)管產(chǎn)生從正到負(fù)的電滲，只濃集負(fù)離子，若產(chǎn)生從負(fù)到正的電滲則濃集正離子。CE分離條件的優(yōu)化方法共65頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第43頁!pH聚焦對(duì)于兩性組分，設(shè)樣品區(qū)帶pH＞pI而背景pH＞pI，則組分在區(qū)帶中為負(fù)離子，它們向后（正極）遷移，進(jìn)入背景后又變成正離子，再往回（負(fù)極）遷移，如此往復(fù)，緊密聚焦在區(qū)帶后沿。若樣品區(qū)帶為低pH而背景為高pH，則樣品離子向前遷移，聚結(jié)在區(qū)帶前沿。凡向后聚焦的操作，最好在進(jìn)樣后，跟著再進(jìn)一段背景緩沖液，以免區(qū)帶跑出管口。利用pH聚焦可使兩性組分的檢測(cè)靈敏度提高兩個(gè)數(shù)量級(jí)以上而效率保持不變。CE分離條件的優(yōu)化方法共65頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第44頁!檢測(cè)條件

一般地，檢測(cè)條件的選擇包括檢測(cè)方法、檢測(cè)方式及有關(guān)參數(shù)選擇等。毛細(xì)管電泳可以有柱上和柱后兩種檢測(cè)方式，除與質(zhì)譜和核磁聯(lián)用外，商品儀器通常采用柱上檢測(cè)方式，沒有多少選擇的余地，所以檢測(cè)方式的選擇主要是針對(duì)自己組裝的毛細(xì)管電泳系統(tǒng)。光吸收或發(fā)射型檢測(cè)手段，通常采用柱上檢測(cè)方式；電化學(xué)等檢測(cè)手段，宜采用柱后檢測(cè)方式。CE分離條件的優(yōu)化方法共65頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第45頁!檢測(cè)條件紫外吸收是一種相當(dāng)成熟和可靠的檢測(cè)方法，有單波長、多波長、可變波長和波長掃描或二極管陣列等不同形式的檢測(cè)設(shè)計(jì)，它們各有優(yōu)劣：二極管陣列或波長掃描可以測(cè)定分離峰的紫外吸收光譜，用于組分定性和純度鑒定，但檢測(cè)靈敏度相對(duì)較低；可變波長檢測(cè)器，能提供各種不同的波長，以獲得選擇性檢測(cè)，但檢測(cè)光線的能量一般較弱，靈敏度居中；多波長或單波長僅能提供有限的波長，但檢測(cè)靈敏度高。CE分離條件的優(yōu)化方法共65頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第46頁!分離介質(zhì)選擇

分離介質(zhì)的選擇包括緩沖試劑、添加劑、溶劑、pH、試劑濃度、篩分介質(zhì)、分配相等的選擇與優(yōu)化。這些參數(shù)的優(yōu)化與分離模式有關(guān)?，F(xiàn)以CZE介質(zhì)的選擇為重點(diǎn)進(jìn)行介紹，在此基礎(chǔ)上擴(kuò)充介紹其他各模式介質(zhì)的選擇。CE分離條件的優(yōu)化方法共65頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第47頁!pH及其緩沖試劑

緩沖體系由緩沖試劑和pH調(diào)節(jié)劑兩部分構(gòu)成，其中緩沖試劑的選擇主要由所需的pH決定，而pH則依樣品的性質(zhì)和分離效率而定。PH的選擇是決定分離成敗的一大關(guān)鍵。若樣品的解離常數(shù)已知，可用公式進(jìn)行計(jì)算，使組分間μem差別最大時(shí)所對(duì)應(yīng)的pH就是理論最佳pHm。凡pKa=pHm±1、μem與樣品接近、無紫外吸收的化合物均可視為候選緩沖試劑。對(duì)候選緩沖試劑進(jìn)行實(shí)驗(yàn)測(cè)定，通常就能選出最佳試劑。CE分離條件的優(yōu)化方法共65頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第48頁!pH及其緩沖試劑研究經(jīng)驗(yàn)表明：對(duì)于蛋白質(zhì)、肽和氨基酸等兩性樣品，采用酸性（pH2）或堿性（pH＞9）分離條件，比較容易得到好的分離結(jié)果；糖類樣品通常在pH=9～11之間能獲得最佳分離；羧酸或其他樣品多在pH=5～9之間選擇分離條件。CE分離條件的優(yōu)化方法共65頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第49頁!pH及其緩沖試劑在相同的pH下，不同緩沖體系的分離效果不盡相同，有的可能相差甚遠(yuǎn)。我們的經(jīng)驗(yàn)是，能與樣品發(fā)生相互作用的試劑，有可能就是最好的試劑。一個(gè)典型的例子是，在分離糖類和DNA等分子時(shí)優(yōu)先使用硼酸鹽緩沖體系，因?yàn)榕鹚岣芘c糖羥基形成配位鍵，從而增加糖的負(fù)電荷和分離度。硼酸緩沖試劑也適用于其他含鄰位羥基或多羥基化合物的分離。CE分離條件的優(yōu)化方法共65頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第50頁!pH及其緩沖試劑緩沖試劑及pH調(diào)節(jié)劑的濃度也需要優(yōu)化。緩沖試劑的濃度一般控制在10～200mmol/L之間。電導(dǎo)率高的緩沖試劑如磷酸鹽和硼砂等，其濃度多控制在20mmol/L附近，而電導(dǎo)小的試劑如硼酸及HEPES等，其濃度可在100mmol/L以上。有時(shí)為了抑制蛋白質(zhì)吸附等特殊目的，可采用很高（＞0.5mol/L）的試劑濃度，此時(shí)要注意減少分離電壓，分析速度自然也將隨之降低。CE分離條件的優(yōu)化方法共65頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第51頁!添加劑還有三類重要的添加劑，一是非電解質(zhì)高分子添加劑，如纖維素，聚乙烯醇、多糖、TritonX-100等等；二是荷電表面活性劑，如十二烷基硫酸鈉、十二烷基季銨鹽等；三是功能性添加劑，如手性冠醚、環(huán)糊精、二胺、動(dòng)態(tài)網(wǎng)絡(luò)形成劑等等。這三類添加劑主要通過分子間各種復(fù)雜的相互作用，影響樣品的權(quán)均淌度。CE分離條件的優(yōu)化方法共65頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第52頁!添加劑表面活性劑具有吸附、增溶、形成膠束等功能。低濃度的陽離子表面活性劑，如十六烷基季銨鹽，能在石英毛細(xì)管表面形成單層或雙層吸附層，常用于電滲控制或用于抑制蛋白質(zhì)在管壁上的吸附。陰離子表面活性劑如SDS能使蛋白質(zhì)變性，在蛋白質(zhì)分子量測(cè)定時(shí)很常用。高濃度的表面活性劑能形成膠束，可作為色譜準(zhǔn)固定相。CE分離條件的優(yōu)化方法共65頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第53頁!溶劑

CE緩沖液一般用水配制，改用水-有機(jī)混合溶劑（少量的有機(jī)溶劑也可以看成為添加劑），常常能有效改善分離度或分離選擇性，并使許多水難溶的樣品得以用毛細(xì)管電泳分析。常用的有機(jī)溶劑主要是揮發(fā)性較小的極性有機(jī)物，如甲醇、乙醇、乙腈、丙酮、甲酰胺等。在極端情況下，可完全使用有機(jī)溶劑，或以有機(jī)溶劑為主體，這就是非水毛細(xì)管電泳技術(shù)。理論上，非水溶劑選擇的余地很大，但實(shí)際上，由于受電解質(zhì)溶解能力和強(qiáng)紫外吸收的限制，可選的有機(jī)溶劑并不很多，目前常用甲醇、甲酰胺和乙腈等溶劑。CE分離條件的優(yōu)化方法共65頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第54頁!毛細(xì)管凝膠電泳與非膠篩分介質(zhì)選擇

由于在毛細(xì)管中灌制凝膠介質(zhì)有很大的難度，近年來，國際上發(fā)展出了新的篩分介質(zhì)，即非膠篩分介質(zhì)。它們主要是一些親水線性或枝狀高分子，比如線性聚丙烯酰胺、甲基纖維素、羥丙基甲基纖維素、聚乙烯醇等。這些物質(zhì)溶解于水中后，當(dāng)濃度大到一定值時(shí)會(huì)自動(dòng)形成動(dòng)態(tài)網(wǎng)絡(luò)。將不同聚合度的聚乙烯醇進(jìn)行組合，能夠構(gòu)建出適合于DNA測(cè)序用的介質(zhì)。結(jié)合使用SDS，利用不同濃度的纖維素組合，可以進(jìn)行蛋白質(zhì)分子量的測(cè)定。關(guān)于非膠介質(zhì)體系的選擇，目前尚無明確的規(guī)律，只能通過對(duì)不同種類、濃度和配比效果的研究比較，才能確定。CE分離條件的優(yōu)化方法共65頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第55頁!膠束電動(dòng)毛細(xì)管色譜介質(zhì)選擇

本模式是CZE的緩沖液被高于膠束臨界濃度的表面活性劑所修飾的結(jié)果。長鏈烷烴陰陽離子表面活性劑易在水中聚成球形膠束，電荷朝外，烷基藏于內(nèi)部。其作用類似于色譜固定相，稱為準(zhǔn)固定相。顯然表面活性劑的種、性質(zhì)及濃度是MEKC條件選擇的關(guān)鍵之一。CE分離條件的優(yōu)化方法共65頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第56頁!表面活性劑選擇原則表面活性劑的選擇應(yīng)考慮以下限制：①經(jīng)濟(jì)易得；②水溶性高者為佳；③紫外吸收背景越低越好；④不與樣品發(fā)生破壞性作用；⑤所形成的膠束需有足夠的穩(wěn)定性；⑥中性樣品需選擇離子型表面活性劑。CE分離條件的優(yōu)化方法共65頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第57頁!表面活性劑搜尋策略必需注意，陽離子表面活性劑可能會(huì)改變電滲方向，即從負(fù)極流向正極，此時(shí)需要反向進(jìn)樣電泳，在正極一端檢測(cè)，得出峰順序相反的譜圖。CE分離條件的優(yōu)化方法共65頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第58頁!膠束修飾及其他MEKC中比較經(jīng)常采用的多相體系是：水-膠束-環(huán)糊