第四章酶工程1894年，日本科學(xué)家首次從米曲霉中提煉出淀粉酶，并將淀粉酶用作治療消化不良的藥物，從而開創(chuàng)了人類有目的地生產(chǎn)和應(yīng)用酶制劑的先例。1911年，美國(guó)科學(xué)家從木瓜中提取出木瓜蛋白酶，并將木瓜蛋白酶用于除去啤酒中的蛋白質(zhì)渾濁物。此后，酶制劑的生產(chǎn)和應(yīng)用就逐步發(fā)展起1949年，科學(xué)家成功地用液體深層發(fā)酵法生產(chǎn)出了細(xì)菌α－淀粉酶，從此揭開了近代酶工業(yè)的序幕。1971年，第一次國(guó)際酶工程學(xué)術(shù)會(huì)議在美國(guó)召開，會(huì)議的主題就是固定化酶的研制和應(yīng)用。20世紀(jì)70年代后期，酶工程領(lǐng)域又出現(xiàn)了固定化細(xì)胞技術(shù)。1986年，我國(guó)科學(xué)家利用固定化原生質(zhì)體發(fā)酵生產(chǎn)堿性磷酸酶和葡萄糖氧化酶等相繼獲得成功，為酶工程的進(jìn)一步發(fā)展開辟了新的途徑。近20年來，隨著基因工程的滲入，使酶的定向改造成為可能，所以在固定化酶、固定化細(xì)胞和固定化原生質(zhì)體發(fā)展的同時(shí)，酶分子修飾技術(shù)、酶的化學(xué)合成以及酶的人工合成等方面的研究，也在積極地開展中，從而使酶工程更加顯示出廣闊而誘人的前景。

第一節(jié)酶的生物學(xué)特征

酶（enzyme）是活細(xì)胞的成分，由活細(xì)胞自身合成的、并能在細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞外起催化作用的一種一、酶的化學(xué)本質(zhì)是生物體內(nèi)具有催化功能的特殊蛋白質(zhì)。酶是生物催化劑二、酶的催化特性

1.一般催化特性

(1)改變反應(yīng)速度,但不改變反應(yīng)的方向和平衡點(diǎn)

(2)在反應(yīng)前后,酶的組成和質(zhì)量不發(fā)生變化

2.特異催化功能(1)高效性(2)特異性

(3)酶反應(yīng)活性可以調(diào)節(jié)

只有活化能大于能閾的分子才有可能發(fā)生反應(yīng)。酶可以極大地降低反應(yīng)所需的活化能

在同一反應(yīng)中，有催化劑參與能降低生成過渡狀態(tài)分子的能閾，從而所需的活化能比無催化劑參與的要少，所以很容易生成過渡狀態(tài)分子。酶的作用就在于降低反應(yīng)活化能閾，使反應(yīng)沿著活化能閾較低的途徑迅速進(jìn)行。三、酶的分類與命名

（一）酶的分類

國(guó)際生物化學(xué)聯(lián)合會(huì)酶學(xué)委員會(huì)于1972年根據(jù)酶所催化反應(yīng)的類型，將酶分為六大類。1.氧化還原酶類氧化還原酶類能引起底物的脫氫或受氫作用，發(fā)生氧化還原反應(yīng)。這類酶負(fù)有生物氧化的功能，是一類獲得能量反應(yīng)的酶。在生化反應(yīng)中只有兩種氧化還原形式：氫的得失——失氫為氧化，得氫為還原;電子得失——失電子為氧化，得電子為還原。催化氧化還原反應(yīng)的酶數(shù)量很大，大致可分為氧化酶和脫氫酶兩種。一般情況下，氧化酶催化的反應(yīng)都有氧分子直接參與，脫氫酶所催化的反應(yīng)總伴隨氫原子的轉(zhuǎn)移。（一）酶的分類

(1)脫氫酶脫氫酶能活化底物上的氫并使它轉(zhuǎn)移到另一物質(zhì)上，使底物因脫氫而氧化。不同的底物將由不同的脫氫酶進(jìn)行脫氫作用。A－2H+BA+B－2H(2)氧化酶氧化酶能將分子氧(空氣中的氧)活化，從而作為氫的受體而形成水；或催化底物脫氫，并氧化生成過氧化氫。

A-2H+O2

A+H2O

A-2H+O2

A+H2O2（一）酶的分類

2.轉(zhuǎn)移酶類轉(zhuǎn)移酶類能催化一種化合物分子的基團(tuán)轉(zhuǎn)移到另一種化合物分子上。

A-X+B

A+B-X3.水解酶類水解酶類能催化底物的水解作用及其逆反應(yīng)。

A-B+H-OH

AOH+BH4.裂解酶類裂解酶類能催化有機(jī)物碳鏈的斷裂，產(chǎn)生碳鏈較短的產(chǎn)物。A-B

A+B（一）酶的分類5.異構(gòu)酶類異構(gòu)酶類能催化同分異構(gòu)化合物之間的互相轉(zhuǎn)化，即分子內(nèi)部基團(tuán)的重新排列。

A

A′6.合成酶類合成酶類能催化有三磷酸腺苷(ATP)參加的合成反應(yīng)。這類酶關(guān)系著許多重要生命物質(zhì)的合成。

A+B+ATP

A-B+ADP+Pi（二）酶的命名

根據(jù)酶學(xué)委員會(huì)的建議，每一種酶都給以兩個(gè)名稱，一個(gè)是系統(tǒng)名，一個(gè)是慣用名。系統(tǒng)名可確切地表明底物的化學(xué)本質(zhì)及酶的催化性質(zhì)，因此，它包括兩部分，底物名稱和反應(yīng)類型，并用“：”分開來表示。如L-乳酸：NAD氧化還原酶(EC1.1.1.27)。慣用名比較簡(jiǎn)短，亦常以酶所作用的底物及反應(yīng)類型命名，但不夠嚴(yán)格。如乳酸脫氫酶是催化乳酸生成丙酮酸的反應(yīng)，但事實(shí)上它包括兩種酶：L-乳酸：NAD氧化還原酶(EC1.1.1.27)。催化水解作用的酶的慣用名常省去反應(yīng)類型，如水解蛋白質(zhì)的叫蛋白酶，水解淀粉的叫淀粉酶。（二）酶的命名

此外，尚有以下兩種分類常被人們所采用：①大多數(shù)酶存在于細(xì)胞內(nèi)，在細(xì)胞內(nèi)起催化作用，這類酶稱為胞內(nèi)酶。存在于細(xì)胞外的酶稱為胞外酶。胞外酶能透過細(xì)胞膜，作用于細(xì)胞外面的物質(zhì)，主要催化復(fù)雜的有機(jī)大分子水解為簡(jiǎn)單的小分子，從而易于被微生物吸收利用。這類酶為水解酶類。②大多數(shù)微生物的酶的產(chǎn)生與底物存在與否無關(guān)。這類在微生物體內(nèi)始終都存在著的相當(dāng)數(shù)量的酶，稱為固有酶。在某些情況下，例如，受到了某種持續(xù)的物理、化學(xué)因素影響或某種生物存在，微生物會(huì)在體內(nèi)產(chǎn)生出適應(yīng)新環(huán)境的酶，這種酶稱為誘導(dǎo)酶。誘導(dǎo)酶的合成機(jī)制信息貯存于細(xì)胞DNA中，但其合成將受操縱子調(diào)控。誘導(dǎo)酶的產(chǎn)生在廢水生物處理中具有重要意義。四、酶的化學(xué)組成與重要輔酶(輔基)

1.酶的化學(xué)組成

按化學(xué)組成，酶可分為單純酶和結(jié)合酶兩種。（1）單純酶（單成分酶）這類酶完全由蛋白質(zhì)組成，酶蛋白本身就具有催化活性。這類酶大多可以分泌到細(xì)胞外，作為胞外酶，催化水解作用。（2）結(jié)合酶（雙成分酶、全酶）這類酶由酶蛋白和非蛋白兩部分構(gòu)成。非蛋白部分又稱為酶的輔因子。酶蛋白必須與酶的輔因子結(jié)合才具有催化活性。全酶（結(jié)合酶）＝酶蛋白＋輔因子（輔酶或輔基）輔因子通常是對(duì)熱穩(wěn)定的金屬離子或有機(jī)小分子（如維生素）。與酶蛋白結(jié)合較疏松的稱為輔酶，結(jié)合較緊密的稱為輔基。酶的活性中心酶的活性中心決定了酶的催化作用的特性。所謂酶的活性中心是酶蛋白分子中，由必需基團(tuán)所組成的、具有一定空間結(jié)構(gòu)的活性區(qū)域。在酶的活性中心內(nèi)，必需基團(tuán)有兩種：結(jié)合基團(tuán)和催化基團(tuán)。這兩個(gè)基團(tuán)構(gòu)成兩個(gè)功能部分：結(jié)合基團(tuán)部位與底物起結(jié)合作用，特定的底物靠此部位結(jié)合到酶分子上；酶的催化作用發(fā)生在酶的活性中心部位，所以，酶催化作用的特異性就必然與活性中心結(jié)構(gòu)有關(guān)?；钚灾行牡慕Y(jié)合基團(tuán)是行使識(shí)別底物，并且與底物進(jìn)行特異性結(jié)合功能的；然而催化基團(tuán)的催化作用必須在結(jié)合基團(tuán)完成了它的結(jié)合功能，并判明是否為所催化底物后才有可能發(fā)生。由此不難看出，酶催化作用的特異性實(shí)質(zhì)上就是結(jié)合基團(tuán)和催化基團(tuán)的特異性。催化基團(tuán)部位則催化化學(xué)反應(yīng)，底物的某種化學(xué)鍵在此部位上被打斷或在此部位上形成新的化學(xué)鍵，從而發(fā)生一定的化學(xué)變化。此外，還有活性中心外必需基團(tuán)，這種基團(tuán)起著維持活性中心構(gòu)型的作用。酶活性中心是酶催化作用的關(guān)鍵部位，當(dāng)酶的活性中心被非底物物質(zhì)占據(jù)或空間構(gòu)型被破壞，酶也就失去了催化活性。

2.重要的輔酶(輔基)

(1)轉(zhuǎn)移氫的輔酶①NAD（輔酶Ⅰ）和NADP（輔酶Ⅱ），NAD為煙酰胺腺嘌呤二核苷酸，NADP為煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸，存在于幾乎一切細(xì)胞中，是許多脫氫酶的輔酶?？芍苯优c底物脫氫過程相耦聯(lián)，參與各種底物脫氫作用。+2HNAD(P)H+H+NAD(P)+-2H2.重要的輔酶(輔基)

②FAD（黃素腺嘌呤二核苷酸）和FMN（黃素單核苷酸），F(xiàn)AD與NAD類似，能直接參與底物脫氫，但僅作為琥珀酸脫氫酶等少數(shù)酶的輔酶，參與琥珀酸等脫氫過程。FAD和FMN均是電子傳遞體系（包括呼吸鏈）的組成部分。

③輔酶Q（CoQ）又稱泛醌，在電子傳遞系統(tǒng)中作為氫的中間傳遞體。+2HFADH2

FAD-2H2.重要的輔酶(輔基)

(2)．轉(zhuǎn)移電子的輔酶①含鐵卟啉的細(xì)胞色素類（簡(jiǎn)寫Cyt．）和鐵氧還蛋白（Ferredoxin，簡(jiǎn)寫Fd）通過鐵離子的變價(jià)（Fe2＋Fe3＋＋e）傳遞電子。②輔酶F420,是產(chǎn)甲烷菌所特有的輔酶F420為低分子量的熒光化合物，其氧化態(tài)在420nm處出現(xiàn)最大吸收峰和熒光，還原態(tài)的吸收峰和熒光消失。F420的功能是作為電子載體，類似于鐵氧還蛋白，反應(yīng)中與NADP＋的氧化還原耦聯(lián)，作為氫化酶、甲酸脫氫酶、一氧化碳脫氫酶及NADP＋還原酶等的輔酶。

2.重要的輔酶(輔基)

(3)轉(zhuǎn)移基團(tuán)的輔酶輔酶A（CoA或CoA－SH）生物素屬B族維生素四氫葉酸（輔酶F，THFA）輔酶M（CoM，HS－CoM）F430因子（輔酶F430，F(xiàn)430）磷酸腺苷及其它核苷酸類如：AMP（－磷酸腺苷）、ADP（二磷酸腺苷）、ATP（三磷酸腺苷），其它核苷酸類有GTP（鳥嘌呤核苷三磷酸）五、酶作用的基本原理

中間產(chǎn)物學(xué)說

酶能降低化學(xué)反應(yīng)的活化能閾，最適宜的解釋是中間產(chǎn)物學(xué)說。

SP

底物產(chǎn)物中間產(chǎn)物學(xué)說認(rèn)為，酶在催化某一反應(yīng)時(shí)，首先是酶（E）與底物（S）結(jié)合成一個(gè)不穩(wěn)定的中間產(chǎn)物（ES），也稱中間絡(luò)和物，然后ES再分解成產(chǎn)物（P），并釋放出原來的酶（E）。此過程可用下列方程式表示：

由于中間產(chǎn)物（ES）的形成，可使反應(yīng)的活化能閾大為降低，所以只需較低的活化能，反應(yīng)就能迅速進(jìn)行。

五、酶作用的基本原理

誘導(dǎo)契合學(xué)說

過去有人認(rèn)為，酶與底物結(jié)合時(shí)，酶的活性中心結(jié)構(gòu)與底物結(jié)構(gòu)必須相互吻合，就像鎖和鑰匙那樣結(jié)合成中間產(chǎn)物，進(jìn)而促進(jìn)底物轉(zhuǎn)變?yōu)楫a(chǎn)物。此即所謂酶作用的鎖鑰學(xué)說。此學(xué)說的缺點(diǎn)在于認(rèn)為酶的結(jié)構(gòu)是固定不變的。

近年來發(fā)現(xiàn)，酶的活性中心結(jié)構(gòu)與底物原本并非恰巧吻合，只當(dāng)?shù)孜锓肿优c酶分子相接觸時(shí)，可誘導(dǎo)酶的活性中心結(jié)構(gòu)發(fā)生構(gòu)象改變，從而與底物結(jié)構(gòu)吻合，然后才結(jié)合成中間產(chǎn)物，進(jìn)而引起底物發(fā)生相應(yīng)的化學(xué)反應(yīng)。此即所謂酶作用的誘導(dǎo)契合學(xué)說。六、酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)

酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)是研究酶的反應(yīng)速度以及決定反應(yīng)速度的各種因素。這些因素主要包括：酶的濃度、底物的濃度、pH值、溫度、抑制劑和激活劑等。在一定條件下，當(dāng)?shù)孜餄舛茸銐虼蟛橐欢ㄖ担笣舛认鄬?duì)較低時(shí)，酶濃度與反應(yīng)速度成正比，這種關(guān)系是測(cè)定酶活力的基礎(chǔ)。

1.米－門方程式Michaelis和Menten根據(jù)中間產(chǎn)物學(xué)說推導(dǎo)了能夠表示整個(gè)反應(yīng)中底物濃度與反應(yīng)速度關(guān)系的方程式，稱為米－門方程式。式中v——酶促反應(yīng)的（初）速度；

Vm——最大反應(yīng)速度；

S——底物濃度；

Km——米氏常數(shù)。2.米氏常數(shù)（Km）的意義

Km是反應(yīng)速度為最大反應(yīng)速度一半時(shí)的底物濃度。因?yàn)椋?dāng)v＝1/2Vm時(shí)，Km

＝S。米氏常數(shù)的單位為濃度單位。米氏常數(shù)是酶的特征性物理常數(shù)，它只與酶的性質(zhì)和它所催化的底物種類有關(guān)，而與酶濃度無關(guān)，所以一種酶在一定條件下對(duì)某一底物只有一個(gè)特定的Km值，因而Km值可作為鑒別酶的一種手段。

1／Km可近似地表示酶對(duì)底物親和力的大小，1／Km愈大，表明親和力愈大，反應(yīng)速度愈快；反之，親和力愈小,反應(yīng)速度愈慢。 七、酶促反應(yīng)的影響因素1.酶濃度對(duì)反應(yīng)速度的影響在酶濃度不變的條件下，底物濃度〔S〕與反應(yīng)速度v的相互關(guān)系。在低的底物濃度時(shí)，底物濃度增加，反應(yīng)速度隨之急劇增加，并成正比關(guān)系。當(dāng)?shù)孜餄舛容^高時(shí)，增加底物濃度，反應(yīng)速度增加的程度不再明顯，并且不再成正比關(guān)系。當(dāng)?shù)孜镞_(dá)到一定濃度后，若底物濃度再增加，則反應(yīng)速度將趨于恒定，并不再受底物濃度的影響，此時(shí)底物的濃度稱為飽和濃度。當(dāng)?shù)孜餄舛鹊扔诨虼笥陲柡蜐舛群蠓磻?yīng)速度不再增加的原因，是由于此時(shí)酶的活性中心全部為底物所占據(jù)（即達(dá)到飽和），酶分子已發(fā)揮了最大能力，所以即使底物再增加，反應(yīng)速度也不可能提高。七、酶促反應(yīng)的影響因素2.溫度對(duì)酶促反應(yīng)速度的影響酶對(duì)溫度具有高度敏感性是酶最重要的特性之一。每一種酶，在一定條件下，只有在某一個(gè)溫度下才表現(xiàn)出最大活力，這個(gè)溫度稱為該酶作用的最適溫度。各種酶在一定條件下，都有它的最適溫度。溫度對(duì)酶活性有雙重影響。①酶反應(yīng)速度在一定范圍（0℃—40℃）內(nèi)，隨著溫度升高而加快；②酶是蛋白質(zhì)，隨著溫度升高，酶變性速度加快。七、酶促反應(yīng)的影響因素

3.pH值對(duì)酶促反應(yīng)速度的影響

酶的基本成分是蛋白質(zhì)，是具有離解基團(tuán)的兩性電解質(zhì)，因此酶只有在一定的pH值范圍中才是穩(wěn)定的，高于或低于這個(gè)pH值范圍，酶就不穩(wěn)定，易變性失活。此外，pH值還能影響酶分子的活性中心上有關(guān)基團(tuán)的解離或底物的解離，這樣就影響了酶與底物的結(jié)合，從而影響酶的活性。一般認(rèn)為最適宜pH值時(shí)，酶分子上活性基團(tuán)的解離狀態(tài)最適合與底物結(jié)合，改變pH值時(shí)，就使酶與底物的結(jié)合能力降低。例如，胃蛋白酶只能作用于蛋白質(zhì)正離子，而胰蛋白酶則只能分解蛋白質(zhì)負(fù)離子，所以胃蛋白酶和胰蛋白酶的最適pH值分別在此等電點(diǎn)偏酸和偏堿的一邊。廢水生物處理中應(yīng)保持pH值在6－9之間，最適pH值為6－8。七、酶促反應(yīng)的影響因素

４激活劑對(duì)酶促反應(yīng)速度的影響酶反應(yīng)體系中可因加入某些無機(jī)離子使酶的活性增加，這類物質(zhì)稱為激活劑。激活劑可能是酶活性部位中的組成成分。例如，純唾液淀粉酶的活性極低，當(dāng)加入少量NaCl，則酶活性大大提高，因此我們說NaCl（更加確切地說是Cl-1）就是唾液淀粉酶的激活劑。在廢水生物處理中，常采用測(cè)定脫氫酶活性的方法來研究溫度的影響及廢水的可生化性。脫氫酶是微生物分解氧化有機(jī)物的重要參與者，它對(duì)溫度、抑制劑等環(huán)境因素非常敏感，因此常作為研究溫度等因素對(duì)廢水生物降解影響以及工業(yè)廢水毒性的手段。

七、酶促反應(yīng)的影響因素５．抑制劑的影響抑制作用可分為兩大類：

(1)不可逆抑制作用這類抑制劑與酶的某些基團(tuán)以共價(jià)鍵方式結(jié)合，結(jié)合后不能自發(fā)分解，不能用透析或超濾等物理方法除去抑制劑而恢復(fù)酶活性。例如，含汞、含砷的有機(jī)物是含巰基活性基團(tuán)的巰基酶的不可逆抑制劑。

(2)可逆抑制作用這類抑制劑與酶的結(jié)合是可逆的，結(jié)合后可用物理方法除去抑制劑而恢復(fù)酶活性。這種結(jié)合往往是非共價(jià)鍵的結(jié)合?？赡嫘砸种苿┛煞譃閮深悾?/p>

①競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑這類抑制劑的化學(xué)構(gòu)造與底物的很相似，所以與底物共同競(jìng)爭(zhēng)酶的活性中心，妨礙了底物與酶結(jié)合形成中間產(chǎn)物，致使酶的活性受到抑制。競(jìng)爭(zhēng)性抑制的特點(diǎn)是：當(dāng)?shù)孜餄舛仍黾訒r(shí)，抑制劑的抑制作用就減弱?？梢娨种谱饔玫膹?qiáng)弱取決于抑制劑濃度與底物濃度的相對(duì)比例。②非競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑有些抑制劑不是與底物競(jìng)爭(zhēng)同一酶的活性中心，而是與酶的其它部位（如活性中心外的必需基團(tuán)-SH）進(jìn)行可逆性結(jié)合，從而改變了酶活性中心的空間構(gòu)型，使酶的活性受到抑制，稱為非競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用。其抑制特點(diǎn)是：不能通過增加底物濃度而減弱抑制作用。這種抑制作用的強(qiáng)弱取決于抑制劑的濃度以及抑制劑與酶的親和力，而與底物濃度無關(guān)。

第二節(jié)酶工程的研究?jī)?nèi)容

一、定義酶工程：是利用酶的催化作用進(jìn)行物質(zhì)轉(zhuǎn)化（合成有用物質(zhì)、分解有害物質(zhì)）的技術(shù)，是將酶學(xué)理論與化工技術(shù)結(jié)合而形成的新技術(shù)．二、研究?jī)?nèi)容酶的生產(chǎn)酶的分離純化酶分子修飾酶固定化酶反應(yīng)動(dòng)力學(xué)酶反應(yīng)器酶的應(yīng)用三、與現(xiàn)代生物技術(shù)相結(jié)合的新的研究方向

a．開發(fā)生產(chǎn)各類酶制劑，即酶的分離、純化、大批量生產(chǎn)及新酶的開發(fā)。

b．將酶或者含酶的細(xì)胞組織進(jìn)行固定化的技術(shù)，以及利用固定化的酶(或細(xì)胞)進(jìn)行生產(chǎn)、催化反應(yīng)等的應(yīng)用技術(shù)。

c．酶分子的修飾技術(shù)；酶分子的人工設(shè)計(jì)、合成研究以及酶生產(chǎn)中基因工程技術(shù)的應(yīng)用。

d．根據(jù)化工生產(chǎn)、臨床診斷、環(huán)境檢測(cè)等實(shí)際需要與計(jì)算機(jī)技術(shù)結(jié)合，研究開發(fā)新型的酶生物反應(yīng)器、生物傳感器、生物芯片等現(xiàn)代生物技術(shù)器件。第三節(jié)酶生產(chǎn)與酶分離純化一、酶的生產(chǎn)與制造1.獲得酶的途徑：化學(xué)合成:是20世紀(jì)60年代末出現(xiàn)的一種生產(chǎn)酶的新技術(shù),目前仍然停留在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)合成的階段。生物合成：生物體內(nèi)提取:它采用各種技術(shù)，直接從動(dòng)植物或微生物的細(xì)胞或組織中將酶提取出來。微生物發(fā)酵制取酶:20世紀(jì)50年代以來生產(chǎn)酶的主要方法2.微生物發(fā)酵的優(yōu)點(diǎn)①種類繁多、酶系完整②可以獲得高產(chǎn)菌株③微生物繁殖快、生產(chǎn)周期短④成本低

(一)優(yōu)良產(chǎn)酶菌種的特點(diǎn)一個(gè)優(yōu)良的產(chǎn)酶菌種應(yīng)具備以下幾點(diǎn)：(1)繁殖快，產(chǎn)酶量高，有利于縮短生產(chǎn)周期。(2)能在便宜的底物上良好生長(zhǎng)。(3)產(chǎn)酶性能穩(wěn)定，菌株不易退化，不易受噬菌體侵襲。(4)產(chǎn)生的酶容易分離純化。(5)不是致病菌及產(chǎn)生有毒物質(zhì)或其他生理活性物質(zhì)的微生物，才能確保酶生產(chǎn)和應(yīng)用的安全。二、酶的發(fā)酵生產(chǎn)1.優(yōu)良產(chǎn)酶菌種的篩選(二)優(yōu)良產(chǎn)酶菌種的篩選方法產(chǎn)酶菌種的篩選方法與發(fā)酵工程中微生物的篩選方法一致，主要包括以下幾個(gè)步驟：含菌樣品的采集，菌種分離，產(chǎn)酶性能測(cè)定及復(fù)篩等。1.胞外酶的產(chǎn)酶菌株的篩選方法2.胞內(nèi)酶的產(chǎn)酶菌株的篩選方法如果是胞內(nèi)酶，則可采用以下兩種方法來確定：(1)固體培養(yǎng)法把菌種接入固體培養(yǎng)基中，保溫?cái)?shù)天，用水或緩沖液浸泡培養(yǎng)基，將酶抽提，測(cè)定酶活力，這種方法主要適用于霉菌；(2)液體培養(yǎng)法將菌種接入液體培養(yǎng)基后，靜置或在搖床亡振蕩培養(yǎng)一段時(shí)間(視菌種而異)，再測(cè)定培養(yǎng)物中酶的活力，通過比較，篩選出產(chǎn)酶性能較高的菌種供復(fù)篩使用。微生物酶的發(fā)酵生產(chǎn)是指在人工控制的條件下，有目的地利用微生物培養(yǎng)來生產(chǎn)所需的酶，其技術(shù)包括培養(yǎng)基和發(fā)酵方式的選擇及發(fā)酵條件的控制管理等方面的內(nèi)容。(一)培養(yǎng)基由于酶是蛋白質(zhì)，酶的形成也是蛋白質(zhì)的合成過程，因此微生物產(chǎn)酶的培養(yǎng)基要有利于蛋白質(zhì)的合成。1.碳源是微生物細(xì)胞生命活動(dòng)的基礎(chǔ)，是合成酶的主要原料之一。2.氮源氮源可分為有機(jī)氮和無機(jī)氮，選用何種氮源因微生物或酶種類的不同而異。3.無機(jī)鹽類應(yīng)特別注意有些金屬離子是酶的組成成分4.生長(zhǎng)因子生長(zhǎng)因子是指細(xì)胞生長(zhǎng)必需的微量有機(jī)物，如維生素、氨基酸、嘌呤堿、嘧啶堿等。5.培養(yǎng)基的pH值在配制培養(yǎng)基時(shí)應(yīng)根據(jù)微生物的需要調(diào)節(jié)pH值。2.微生物酶的發(fā)酵生產(chǎn)(二)酶的發(fā)酵生產(chǎn)方法酶的發(fā)酵生產(chǎn)方式有兩種，一種是固體發(fā)酵，另一種是液體深層發(fā)酵。固體發(fā)酵法主要是用于真菌來源的商業(yè)酶生產(chǎn)，其中用米曲霉生產(chǎn)淀粉酶，以及用曲霉和毛霉生產(chǎn)蛋白酶在中國(guó)和日本已有悠久的歷史?，F(xiàn)在大多數(shù)的酶是通過液體深層發(fā)酵培養(yǎng)生產(chǎn)的。液體深層培養(yǎng)應(yīng)注意控制以下條件：1.溫度一般情況下產(chǎn)酶溫度低于生長(zhǎng)溫度；2.通氣和攪拌為提高氧氣的溶解度，應(yīng)對(duì)培養(yǎng)液加以適當(dāng)?shù)耐夂蛿嚢瑁?.pH的控制在發(fā)酵過程中要密切注意控制培養(yǎng)基pH值的變化。有些微生物能同時(shí)產(chǎn)生幾種酶，可以通過控制培養(yǎng)基的pH值以影響各種酶之間的比例，例如當(dāng)利用米曲霉生產(chǎn)蛋白時(shí)，提高pH值有利于堿性蛋白酶的形成，降低pH值則主要產(chǎn)生酸性蛋白酶。(三)提高酶產(chǎn)量的措施在酶的發(fā)酵生產(chǎn)過程中，為了提高酶的產(chǎn)量，除了選育優(yōu)良的產(chǎn)酶細(xì)胞外，還可以采用一些與酶發(fā)酵工藝有關(guān)的措施，例如添加誘導(dǎo)物、控制阻遏物濃度等。

1.添加誘導(dǎo)物對(duì)于誘導(dǎo)酶的發(fā)酵生產(chǎn)，在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加誘導(dǎo)物能使酶的產(chǎn)量顯著增加。2.降低阻遏物濃度可采用難于利用的碳源，或采用分次添加碳源的方法使培養(yǎng)基中的碳源保持在不致于引起分解代謝物阻遏的濃度。3.表面活性劑有些表面活性劑對(duì)酶分子有—定的穩(wěn)定作用，可以提高酶的活力。4.添加產(chǎn)酶促進(jìn)劑產(chǎn)酶促進(jìn)劑是指那些能提高酶產(chǎn)量但作用機(jī)理尚未闡明的物質(zhì)。它可能是酶的激活劑或穩(wěn)定劑，也可能是產(chǎn)酶微生物的生長(zhǎng)因子，或有害金屬的螯合劑。第二節(jié)酶的分離純化

酶的種類繁多，性質(zhì)各異，分離純化方法不盡相同，即便是同一種酶，也因其來源不同、酶的用途不同，而使分離純化的步驟不一樣。由于酶很不穩(wěn)定，在提取時(shí)容易變性失活，因而提取酶時(shí)應(yīng)注意：(1)溫度。整個(gè)提純操作應(yīng)盡可能在低溫下(0～4℃)進(jìn)行，以防止蛋白水解酶對(duì)目的酶的破壞作用(尤其是在有機(jī)溶劑或無機(jī)鹽存在下更應(yīng)注意)。(2)pH值。在提純過程中一般采用緩沖液作為溶劑，防止過酸或過堿。對(duì)一特定的酶，溶劑pH值的選擇應(yīng)考慮酶的pH穩(wěn)定性以及酶的溶解度。(3)鹽濃度。因?yàn)榇蠖鄶?shù)蛋白質(zhì)具有鹽溶性質(zhì)，所以在提取過程中可選用合適濃度的鹽溶液以促進(jìn)蛋白質(zhì)溶解。但當(dāng)鹽濃度過高時(shí)，酶容易變性。(4)攪拌。劇烈攪拌容易引起蛋白質(zhì)變性，提純應(yīng)避免劇烈攪拌和產(chǎn)生泡沫。(5)酶液是微生物生長(zhǎng)的良好培養(yǎng)基，在提純過程中應(yīng)盡可能防止微生物對(duì)酶的破壞。

1.破碎細(xì)胞除了胞外酶的提取以外，所有胞內(nèi)酶均需將細(xì)胞壁破碎后方可進(jìn)一步抽提。破碎細(xì)胞有許多方法，動(dòng)植物細(xì)胞常用高速組織搗碎機(jī)和組織勻漿器破碎，而微生物細(xì)胞的破碎有機(jī)械破碎法、酶法、化學(xué)試劑法和物理破碎法等多種。

2.溶劑抽提大多數(shù)酶蛋白都可用稀酸、稀堿或稀鹽溶液浸泡抽提。選用何種溶劑和抽提條件視酶的溶解性和穩(wěn)定性而定。3.離心分離離心分離是酶分離提純中最常用的方法，主要用于除去發(fā)酵液中的菌體殘?jiān)虺樘徇^程中生成的沉淀物。4.濃縮由于發(fā)酵液或酶抽提液中酶的濃度一般都比較低，必須經(jīng)過進(jìn)—步純化以便于保存、運(yùn)輸和應(yīng)用。方法：蒸發(fā)法、超濾、膠過濾、反復(fù)凍融等5.干燥為了酶制劑的長(zhǎng)時(shí)間的運(yùn)輸、儲(chǔ)存，防止酶變性，往往需對(duì)酶進(jìn)行干燥，制成含水量較低的制品。常用的干燥方法有真空干燥、冷凍干燥、噴霧干燥等。一、酶制劑的制備(一)根據(jù)酶分子大小和形狀的分離方法1.離心分離；2.差速離心和等密度梯度離心分離；３.凝膠過濾；４.透析與超濾(二)根據(jù)酶分子電荷性質(zhì)的分離方法1.離子交換層析；2.層析聚焦；3.電泳；4.等電聚焦電泳(三)根據(jù)酶分子專一性結(jié)合的分離方法１.親和層析；２.免疫吸附層析；３.染料配體親和層析；４.共價(jià)層析(四)根據(jù)分配系數(shù)的分離方法二、酶的純化與精制三、酶的純度與酶活力所謂純酶是相對(duì)的而不是絕對(duì)的，即使得到結(jié)晶，也未見得是單一的酶蛋白，因?yàn)榈鞍椎幕旌衔镆矔?huì)結(jié)晶。酶的純度可用酶的比活力來衡量，比活力是以每毫克蛋白所具有的酶活力單位數(shù)。酶的比活力隨酶的純度的提高而提高。酶的保存條件的選擇必須有利于維護(hù)酶天然結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，保存酶應(yīng)注意：

１.溫度酶的保存溫度一般在０～４℃。２.緩沖液大多數(shù)酶在特定的pH值范圍內(nèi)穩(wěn)定，偏離這個(gè)范圍便支會(huì)失活。３.氧防護(hù)由于巰基等酶分子基團(tuán)或Fe-S中心等容易為分子氧所氧化，故這類酶應(yīng)加巰基保護(hù)劑或在氬或氮?dú)庵斜４?。?蛋白質(zhì)的濃度及純度一般地說，酶的濃度越高，酶越穩(wěn)定，制備成晶體或干粉更有利于保存。此外，還可通過加入酶的各種穩(wěn)定劑如底物、輔酶、無機(jī)離子等來加強(qiáng)酶穩(wěn)定性，延長(zhǎng)酶的保存時(shí)間。四、酶制劑的保存第三節(jié)酶分子的改造

改變酶特性有兩種主要的主法。一是通過分子修飾的方法來改變已分離出來的天然酶的結(jié)構(gòu)；二是通過生物工程方法改造編碼酶分子的基因從而達(dá)到改造酶的目的。一、酶分子修飾

酶分子修飾是指通過主鏈的剪接切割和側(cè)鏈的化學(xué)修飾對(duì)酶分子進(jìn)行改造。方法1.金屬離子置換修飾2.大分子修飾3.肽鏈的有限水解修飾4.酶蛋白側(cè)鏈基團(tuán)修飾5.氨基酸置換修飾對(duì)自然酶的化學(xué)結(jié)構(gòu)進(jìn)行修飾以改善酶的性能的方法很多，例如，

1.α-淀粉酶一般有Ca2+、Mg2+、Zn2+等金屬離子，屬于雜離子型，若通過離子置換法將其他離子都換成Ca2+，則酶的活性提高3倍，穩(wěn)定性也大大增加；2.胰凝乳蛋白酶與水溶性大分子化合物右旋糖酐結(jié)合，酶的空間結(jié)構(gòu)發(fā)生某些細(xì)微改變，使其催化活力提高4倍；3.抗白血病藥物天冬酰的游離氨作用、配化反應(yīng)進(jìn)行修飾后，該酶在血漿中的穩(wěn)定性得到很大的提高。

二、生物酶工程

1.生物酶工程主要包括三方面內(nèi)容：①用基因工程技術(shù)大量生產(chǎn)酶。②修飾酶基因，產(chǎn)生遺傳修飾。③設(shè)計(jì)出新酶基因，合成自然界從未有過的酶。2.調(diào)控機(jī)制在轉(zhuǎn)錄、翻譯等各種水平上進(jìn)行調(diào)控

(1)誘導(dǎo)；(2)阻遏

普遍認(rèn)同的調(diào)節(jié)機(jī)制是操縱子模型。操縱子模型

要構(gòu)建一個(gè)具有良好產(chǎn)酶性能的菌株，必須具備良好的宿主——載體，一個(gè)理想的宿主應(yīng)具備以下幾個(gè)特性：(1)所希望的酶占細(xì)胞總蛋白量的比例要高，能以活性形式分泌；(2)菌體容易大規(guī)模培養(yǎng)，生長(zhǎng)無特殊要求，且能利用廉價(jià)的原料；(3)載體與宿主相容，克隆酶基因的載體能在宿主中穩(wěn)定維持；(4)宿主的蛋白酶盡可能少，產(chǎn)生的外源酶不會(huì)被迅速降解；(5)宿主菌對(duì)人