熒光及熒光物質免疫學檢驗教學培訓課件—*—熒光及熒光物質內容1熒光的概念指某些熒光物質在吸收一定波長激發(fā)光的能量后，使原來處于基態(tài)的電子躍遷到激發(fā)態(tài)，當其在極短時間內恢復至基態(tài)時發(fā)射出波長大于激發(fā)光波長的光。01—*—現(xiàn)有兩束光，波長分別是490nm和520nm，它們一束是用于激發(fā)熒光物質A的激發(fā)光，一束是熒光物質A發(fā)出的熒光，到底哪一束是激發(fā)光？哪一束是熒光呢？490nm520nm提問—*—熒光及熒光物質內容2Stokes位移Stokes位移=λ發(fā)射光-λ激發(fā)光發(fā)射光波長與激發(fā)光波長之差。02—*—熒光壽命長？熒光壽命短？壽命長壽命短提問—*—熒光及熒光物質內容3-1熒光壽命指熒光物質被激發(fā)后所產生的熒光衰減到一定程度時所用的時間。激發(fā)光消失，熒光現(xiàn)象消失清晰模糊—*—熒光及熒光物質內容3-2熒光淬滅熒光物質在某些理化因素（紫外線、高溫、苯胺、碘液、硝基苯和酚等）作用下，發(fā)射熒光減弱甚至消退的現(xiàn)象。紫外線高溫苯胺碘液硝基苯酚—*—熒光及熒光物質內容4-1發(fā)射光譜固定激發(fā)光波長，在不同波長下所記錄到的樣品所發(fā)射的熒光譜圖。檢測波長：最大發(fā)射峰—*—熒光及熒光物質固定檢測發(fā)射光波長，用不同波長的激發(fā)光激發(fā)樣品所記錄到的熒光譜圖。激發(fā)波長：最大吸收峰內容4-2激發(fā)光譜—*—熒光及熒光物質內容4-3熒光效率熒光物質分子將吸收的光能轉變成熒光的百分率。吸收光的光量子數(shù)（激發(fā)光強度）熒光效率=發(fā)射熒光的光量子數(shù)（熒光強度）—*—熒光色素鑭系螯合物：Eu3+等，時間分辨熒光免疫測定熒光底物其它熒光物質熒光色素最大吸收光譜（nm）最大發(fā)射光譜（nm）發(fā)光顏色異硫氰酸熒光素（FITC）490-495520-530黃綠色四乙基羅丹明（RB200）570595-600橘紅色四甲基異硫氰酸羅丹明（TRITC）550620橙紅色藻紅蛋白（PE）488575紅色藻紅蛋白-德州紅（ECD）488620橘紅色藻紅蛋白-青花苷5（PeCy5）488670紅色藻紅蛋白-青花苷7（PeCy7）488755深紅色別藻青蛋白（APC）633670紅色碘化丙啶（PI）488620橙紅色內容5熒光物質類型—*—熒光及熒光物質FITC（異硫氰酸熒光素）TRITC（四甲基異硫氰酸羅丹明）—*—兩張熒光圖片均取自熒光顯微鏡觀察的圖像，為什么與普通光學顯微鏡的白色視野不同，熒光顯微鏡觀察的視野是黑色的呢？提問熒光抗體的制備免疫學檢驗教學培訓課件—*—熒光抗體的制備熒光抗體的制備（以將FITC共價標記在抗體上為例）1、制備（1）攪拌法（標記體積大、蛋白含量高的Ab）1）杯中加入待標記純化IgG抗體溶液；2）打開磁力攪拌器，輕輕攪拌，以不起沫為準；3）10-15min內逐滴加入一定量FITC溶液；4）置于4℃攪拌6-12小時。—*—熒光抗體的制備熒光抗體的制備（以將FITC共價標記在抗體上為例）1、制備（1）攪拌法優(yōu)點：速度快、FITC用量少。缺點：非特異性熒光染色。動畫：熒光抗體制備（攪拌法）—*—提問熒光抗體的制備假如正常情況下一個抗體上標一個FITC，現(xiàn)在攪拌下一個抗體上標了4個FITC，在試驗時會影響結果嗎？—*—熒光抗體的制備熒光抗體的制備（以將FITC共價標記在抗體上為例）1、制備（2）透析法（標記體積小、蛋白含量低的抗體）1）在透析袋中裝入碳酸鹽緩沖液稀釋后的1%IgG溶液；2）配置10倍體積于1%蛋白液的0.1mg/ml的FTIC，置于燒杯中；3）將透析袋置于燒杯中，F(xiàn)ITC可進入透析袋，標記抗體；（Ab大分子，不能出透析袋）4）置于4℃，24小時。（結合緩慢、溫和，非特異熒光染色少）—*—熒光抗體的制備熒光抗體的制備（以將FITC共價標記在抗體上為例）1、制備（2）透析法優(yōu)點：標記均勻。缺點：FITC用量大。動畫：熒光抗體制備（透析法）—*—熒光抗體的制備熒光抗體的制備（以將FITC共價標記在抗體上為例）2、純化1）去除游離熒光素及降解產物→透析、凝膠過濾2）去除未結合和結合過度的熒光素Ab→陰離子交換層析法3）去除交叉反應或非期望抗體→動物肝粉吸收或固相抗原吸收—*—熒光抗體的制備熒光抗體的制備（以將FITC共價標記在抗體上為例）3、鑒定Ab效價、F/P結合率等4、保存加入0.1%NaN3或0.01%硫柳汞防腐，避免反復凍融，小袋分裝，真空干燥保存。熒光免疫分析技術免疫學檢驗教學培訓課件—*—熒光免疫分析技術熒光免疫分析技術類型（1）時間分辨熒光免疫測定（2）熒光偏振免疫測定—*—時間分辨熒光免疫測定時間分辨熒光免疫測定基本原理（1）標記物：Eu3+（長熒光物質）（2）基本思路：短壽命非特異性熒光消失后檢查長壽命特異性熒光1）非特異性熒光（背景熒光）各種組織、蛋白或其他化合物在激發(fā)光照射下都能發(fā)出一定波長的熒光（短壽命：1-20ns）2）特異性熒光鑭系元素標記的抗體與抗原發(fā)生反應后所帶來的熒光。（長壽命：10-1000μs）—*—時間分辨熒光免疫測定時間分辨熒光免疫測定—*—時間分辨熒光免疫測定時間分辨熒光免疫測定方法類型（1）雙抗體夾心法（2）固相抗體競爭法（3）固相抗原競爭法—*—時間分辨熒光免疫測定時間分辨熒光免疫測定分析儀視頻：時間分辨熒光免疫分析儀—*—時間分辨熒光免疫測定時間分辨熒光免疫測定方法學評價（1）靈敏度高：最小檢出量10-18mol/L（2）分析范圍寬：4～5個數(shù)量級（3）標記物穩(wěn)定：有效使用期長（4）測量快速，易自動化（5）易受污染，本底增高—*—時間分辨熒光免疫測定時間分辨熒光免疫測定臨床應用廣泛用于微量或超微量物質的檢測，如各種激素（肽類激素、甲狀腺激素、類固醇激素等）、蛋白質、酶、藥物、腫瘤標記物及病毒抗原等的測定。—*—熒光偏振免疫測定熒光偏振免疫測定概念是利用抗原抗體競爭反應原理，根據熒光素標記抗原與其抗原-抗體復合物之間熒光偏振程度的差異，測定液體中小分子物質的含量。免疫芯片技術免疫學檢驗教學培訓課件—*—免疫芯片技術免疫芯片技術基本原理免疫芯片是將幾個、幾十個，甚至幾萬個或更多數(shù)量的抗原（或抗體）高密度排列在固相載體上，形成高密度抗原或抗體的微點陣。與患者的少量待檢樣品或生物標本同時進行特異性免疫反應，可一次獲得芯片中所有已知抗原（或抗體）的檢測結果?！?—免疫芯片技術免疫芯片技術方法類型（1）液體芯片（2）抗體芯片（3）細胞芯片—*—免疫芯片技術免疫芯片技術方法學評價1）基于高密度抗原或抗體的微陣列技2）高通量取得生物信息3）信息量大、快速、及時、操作簡便4）所需樣品量少、生產成本低、用途廣泛5）自動化程度高等優(yōu)點?！?—免疫芯片技術免疫芯片技術臨床應用1）腫瘤標記物的檢測2）感染性疾病的檢測（如肝炎病毒、結核桿菌、幽門螺桿菌等）3）心血管疾病和自身免疫性疾病的檢測4）細胞膜表面抗原的檢測5）細胞因子的檢測、興奮劑的檢測6）高通量藥物篩選、環(huán)境和農業(yè)檢測7）食品衛(wèi)生、生物武器等方面的檢查。熒光免疫顯微技術免疫學檢驗教學培訓課件—*—熒光免疫顯微技術熒光免疫技術概念/分類概念：將抗原-抗體反應的特異性與熒光檢測技術的敏感性和直觀性相結合而建立的一種標記免疫技術。分類：熒光抗體技術（FAT）、熒光免疫分析—*—提問熒光免疫顯微技術熒光免疫顯微技術/熒光抗體技術/熒光免疫組織化學技術大家從這三個名字中能否猜出該技術用到哪種熒光試劑？標本是什么？用到哪一種檢測儀器？主要對標本中的待測物質進行定位、定性或定量？答案：熒光抗體；組織片；顯微鏡；定位、定性檢測流程：標本制備→熒光抗體染色→熒光顯微鏡檢查→熒光抗體染色結果判斷—*—熒光免疫顯微技術熒光免疫顯微技術的檢測流程1、標本制備（1）常見的臨床標本有組織、細胞和細菌三類，可制作成涂片、印片或切片（片?。唬?）制作過程中應保持抗原的完整性（不溶解、不變性、不擴散）；（3）標本片立即使用或-10℃保存（選用適當方法固定）?！?—熒光免疫顯微技術熒光免疫顯微技術的檢測流程組織切片細胞涂片細菌涂片—*—熒光免疫顯微技術熒光免疫顯微技術的檢測流程2、熒光抗體染色（1）直接法（2）間接法（3）雙標記法—*—情景設計熒光免疫顯微技術一位疑似被腦膜炎奈氏菌感染的患者，今送檢膿性腦脊液標本一份，請用熒光抗體技術檢測腦脊液中是否含有腦膜炎奈氏菌？—*—情景設計熒光免疫顯微技術準備：FITC標記的抗腦膜炎奈氏菌抗體過程：制作腦脊液涂片→滴加熒光素標記的已知抗腦膜炎奈氏菌抗體→濕盒內，25-37℃，30min（溫度不宜太高，防止熒光淬滅），洗滌→熒光顯微鏡觀察動畫：熒光免疫顯微技術檢測腦膜炎奈瑟菌—*—情景設計熒光免疫顯微技術一位疑似患系統(tǒng)性紅斑狼瘡的患者，今送檢血清標本一份，請用熒光抗體技術檢查標本內是否含有抗核抗體（主要是IgG類）？—*—情景設計熒光免疫顯微技術準備：He-2細胞（細胞核：抗原），F(xiàn)ITC標記的抗人IgG（二抗）過程：制備He-2細胞標本片→加待測血清→溫育（37℃，30min），洗滌→加FITC標記的二抗→溫育（25-37℃）或4℃過夜，洗滌→熒光顯微鏡觀察動畫：間接免疫熒光法測抗核抗體的基本過程—*—情景設計熒光免疫顯微技術外周血中的T、B淋巴細胞均屬于小淋巴細胞，瑞氏染色后不能在光學顯微鏡下分出T、B細胞，現(xiàn)有一張新鮮的血片，請用熒光抗體技術分出兩種細胞。T細胞B細胞—*—情景設計熒光免疫顯微技術準備：TRITC（橙紅色熒光）標記的抗CD3和FITC（黃綠色熒光）標記的抗CD19（T細胞特異性表面標志是CD3；B細胞特異性表面標志是CD19）抗CD3*TRITCRB200FITC抗CD19*FITC—*—情景設計熒光免疫顯微技術過程：制備血涂片→滴加TRITC標記的抗CD3和FITC標記的抗CD19→溫育（25-37℃）或4℃過夜，洗滌→熒光顯微鏡觀察結果：發(fā)橙紅色熒光的為T細胞，發(fā)黃綠色熒光的為B細胞。RB200FITC—*—熒光免疫顯微技術熒光免疫顯微技術的檢測流程3、熒光顯微鏡檢查（1）時間：最好是染色當天（防止熒光淬滅）（2）環(huán)境條件：通風良好的暗室（3）熒光顯微鏡與普通光學顯微鏡的不同之處1）光源（提供強的激發(fā)光）：高壓汞燈、氙燈、鹵素燈—*—提問熒光免疫顯微技術提供強激發(fā)光的光源熱嗎？打開光源后，光源釋放的是一個波長的光還是很多波長的光？短波長的光對人的眼睛有傷害嗎？2）濾光片：隔熱濾光片（燈室聚光鏡前，阻斷紅外線）激發(fā)濾光片（光源和物鏡之間，提供激發(fā)光）吸收濾光片（物鏡和目鏡之間，阻斷激發(fā)光，只允許熒光通過）動畫：熒光顯微鏡三種濾光片的位置和功能—*—熒光免疫顯微技術F