/金黃色葡萄球菌脈沖場凝膠電泳標準操作程序編號PN－SOP－１1執(zhí)行日期2010年12月１5日第一天1。菌懸液的制備1)在Fａlcoｎ20５４管上標記樣品名稱和空白對照，分別加入約1—２mlCＳB緩沖液。2）在1。５mｌｅppeｎｄorf管上標記好對應樣品的名稱。３）用棉棒從培養(yǎng)皿上刮取適量細菌，懸濁于ＣSB中,用ｅppenｄｏrｆ分光光度計測其ＯＤ值，調整至5.5～6.5之間。注：如果樣品數(shù)量多,調完ＯD后先存放于４℃4）取2５0μl菌懸液于相應的1．５mleｐpendｏrf管中.５)加入2μl溶葡萄球菌酶（1mg／ml）,用移液槍充分吹打。不需振蕩搖勻。2。膠塊的制備1）準備1０ml的1％SＫG(稱取0．1ｇSKG溶于ＴE,用微波爐加熱至完全溶解，放在53℃～562)取250μl預熱（53℃~５６℃)的SKG，與2５03)將混合物立即加入模具，避免產(chǎn)生氣泡，在室溫下凝固10~1５分鐘或置于4℃3。細胞的裂解1)在50ml的scｒｅw－caｐtｕbｅ上做好標記.２）配制細胞裂解液（CLＢ)，參見表1。蛋白酶K原液須放在冰上或冰盒里。表1樣本數(shù)量CLB蛋白酶K(20mg/ml）14mｌ３0μl１040mｌ3０0μｌ3)每個管子加入4ml蛋白酶Ｋ/CＬB混合液。保證膠塊在液面下而不在管壁上。4）將管子放在５4℃5）將純水和TE放在５4℃4。洗膠塊1）從水浴搖床中拿出scｒew-cap管,蓋上綠色的ｓｃreened—cａｐ，輕輕倒掉CＬB.2)每管中加入1５ｍl預熱的純水。確保膠塊在液面下而不在管壁或蓋子上，放回５4℃3）倒掉水,加入15ｍｌ預熱的TＥ，在54℃4)倒掉TE，加入5mlTE，放在4℃第二天5.膠塊內DNA的酶切1）準備30℃和3７2）按照表２,配制SmaＩ的稀釋緩沖液,混勻。注意:須帶手套操作，緩沖液和BSA置于冰上。表2試劑（Takａra)μl/膠塊μl/7膠塊μl／12膠塊純水１６0μl1120μl１920μl1０×TBuｆｆｅr2０μl140μｌ２40μlBＳA（0。1%）20140240總體積200μｌ１４00μl2４00μl3）按照表3，配置XbaＩ的稀釋緩沖液。注意：須帶手套操作，緩沖液和BSA置于冰上。表3試劑（Pｒomega）μl/膠塊μl/3膠塊純水１78μｌ53４μlBｕfferD２０μｌ60μｌBSA（１0mg/mｌ）２6總體積200μl600μl4)在每個1.5mｌeppenｄorf管中加入200μｌ稀釋緩沖液。5)用刀片切下2mm寬的膠塊放入1.5mlepｐeｎdorf管中.確保膠塊在液面下面。將剩余的膠塊放回原來的TE中.６）用同樣的方法處理標準株H9812的膠塊,放入XbａI緩沖液中.7）將XbaI管子放在37℃水浴中，ＳmaI管子放在30８）在用稀釋緩沖液孵育的過程中，按照以下的比例配制酶切緩沖液，混勻。表4試劑（Takaｒa）μｌ/膠塊μｌ/７膠塊μl/12膠塊純水155μl1085μl1860μl10×TBuｆfeｒ20μｌ１40μl2４0μlBＳＡ(０.１％）20140240SmaＩ5３560總體積200μl１4０0μｌ240０μl表５試劑（Proｍega)μl/膠塊μl/３膠塊純水1７３μｌ519μｌBｕｆｆeｒD２0μl60μlBSＡ（10ｍg/mｌ）２6XbaI515總體積200μｌ6０0μl９)孵育完，用移液槍吸出液體,吸液時槍頭應貼到管底，注意避免破壞膠塊。10)每管加入2００μl內切酶混合液，確保膠塊在液面的下面。11）將XbaI管子放在37℃，SｍaI管子放在306。制備1%膠1）稱?。保鏢KG,溶于100ml０.5×TBE緩沖液中.1５孔模具需配制１５0ｍl體積的膠。２）微波爐加熱約２分鐘,每20妙混勻,直至完全溶解。3）放在５3℃～567.加樣1）調整梳子的高度，使梳子齒與膠槽的底面相接觸。用水平儀調整膠槽使其水平。2）從3７℃3）每管加入20０μl０．5×TBＥ,用槍頭沖洗膠塊。4)把梳子平放在膠槽上,把膠塊加在梳子齒上。如果用的是10個齒的梳子，把標準菌株H9812加在第1、５、1０個齒上，若為１5個齒的梳子則放在第1、５、１0、15個齒上。5）把梳子放入膠槽，確保所有的膠塊在一條線上，并且膠塊與膠槽的底面相接觸。從膠槽的下部中央緩慢到入100ｍｌ熔化的在53℃~568.電泳:設置電泳參數(shù)。大、小膠均用此參數(shù).Iｎiｔialsｗitｃｈｔimｅ＝4。0seｃonｄsFｉnａlｓwitchtiｍe＝4０。0sｅconds14cm寬×13ｃm長的膠電泳時間為１９小時啟動“SｔaｒtＲun"第三天9.圖像的獲取1）取出膠，放在盛放40０mｌEB溶液的托盤內（EＢ儲存液濃度為10mg／ml，1:10，０00稀釋，即在400ｍl水中加入40μl儲存液）,搖３０分鐘。注意:EB是致畸劑。儲存在棕色瓶中的ＥB稀釋液可以用5次。廢棄的ＥB溶液應妥善處理。２)用純水沖洗膠即可讀取圖象。３）電泳圖像通常用BIO－ＲAD的GEＬDOC2000或其它成像系統(tǒng)來獲取。圖像需為IBM兼容的未壓縮的ＴIＦＦ格式,且分辨力≥768x640像素。1０．PFGE圖譜分析例圖１,8,１5為marker;２-１,8,１5為marker;