熒光光譜分析法課件第一頁，共八十九頁，2022年，8月28日12008年諾貝爾化學(xué)獎

下村修現(xiàn)年80歲的下村修1928年出生于日本京都府，1960年獲得名古屋大學(xué)理學(xué)博士學(xué)位后赴美，先后在美國普林斯頓大學(xué)、波士頓大學(xué)和伍茲霍爾海洋生物實驗所工作。他1962年從一種水母中發(fā)現(xiàn)了熒光蛋白，被譽為生物發(fā)光研究第一人。馬丁·沙爾菲馬丁·沙爾菲出生于1947年，現(xiàn)年61歲，是美國哥倫比亞大學(xué)生物學(xué)教授。他獲獎的主要貢獻在于向人們展示了綠色熒光蛋白作為發(fā)光的遺傳標簽的作用，這一技術(shù)被廣泛運用于生理學(xué)和醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域。瑞典皇家科學(xué)院8日宣布，美籍華裔科學(xué)家錢永健、美國生物學(xué)家馬丁·沙爾菲和日本有機化學(xué)家兼海洋生物學(xué)家下村修共同獲得2008年度諾貝爾化學(xué)獎，將均分1000萬瑞典克朗（約合140萬美元）獎金。幫助他們獲獎的是綠色熒光蛋白。這種蛋白為生物與醫(yī)學(xué)實驗帶來革命，它發(fā)出的熒光像一盞明燈，幫助研究人員照亮生命體在分子層面和細胞層面的諸多反應(yīng)。

由于綠色熒光蛋白用紫外線一照就發(fā)出鮮艷綠光，研究人員將綠色熒光蛋白基因插入動物、細菌或其他細胞的遺傳信息之中，讓其隨著這些需要跟蹤的細胞復(fù)制，可“照亮”不斷長大的癌癥腫瘤、跟蹤阿爾茨海默氏癥對大腦造成的損害、觀察有害細菌的生長，或是探究老鼠胚胎中的胰腺如何產(chǎn)生分泌胰島素的β細胞。第二頁，共八十九頁，2022年，8月28日2第三頁，共八十九頁，2022年，8月28日3用熒光抗體染色之原生動物澳大利亞科學(xué)家最新發(fā)現(xiàn)，一種叫“螳螂蝦”的海里動物通過發(fā)出色彩鮮艷的熒光來恐嚇警告敵對者或者吸引性配偶，

第四頁，共八十九頁，2022年，8月28日4K.Brejcet.al.,PNAS94(1997)23061nmgreen-fluorescentprotein(GFP)第五頁，共八十九頁，2022年，8月28日5第五章熒光分析法第一節(jié)熒光分析法的基本原理第二節(jié)熒光定量分析方法第三節(jié)熒光分光光度計第六頁，共八十九頁，2022年，8月28日6某些物質(zhì)受到光照射，除吸收某種波長的光之外，發(fā)射出比原來所吸收光的波長更長的光——光致發(fā)光（二級光）。光致發(fā)光√熒光fluorescence磷光phosphorescence熒光分析法是根據(jù)物質(zhì)的熒光譜線的位置及其強度進行物質(zhì)鑒定和含量測定的儀器方法。

第七頁，共八十九頁，2022年，8月28日7分子熒光分析的特點：靈敏度高：一般紫外一可見分光光度法的檢出限約為10-7g/ml，而熒光分析法的檢出限可達到10-10甚至10-12

g/ml。選擇性好線性范圍寬應(yīng)用范圍窄第八頁，共八十九頁，2022年，8月28日8第一節(jié)熒光分析法的基本原理1.分子熒光的產(chǎn)生一、分子熒光molecularfluorescence★分子能級比原子能級復(fù)雜★在分子體系中，每個電子能級上都存在振動、轉(zhuǎn)動能級★室溫下大多數(shù)分子處于基態(tài)的最低振動能層★在基態(tài)時，含有偶數(shù)個電子的分子，電子的ms為+1/2和-1/2,s=0，M=1。則該分子所處的電子能態(tài)稱為基態(tài)單重態(tài),用符號S0表示第九頁，共八十九頁，2022年，8月28日9分子吸收輻射后電子被激發(fā)且不發(fā)生自旋方向的改變ms為+1/2和-1/2,s=0，M=1。則該分子所處的電子能態(tài)稱為激發(fā)單重態(tài),用符號S表示。（S1S2S3…）電子被激發(fā)且伴隨著自旋方向的改變ms為+1/2和+1/2,s=1，M=3。則該分子所處的電子能態(tài)稱為激發(fā)三重態(tài),用符號T表示。（T1T2T3…）S0第十頁，共八十九頁，2022年，8月28日10

小結(jié)：分子能級與躍遷

基態(tài)(S0)→激發(fā)態(tài)：吸收特定頻率的輻射；量子化；躍遷一次到位；激發(fā)態(tài)→基態(tài)：多種途徑和方式(見能級圖)；速度最快、激發(fā)態(tài)壽命最短的途徑占優(yōu)勢，發(fā)生的幾率大；第一、第二、…電子激發(fā)單重態(tài)S1、S2…

；第一、第二、…電子激發(fā)三重態(tài)T1、T2…

；電子能級的多重性M=2S+1

平行自旋比成對自旋穩(wěn)定(洪特規(guī)則)，三重態(tài)能級比相應(yīng)單重態(tài)能級低；大多數(shù)有機分子的基態(tài)處于單重態(tài)；第十一頁，共八十九頁，2022年，8月28日11S0→S1、S2

允許躍遷；S0→T1、T2禁阻躍遷；通過其他途徑進入(見能級圖)；進入的幾率小；

小結(jié)：激發(fā)單重態(tài)與激發(fā)三重態(tài)的不同√

激發(fā)單重態(tài)分子中沒有凈電子自旋，因而具有反磁性；激發(fā)三重態(tài)有2個自旋平行電子，是順磁性的

激發(fā)單重態(tài)分子平均壽命短（10-8~10-6s），而激發(fā)三重態(tài)的長（10-4~10s）基態(tài)單重態(tài)到激發(fā)單重態(tài)的激發(fā)，不涉及電子自旋方向的改變而容易發(fā)生，屬于允許躍遷；而到激發(fā)三重態(tài)屬于禁阻躍遷第十二頁，共八十九頁，2022年，8月28日12S2S1S0T1吸收發(fā)射熒光發(fā)射磷光系間跨越內(nèi)轉(zhuǎn)換振動弛豫能量l2l1l

4

外轉(zhuǎn)換l

3T2內(nèi)轉(zhuǎn)換振動弛豫第十三頁，共八十九頁，2022年，8月28日13激發(fā)態(tài)→基態(tài)的能量傳遞途徑√

電子處于激發(fā)態(tài)是不穩(wěn)定狀態(tài)，返回基態(tài)時，通過輻射躍遷(發(fā)光)和無輻射躍遷等方式失去能量；熒光延遲熒光磷光輻射躍遷無輻射躍遷傳遞途徑內(nèi)轉(zhuǎn)移外轉(zhuǎn)移系間跨越振動弛豫熒光：10-7～10-9s，第一激發(fā)單重態(tài)的最低振動能級→基態(tài)磷光：10-4～10s；

第一激發(fā)三重態(tài)的最低振動能級→基態(tài)第十四頁，共八十九頁，2022年，8月28日14輻射和非輻射能量傳遞過程√振動弛豫：同一電子能級中，以熱能量交換形式由高振動能層至低相鄰振動能層間的躍遷。發(fā)生振動弛豫的時間10-12s內(nèi)轉(zhuǎn)換：相同多重態(tài)的電子能級間的等能級的無輻射躍遷。通過內(nèi)轉(zhuǎn)換和振動弛豫，高激發(fā)單重態(tài)的電子躍回第一激發(fā)單重態(tài)的最低振動能級。發(fā)生內(nèi)轉(zhuǎn)換的時間10-13s。熒光發(fā)射：電子由第一激發(fā)單重態(tài)的最低振動能層→基態(tài)(熒光多為S1→S0躍遷)，發(fā)射波長為3的熒光，10-7~10-9s。

發(fā)射熒光的能量比分子吸收的能量小，波長長：

3>2>1；第十五頁，共八十九頁，2022年，8月28日15系間跨越：激發(fā)態(tài)的電子發(fā)生自旋反轉(zhuǎn)而使分子的多重性發(fā)生變化的非輻射躍遷。禁阻躍遷，但當(dāng)能層有較大重疊時S1T1就可發(fā)生系間跨越，通過自旋—軌道耦合進行。10-6s外轉(zhuǎn)換：激發(fā)態(tài)分子與溶劑或其他溶質(zhì)分子之間碰撞引起的轉(zhuǎn)移能量的非輻射躍遷。常發(fā)生在S1或T1S0外轉(zhuǎn)換使熒光或磷光減弱或“猝滅”。

磷光發(fā)射：電子由第一激發(fā)三重態(tài)的最低振動能級→基態(tài)(T1→S0躍遷)；發(fā)光速度很慢：10-4~100s、磷光的能量比熒光小電子由S0進入T1的過程：（S0→T1禁阻躍遷）

S0→激發(fā)→振動弛豫→內(nèi)轉(zhuǎn)移→系間跨越→振動弛豫→T1光照停止后，可持續(xù)一段時間第十六頁，共八十九頁，2022年，8月28日162.熒光的激發(fā)光譜與熒光光譜excitationspectrumandfluorescencespectrum（1）熒光的激發(fā)光譜

激發(fā)光譜：表示不同激發(fā)波長下所引起物質(zhì)發(fā)射某一波長熒光的相對效率。

繪制激發(fā)光譜：固定發(fā)射波長(選最大發(fā)射波長),然后以不同波長的入射光激發(fā)熒光物質(zhì)，以熒光強度F對激發(fā)波長作圖，即為激發(fā)光譜。熒光分子都具有兩個特征光譜：激發(fā)光譜和發(fā)射光譜（熒光光譜）√。第十七頁，共八十九頁，2022年，8月28日17激發(fā)光譜曲線的最高處，處于激發(fā)態(tài)的分子最多，熒光強度最大，稱為最大激發(fā)波長ex（2）熒光的發(fā)射光譜（熒光光譜）熒光光譜表示在所發(fā)射的熒光中各種波長組分的相對強度。繪制發(fā)射光譜時，使激發(fā)光波長固定在ex處，然后對發(fā)射光譜掃描，測定各種波長下相應(yīng)的熒光強度，以熒光強度F

對發(fā)射波長作圖，得發(fā)射光譜圖（即熒光光譜）。發(fā)射光譜（熒光光譜）的位置？磷光光譜的位置？第十八頁，共八十九頁，2022年，8月28日18第十九頁，共八十九頁，2022年，8月28日19激發(fā)光譜與發(fā)射光譜的關(guān)系√

a.Stokes位移

熒光光譜總是位于物質(zhì)激發(fā)光譜的長波一側(cè)，即熒光波長大于激發(fā)光波長的現(xiàn)象。

激發(fā)光譜與發(fā)射光譜之間的波長差值：振動弛豫、外轉(zhuǎn)換等無輻射躍遷損失了部分能量。

b.熒光光譜的形狀與激發(fā)波長無關(guān)

電子可以躍遷到不同激發(fā)態(tài)能級，吸收不同波長的能量(如能級圖2、1)，產(chǎn)生不同吸收帶，但熒光光譜卻只有一個發(fā)射態(tài)，如3。為什么？第二十頁，共八十九頁，2022年，8月28日20c.

鏡像規(guī)則由于電子基態(tài)的振動能級分布與激發(fā)態(tài)相似，故通常熒光光譜與它的激發(fā)光譜成鏡像對稱關(guān)系。各小峰波長遞減值與振動能級差有關(guān)，各小峰的高度與躍遷幾率有關(guān)。第二十一頁，共八十九頁，2022年，8月28日21基態(tài)上的各振動能級分布與第一激發(fā)態(tài)上的各振動能級分布類似；基態(tài)上的某振動能級若躍遷到第一激發(fā)態(tài)的某振動能級的幾率較大的話，相反躍遷也如此。第二十二頁，共八十九頁，2022年，8月28日22二、熒光的產(chǎn)生與分子結(jié)構(gòu)的關(guān)系

relationbetweenfluorescenceandmolecularstructure

1.分子產(chǎn)生熒光必須具備的條件（1）具有合適的結(jié)構(gòu)；（2）具有一定的熒光量子產(chǎn)率。熒光量子產(chǎn)率（）：物質(zhì)的熒光量子產(chǎn)率范圍一般是多少?如果一個分子將吸收的光子全部釋放，則其量子產(chǎn)率為100%。第二十三頁，共八十九頁，2022年，8月28日232.有機化合物的分子結(jié)構(gòu)與熒光的關(guān)系√（1）躍遷類型：*→的熒光效率高，系間跨越過程的速率常數(shù)小，有利于熒光的產(chǎn)生；（2）共軛效應(yīng)：提高共軛度有利于增加熒光效率并產(chǎn)生紅移（4）取代基效應(yīng)：芳環(huán)上有供電子基，使熒光增強。（3）剛性平面結(jié)構(gòu)：可降低分子振動，減少與溶劑的相互作用，故具有很強的熒光。如熒光素和酚酞有相似結(jié)構(gòu)，熒光素有很強的熒光，酚酞卻沒有。第二十四頁，共八十九頁，2022年，8月28日24第二十五頁，共八十九頁，2022年，8月28日25√三、影響熒光強度的因素

relationbetweenfluorescenceandmolecularstructure影響熒光強度的外部因素1.溶劑的影響同一物質(zhì)在不同溶劑中，其熒光光譜的形狀和強度都有差別。一般情況下，熒光波長隨著溶劑極性的增大而長移，熒光強度也有所增強。這是因為在極性溶劑中，ππ*躍遷所需的能量差△E小，而且躍遷幾率增加，從而使紫外吸收波長和熒光波長均長移，強度也增強。溶劑粘度減小時，可以增加分子間碰撞機會，使無輻射躍遷增加而熒光減弱。故熒光強度隨溶劑粘度的減小而減弱。由于溫度對溶劑的粘度有影響，一般是溫度上升，溶劑粘度變小，因此溫度上升，熒光強度下降。第二十六頁，共八十九頁，2022年，8月28日262.溫度的影響

熒光強度對溫度變化敏感，溫度增加，分子運動速度加快，分子間碰撞的幾率增加，外轉(zhuǎn)換去活的幾率增加，熒光效率降低。例如熒光素鈉的乙醇溶液，在0℃以下，溫度每降低10℃，f增加3％，在80℃時，f為1。第二十七頁，共八十九頁，2022年，8月28日27當(dāng)熒光物質(zhì)本身是弱酸或弱堿時，溶液的pH值對該熒光物質(zhì)的熒光強度有較大影響，這主要是因為在不同酸度中分子和離子間的平衡改變，離子結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，因此熒光強度也有差異。每一種熒光物質(zhì)都有它最適宜的發(fā)射熒光的存在形式，也就是有它最適宜的pH值范圍。例如苯胺在不同pH值下有下列平衡關(guān)系：

苯胺在pH7～12的溶液中主要以分子形式存在，由于NH2為提高熒光效率的取代基，故苯胺分子會發(fā)生藍色熒光。但在pH<2和pH＞13的溶液中均以苯胺離子形式存在，故不能發(fā)射熒光。3.溶液pH

對酸堿化合物，溶液pH的影響較大，需要嚴格控制；第二十八頁，共八十九頁，2022年，8月28日284.內(nèi)濾光作用和自吸現(xiàn)象

自吸現(xiàn)象：化合物的熒光發(fā)射光譜的短波長端與其吸收光譜的長波長端重疊，產(chǎn)生自吸收；如蒽化合物。

內(nèi)濾光作用：溶液中含有能吸收激發(fā)光或熒光物質(zhì)發(fā)射的熒光，如色胺酸中的重鉻酸鉀；第二十九頁，共八十九頁，2022年，8月28日295.熒光熄滅劑熒光熄滅是指熒光物質(zhì)分子與溶劑分子或溶質(zhì)分子相互作用引起熒光強度降低的現(xiàn)象。引起熒光熄滅的物質(zhì)稱為熒光熄滅劑(quenchingmedium)。如鹵素離子、重金屬離子、氧分子以及硝基化合物、重氮化合物、羰基和羧基化合物均為常見的熒光熄滅劑。第三十頁，共八十九頁，2022年，8月28日306、散射光小部分光子和物質(zhì)分子相碰撞，使光子的運動方向發(fā)生改變而向不同角度散射。瑞利光：光子和物質(zhì)發(fā)生彈性碰撞，不發(fā)生能量交換，只是光子運動方向發(fā)生改變。其波長與入射光波長相同。拉曼光：√光子和物質(zhì)發(fā)生彈性碰撞，發(fā)生能量交換，光子把部分能量轉(zhuǎn)移給物質(zhì)分子或從物質(zhì)分子獲得部分能量。從而發(fā)射出比入射光稍長或稍短的光。散射光對熒光測定有干擾，尤其是波長比入射光波長更長的拉曼光，與熒光波長接近，對測定的干擾大，必須采取措施消除。拉曼光的干擾主要來自溶劑，當(dāng)溶劑的拉曼光與被測物質(zhì)的熒光光譜相重疊時，應(yīng)更換溶劑或改變激發(fā)光波長第三十一頁，共八十九頁，2022年，8月28日31 選擇適當(dāng)?shù)募ぐl(fā)波長可消除拉曼光的干擾a:320nm或350nm為激發(fā)光，熒光峰總是在448nm。b:將空白溶劑分別在320nm及350nm激發(fā)光照射下測定熒光，激發(fā)光波長為320nm時，拉曼光波長是360nm，360nm的拉曼光對熒光無影響；當(dāng)激發(fā)光波長為350nm時，拉曼光波長是400nm，400nm的拉曼光對熒光有干擾，因而影響測定結(jié)果。

硫酸奎寧在不同波長激發(fā)下的熒光與散射光譜

第三十二頁，共八十九頁，2022年，8月28日32四、熒光試劑

熒光試劑是一種可以使非熒光物質(zhì)或弱熒光物質(zhì)與其反應(yīng)之后，得到強熒光性產(chǎn)物的標記物，從而可擴大熒光分析法的使用范圍1.有機化合物的熒光分析脂肪族化合物能產(chǎn)生熒光的為數(shù)不多。芳香族及具有芳香結(jié)構(gòu)的化合物，因存在共軛體系而容易吸收光能，在紫外光照射下很多能發(fā)射熒光。有時為了提高測定的靈敏度和選擇性，常使弱熒光性物質(zhì)與某些熒光試劑作用，以得到強熒光性產(chǎn)物(衍生化)。因此，熒光分析法在有機物測定方面的應(yīng)用很廣。第三十三頁，共八十九頁，2022年，8月28日33能用熒光分析法測定的有機物包括多環(huán)胺類、萘酚類、嘌呤類、吲哚類、多環(huán)芳烴類、具有芳環(huán)或芳雜環(huán)結(jié)構(gòu)的氨基酸類及蛋白質(zhì)等；藥物中的生物堿類如麥角堿、蛇根堿、麻黃堿、嗎啡、喹啉類及異喹啉類生物堿等；甾體類如皮質(zhì)激素及雌醇等；抗生素類如青霉素、四環(huán)素等；維生素類如維生素A、B1、B2、B6、B12、E、抗壞血酸、葉酸及煙酰胺等。此外，中草藥中的許多有效成分，不少是屬于芳香性結(jié)構(gòu)的大分子雜環(huán)類，都能產(chǎn)生熒光，可用熒光分析法作初步鑒別及含量測定。熒光分析法的靈敏度高，選擇性較好，取樣量少，方法快速，已成為醫(yī)藥學(xué)、生物學(xué)、農(nóng)業(yè)和工業(yè)等領(lǐng)域進行科學(xué)研究工作的重要手段之一。以下是幾個重要的熒光試劑：第三十四頁，共八十九頁，2022年，8月28日34

1．熒光胺(fluorescamine)：能與脂肪族或芳香族伯胺類形成高度熒光衍生物，典型反應(yīng)如下： 熒光胺及其水解產(chǎn)物不顯熒光。100mg熒光胺溶于100ml無水丙酮中，放置24小時后即可使用。取相當(dāng)于10mg藥物的甲醇或水溶液0.lml，加適宜pH值的磷酸緩沖溶液5ml，加熒光胺試劑0.lml，混合，放置15分鐘后測定熒光強度。熒光條件為：λex=275、390nm，λem=480nm。第三十五頁，共八十九頁，2022年，8月28日35

2．鄰苯二甲醛(OPA)

在2巰基乙醇存在下，pH9～10的緩沖溶液中OPA能與伯胺類、特別是除半胱氨酸、脯氨酸及羥脯氨酸外的a氨基酸生成靈敏的熒光產(chǎn)物。取OPA500mg溶于10ml乙醇中，加200ml2巰基乙醇，將此混合液加至1L3％的硼酸溶液中，再用KOH調(diào)節(jié)至pH10，即為常用試劑溶液。熒光條件為：λex=340nm，λem=455nm。第三十六頁，共八十九頁，2022年，8月28日36

3．1二甲氨基5氯化磺酰萘(Dansyl-Cl，丹酰氯)能與伯胺、仲胺及酚基的生物堿類反應(yīng)生成熒光性產(chǎn)物。取50mg或100mg試劑，溶解于500ml無水丙酮中即可使用。與丹酰氯類似的一個試劑是丹酰肼(Dansyl－NHNH2)，它能與可的松的羰基縮合，產(chǎn)生強烈熒光。熒光條件為：λex=365nm，λem=500nm左右。丹酰氯試劑不穩(wěn)定，其水解產(chǎn)物DansylOH呈藍色熒光，必須暗處保存，每周重新配制。第三十七頁，共八十九頁，2022年，8月28日372.生物與有機化合物的分析第三十八頁，共八十九頁，2022年，8月28日38無機離子一般不顯熒光，與有機試劑形成有熒光的配合物后，可測量約60種元素及離子鈹、鋁、硼、鎵、硒、鎂、稀土——采用熒光分析法氟、硫、鐵、銀、鈷、鎳——采用熒光熄滅法測定銅、鐵、鈷、鋨及過氧化氫——采用催化熒光法測定鉻、鈮、鈾、碲——采用低溫?zé)晒夥y定鈰、銪、銻、釩、鈾——采用固體熒光法測定2.無機化合物的分析第三十九頁，共八十九頁，2022年，8月28日39第二節(jié)熒光定量分析方法一、熒光強度與物質(zhì)濃度的關(guān)系當(dāng)一束強度為I0的紫外/可見光照射一濃度為c、液層厚度為d的液槽時，可在溶液的各個方向觀察到熒光，其由于能產(chǎn)生熒光的物質(zhì)占被分析物的數(shù)量相當(dāng)有限，且就這少量的熒光物質(zhì)幾乎在同一波長段產(chǎn)生光致發(fā)光，所以熒光法很少用來定性分析

吸收光強度為Ia透過光強度為It熒光強度為FI0It

IaF垂直方向第四十頁，共八十九頁，2022年，8月28日40（=I0-It）熒光強度正比于被熒光物質(zhì)吸收的光強度IaF=K’(I0–It)K’：取決于熒光效率f根據(jù)BeerLaw=10-clItI0F=K’(I0-

I010-cl)=K’I0(1-

10-cl)=K’I0(1-

e–2.303cl)由于ex=1+x+x2/2!+x3/3!+…+xn/n!所以e-2.3cl

=1-2.3cl

+(-2.3cl)2/2!+(-2.3cl)3/3!+…e-2.3cl

=1-2.3cl

第四十一頁，共八十九頁，2022年，8月28日41e-2.3cl

=1-2.3cl代入

F=

K’I0(1-

e–2.303cl)F=K’I0(1-

1+2.3cl

)=2.3K’I0

lc

當(dāng)熒光效率f、入射光強度I0、物質(zhì)的摩爾吸收系數(shù)、液層厚度b均固定不變時，熒光強度正比于該溶液的濃度F=K

c熒光定量分析的依據(jù)熒光強度可以在很弱的背景下被檢測，這完全取決于檢測器的靈敏度，也是熒光分析方法靈敏度高的原因第四十二頁，共八十九頁，2022年，8月28日42二、定量分析方法1.標準曲線法

配制一系列標準濃度試樣，測定熒光強度，繪制F-c的標準校正曲線，再在相同條件下測量未知試樣的熒光強度，在標準曲線上求出試樣的濃度2.比較法

在線性范圍內(nèi)，測定標樣和試樣的熒光強度，比較之空白調(diào)0，標品調(diào)100%或50%第四十三頁，共八十九頁，2022年，8月28日43第三節(jié)熒光分光光度計四個部分——激發(fā)光源、樣品池、雙單色器系統(tǒng)、檢測器特殊點——有兩個單色器，光源與檢測器通常成直角單色器：選擇激發(fā)光波長的第一單色器和選擇發(fā)射光(測量)波長的第二單色器光源：氙燈、高壓汞燈、激光器(可見與紫外區(qū))檢測器：光電倍增管第四十四頁，共八十九頁，2022年，8月28日44熒光光譜（fluorecencespectrum）：固定激發(fā)光波長為最大激發(fā)波長，而讓熒光物質(zhì)發(fā)射的熒光通過發(fā)射單色器分光掃描并檢測不同波長下的熒光強度，以發(fā)射波長為橫坐標，熒光強度為縱坐標作圖，得到物質(zhì)的熒光光譜。熒光物質(zhì)的最大激發(fā)波長（ex）和最大發(fā)射波長（em）是鑒定物質(zhì)的根據(jù)；也是定量測定最為靈敏的條件。第四十五頁，共八十九頁，2022年，8月28日45第四十六頁，共八十九頁，2022年，8月28日46熒光光譜的普遍特性1.斯托克斯位移(Stokesshift):

激發(fā)光譜與發(fā)射光譜之間的波長差值；熒光發(fā)射波長總是大于激發(fā)光譜波長。室溫下菲的乙醇溶液熒光光譜第四十七頁，共八十九頁，2022年，8月28日472.熒光光譜的形狀與激發(fā)波長無關(guān)電子躍遷到不同激發(fā)態(tài)能級，吸收不同波長的能量，產(chǎn)生不同吸收帶，但均回到第一激發(fā)單重態(tài)的最低振動能級再躍遷回到基態(tài)，從而熒光發(fā)射光譜只有一個發(fā)射帶，而且熒光光譜的形狀與激發(fā)波長無關(guān)。3.熒光光譜與激發(fā)光譜的鏡像關(guān)系熒光光譜的普遍特性激發(fā)光譜與熒光光譜成對稱鏡像關(guān)系。第四十八頁，共八十九頁，2022年，8月28日48nm200280360440520020406080100Fab4b3b2b1b0c0c1c2c3c4蒽的激發(fā)光譜（虛線）熒光光譜（實線）蒽的能級躍遷V=0V=1V=2V=3V=4V=0V=1V=2V=3V=4b4b3b2b1b0c0c1c2c3c4?E4?E3?E2?E1?E4?E3?E2?E1第四十九頁，共八十九頁，2022年，8月28日49二、熒光與分子結(jié)構(gòu)（一）熒光壽命和熒光效率熒光壽命(fluorescencelifttime)：當(dāng)除去激發(fā)光源后，分子的熒光強度降低到最大熒光強度的1/e所需的時間，用表示。以對t作圖，斜率即為第五十頁，共八十九頁，2022年，8月28日50熒光效率（fluorescenceefficiency):指激發(fā)態(tài)分子發(fā)射熒光的分子數(shù)與基態(tài)分子吸收激發(fā)光的光子數(shù)之比，常用表示。熒光效率與物質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)和所處的化學(xué)環(huán)境條件有關(guān)。第五十一頁，共八十九頁，2022年，8月28日51（二）有機化合物分子結(jié)構(gòu)與熒光的關(guān)系物質(zhì)產(chǎn)生熒光必須具備的條件：（1）物質(zhì)的分子必須具有能夠吸收紫外和較短波長可見光的結(jié)構(gòu)（2）物質(zhì)必須具有較大的熒光效率第五十二頁，共八十九頁，2022年，8月28日521.長共軛結(jié)構(gòu)（芳香族化合物）

共軛度越大，熒光效率越大，熒光波長長移205nm278nm286nm321nm356nm404nm0.110.290.36第五十三頁，共八十九頁，2022年，8月28日532.分子的剛性分子剛性越強，分子振動少，與其它分子碰撞失活的機率下降，熒光量子效率提高，熒光長移。第五十四頁，共八十九頁，2022年，8月28日543.取代基給電子基團使熒光增強；熒光波長長移。吸電子基團會減弱甚至破壞熒光。同電子體系相互作用小的取代基對熒光影響不明顯。第五十五頁，共八十九頁，2022年，8月28日55（三）熒光試劑1.熒光胺2.鄰苯二甲醛(OPA)3.1-二甲氨基－5－氯化磺酰萘4.測定無機離子的熒光試劑第五十六頁，共八十九頁，2022年，8月28日56三、影響熒光強度的外部因素溫度增加，熒光效率和熒光強度下降。1.溫度2.溶劑隨著溶劑的極性的增加，熒光物質(zhì)的π→π*躍遷幾率增加，熒光強度將增強，熒光波長也發(fā)生紅移；溶劑粘度降低，熒光強度降低。第五十七頁，共八十九頁，2022年，8月28日573.酸度具酸或堿性基團的熒光物質(zhì)，在不同pH值時，其結(jié)構(gòu)可能發(fā)生變化，因而熒光強度將發(fā)生改變。NH3+OH-H+NH2NH-OH-H+利用金屬離子與有機試劑生成配合物進行測定金屬離子時，配合物的穩(wěn)定性和組成受溶液pH值影響較大，從而影響到它們的熒光性質(zhì)。pH3~4Ga3++鄰－二羥基偶氮苯1:1配合物(產(chǎn)生熒光)pH6~7Ga3++鄰－二羥基偶氮苯1:2配合物(不產(chǎn)生熒光)藍色熒光無熒光無熒光第五十八頁，共八十九頁，2022年，8月28日58熒光猝滅：熒光物質(zhì)分子與溶劑分子或其他溶質(zhì)分子的相互作用引起熒光強度降低的現(xiàn)象稱為熒光猝滅。熒光熄滅劑：能引起熒光強度降低的物質(zhì)。4.熒光熄滅劑√碰撞猝滅M+hv→M*,M*+Q→

M+熱靜態(tài)猝滅M+Q→

MQ

非熒光物質(zhì)轉(zhuǎn)入三重態(tài)的猝滅三重態(tài)熒光物質(zhì)的自猝滅熒光物質(zhì)濃度較高導(dǎo)致熒光熄滅的原因：第五十九頁，共八十九頁，2022年，8月28日59熒光熄滅法:

熒光物質(zhì)加入某些猝滅劑后，其熒光強度的減少與熒光猝滅劑的濃度呈線性關(guān)系，可用于測定猝滅劑的含量，這種方法稱為熒光熄滅法。5.散射光瑞利光：光子與物質(zhì)分子發(fā)生彈性碰撞，不發(fā)生能量交換，運動方向改變；λ瑞利光＝λ入射光拉曼光：光子與物質(zhì)分子發(fā)生非彈性碰撞，發(fā)生能量交換，運動方向改變；λ拉曼光≠λ入射光第六十頁，共八十九頁，2022年，8月28日60320360448激發(fā)

320nm硫酸奎寧350448激發(fā)

350nm硫酸奎寧320360激發(fā)

320nm0.1mol/L硫酸350400激發(fā)

350nm0.1mol/L硫酸a.強度b.強度硫酸奎寧在不同激發(fā)波長下的熒光（a）與拉曼光譜（b）第六十一頁，共八十九頁，2022年，8月28日61溶劑激發(fā)光(nm)

248313365405436水乙醇環(huán)己烷CCl4CHCl3271350416469511267344409459500267344408458499—320375418450—346410461502在不同波長激發(fā)光下主要溶劑的拉曼光波長(nm)第六十二頁，共八十九頁，2022年，8月28日62第二節(jié)熒光定量分析方法一、熒光強度與物質(zhì)濃度的關(guān)系I0IF第六十三頁，共八十九頁，2022年，8月28日63(熒光定量分析法的依據(jù))結(jié)論：熒光強度和溶液濃度呈線性關(guān)系，只限于極稀的溶液(A<0.05)。對于較濃溶液，會產(chǎn)生自熄滅現(xiàn)象。第六十四頁，共八十九頁，2022年，8月28日64二、定量分析方法優(yōu)點

1.靈敏度高比紫外-可見分光光度法高2～4個數(shù)量級；檢測下限：0.1～0.001g/mL2.選擇性強既可依據(jù)發(fā)射光譜特征，又可根據(jù)激發(fā)光譜特征；

3.試樣量少和方法簡單

缺點應(yīng)用范圍小第六十五頁，共八十九頁，2022年，8月28日651.校正曲線法CF校正曲線CXFX步驟：1.配制不同濃度的標準溶液2.做F～C關(guān)系曲線3.求得濃度注意：固定儀器和測定條件；

試樣濃度在線性范圍內(nèi)第六十六頁，共八十九頁，2022年，8月28日662.比例法注意：樣品與標樣溶液濃度接近，在線性范圍內(nèi)步驟：1.配制標準溶液和試樣溶液2.測F3.求濃度第六十七頁，共八十九頁，2022年，8月28日673.聯(lián)立方程式法兩組分的熒光峰相互不干擾,可直接測定

分別在各自的熒波長處測定,求出它們的含量兩組分的熒光峰相互干擾,但激發(fā)光譜有顯著區(qū)別,在某一激發(fā)光下一個組分產(chǎn)生熒光峰,另一組分不產(chǎn)生熒光;選用不同的激發(fā)光進行測定如果兩組分的熒光光譜和激發(fā)光譜相互干擾利用熒光強度的加和性（F=F1+F2+F3+），在適宜的熒光波長處測定，用聯(lián)立方程來求解第六十八頁，共八十九頁，2022年，8月28日68第三節(jié)熒光分光光度計和其他熒光分析技術(shù)用于測量熒光強度的儀器有：1.濾光片熒光計2.濾光片－單色器熒光計3.熒光分光光度計第六十九頁，共八十九頁，2022年，8月28日69一、熒光分光光度計1.熒光分光光度計的主要部件：光源、激發(fā)單色器、發(fā)射單色器、樣品池、檢測系統(tǒng)光源激發(fā)單色器樣品池發(fā)射單色器檢測器放大器指示器·記錄器第七十頁，共八十九頁，2022年，8月28日70第七十一頁，共八十九頁，2022年，8月28日71SK-2003A型熒光光譜儀(國內(nèi)首創(chuàng)）第七十二頁，共八十九頁，2022年，8月28日72RF-5400熒光光度計第七十三頁，共八十九頁，2022年，8月28日73Hitachi(日立)F-2500熒光分光光度第七十四頁，共八十九頁，2022年，8月28日74熒光分光光度計澳大利亞第七十五頁，共八十九頁，2022年，8月28日752.儀器的校正靈敏度的校正

在選定波長及狹縫寬度的條件下，用一種穩(wěn)定的熒光物質(zhì)，配成濃度一致的對照品對儀器進行校正，使每次測得的熒光強度調(diào)節(jié)到相同數(shù)值（50％或100％）。

波長校正汞燈的標準譜線對單色器波長刻度校正。第七十六頁，共八十九頁，2022年，8月28日76激發(fā)光譜和熒光光譜的校正1.單光束熒光光度計，可用儀器上附有的校正裝置將每一波長的光源強度調(diào)整到一致，然后以表觀光譜上每一波長的強度除以檢測器對每一波長的感應(yīng)強度進行校正。2.雙光束熒光光度計，可用參比光束抵消光學(xué)誤差。第七十七頁，共八十九頁，2022年，8月28日77二、其他熒光分析技術(shù)簡介1.激光熒光分析特點：激光作光源，一個單色器，用于分析超低濃度物質(zhì)。2.時間分辨熒光分析特點：利用不同物質(zhì)的熒光壽命不同，在激發(fā)和檢測之間延緩的時間不同，實現(xiàn)分別檢測的目的。第七十八頁，共八十九頁，2022年，8月28日783.同步熒光分析特點:選擇適宜的?λ,同時掃描激發(fā)波長和發(fā)射波長，得到同步熒光光譜；減少光譜重疊，提高分辨率；用于定量分析。第七十九頁，共八十九頁，2022年，8月28日794.膠束增敏熒光分析特點：采用化學(xué)方法提高熒光效率；膠束溶液對熒光物質(zhì)有增溶、增敏和增穩(wěn)的作用。第八十頁，共八十九頁，2022年，8月28日80無機物的熒光分析很多金屬或非金屬無機離子與一些有機化合物形成有熒光的配合物，測定熒光強度可以進行定量分析。常用的試劑：1.8－羥基喹啉及其衍生物：用于Al、Ga、In、Sc、La、Mg、Zn、Cd等元素的熒光測定。2.黃酮類試劑：桑色素、黃烷醇、槲皮素用于Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ族元素的熒光測定3.二氨基化合物：用于測定Se第八十一頁，共八十九頁，2022年，8月28日81Al的測定方法：將大約40mL不含硝酸根的弱酸性試液，加入10mL8－羥基喹啉溶液振蕩2min，加入氨水調(diào)節(jié)到pH8～11，再用力振蕩30s，水相以每次4mL氯仿洗滌二次。合并萃取液并以氯仿稀釋至20mL,再加入Na2SO4。然后在熒光分光光度計上測定，激發(fā)波長365nm、發(fā)射波長560nm。第八