基因假說的課件資料第1頁/共30頁HaroldH.Flor

植物與病原微生物的侵襲,兩者在自然生態(tài)系統(tǒng)中長期并存,相互影響乃至協(xié)同進(jìn)化,使得植物的抗病性與病原物的致病性之間形成一種動態(tài)平衡。1971年,Flor根據(jù)亞麻對銹菌小種特異抗性的研究提出了基因?qū)蚣僬f(Gene-for-genetheory)。1植物基因?qū)蚣僬f第2頁/共29頁第2頁/共30頁

該學(xué)說認(rèn)為,植物對某種病原物的特異抗性取決于它是否具有相應(yīng)抗性基因,而同時病原物的專一致病性取決于病原物是否具有無毒基因,也就是說寄主分別含有感病基因(r)和抗病基因(R),病原物分別含有毒性基因(Vir)和無毒基因(Avr),只有當(dāng)具有相應(yīng)抗病基因的植物與具有無毒基因的病原物相遇時,才會激發(fā)植物的抗病反應(yīng),其他情況下二者表現(xiàn)親和,即寄主感病。ReceptorcodedbyRalleleSignalmolecule(ligand)fromAvrgeneproductAvrallelePlantcellisresistantAvirulentpathogenRNoAvrallele;virulentpathogenPlantcellbecomesdiseasedAvralleleNoRallele;plantcellbecomesdiseasedVirulentpathogenVirulentpathogenNoRallele;plantcellbecomesdiseasedR(PlantResponsestoInternalandExternalSignalsChapter39)第3頁/共29頁第3頁/共30頁植物與病原菌的分子交流決定了它們互作的最終結(jié)果。病原菌效應(yīng)蛋白被送入寄主植物細(xì)胞后，能否被侵染的植物組織識別，決定了植物是感病還是抗病。由?；疪基因介導(dǎo)的抗性符合“基因?qū)颉钡幕プ髂Ｊ健Ｈ欢?，從已克隆的R基因及其產(chǎn)物結(jié)構(gòu)和功能看，有些R基因的抗病機(jī)制并不符合“基因?qū)颉蹦Ｊ剑缬衩譎m1

基因和大麥mlo

基因，其抗性機(jī)制與病原菌的親和因子有關(guān)，而不需要病原菌無毒因子的激活。2R與Avr基因互作的模式第4頁/共29頁第4頁/共30頁

受體-配體模型是從基因?qū)蚣僬f發(fā)展而來的。該模型認(rèn)為：病原體的avr基因直接或間接地編碼一種配體(激發(fā)子)，它與抗病基因編碼的產(chǎn)物(受體)相互作用，從而觸發(fā)受侵染部位細(xì)胞內(nèi)的信號傳遞過程，激活其他防衛(wèi)基因的表達(dá)，產(chǎn)生超敏反應(yīng)(HypersensitiveResponse,HR)

,在病原體侵染部位出現(xiàn)枯死斑點(diǎn)癥狀，使植物獲得抗性。（/course/pp315/gene/）2.1符合基因?qū)蜿P(guān)系的互作模式2.1.1

受體-配體模式(Receptorligandmodel)第5頁/共29頁第5頁/共30頁2.1.2警戒模式

(Guardmodel)模式認(rèn)為植物寄主中存在著病原菌效應(yīng)蛋白致毒性靶標(biāo)（Virulencetarget），效應(yīng)蛋白與之互作來調(diào)節(jié)植物活性，以利于病原菌生長和繁殖；NB-LRR類R蛋白起警戒作用，一旦監(jiān)測到靶蛋白被Avr改變，即可激活R蛋白與靶蛋白互作，以避免病原菌效應(yīng)蛋白對靶蛋白的操縱，或引發(fā)一系列信號傳導(dǎo)，啟動植物的防御反應(yīng)。第6頁/共29頁第6頁/共30頁2.1.3已提出的其他相關(guān)模式（a）受體-配體模式（b）共受體模式：無毒蛋白（A）先與共受體（C）上的高親和位點(diǎn)結(jié)合，R蛋白再與C之間發(fā)生相互作用啟動防御反應(yīng)。（c）警戒模式（d）蛋白水解酶依賴型防御啟動：介于一些細(xì)菌、真菌和病毒的特點(diǎn)，預(yù)測這些基因可能會編碼蛋白質(zhì)水解酶。該論點(diǎn)認(rèn)為Avr蛋白會對寄主中的某些蛋白的水解作用的處理后寄主內(nèi)的R蛋白識別并與部分水解狀態(tài)的蛋白結(jié)合，引起信號傳導(dǎo)，引發(fā)植物的防御反應(yīng)。第7頁/共29頁第7頁/共30頁2.2非R／Avr基因互作的植物抗病模式寄主植物中存在促進(jìn)親和反應(yīng)的基因，即感病基因，其編碼產(chǎn)物是一種“親和性因子”。通過對這類基因的修飾甚至誘發(fā)隱性突變，即可賦予植物對某一種甚至多種病原菌的廣譜抗性。這類基因有大麥抗白粉菌（Erysiphegraminisfsp,Hordei）基因mlo，豌豆抗白粉菌（E.pisi）基因er-1，番茄抗白粉?。∣idiumlycopersici）基因ol-2和擬南芥抗白粉病基因PMR等。

大麥抗白粉病基因Mlo,是植物負(fù)向調(diào)控的廣譜抗病基因。MLO是一種膜錨定蛋白，由533個氨基酸組成，含有7個TM，其N端位于細(xì)胞外側(cè)，C端位于細(xì)胞內(nèi)側(cè)，含有一個核結(jié)合位點(diǎn)和兩個酪氨酸激酶II編碼區(qū)。MLO

是類似于動物的G蛋白偶聯(lián)受體（GPRs），是一類新型的鈣調(diào)素（CaM）結(jié)合蛋白，CaM是MLO蛋白的活化因子，MLO-CaM結(jié)合互作，可使細(xì)胞質(zhì)Ca2+濃度瞬時急速增加，這一方面可能會激發(fā)寄主防御反應(yīng)，但同時促進(jìn)了親和性互作。MLO

蛋白可能是病原菌侵入植物的對接的分子，是大麥/大麥白粉菌（Bgh）發(fā)生親和性互作所必需的因子。第8頁/共29頁第8頁/共30頁3不同Avr與R蛋白互作的定位不同寄主與病原物Avr和R蛋白的互作定位。對一些細(xì)菌Avr和R蛋白的匹配性分析，揭示了普遍的空間相互依賴性。如上圖，植物的R蛋白用深綠色標(biāo)出，其他與植物抗性相關(guān)蛋白用淺綠色標(biāo)出。細(xì)菌、真菌和預(yù)測的線蟲Avr蛋白分別用紅色、紫色和粉紅色標(biāo)出。微生物侵染結(jié)構(gòu)用藍(lán)色標(biāo)出。第9頁/共29頁第9頁/共30頁三型分泌系統(tǒng)

(TypeIIIsecretionsystem

)

，是首先在革蘭氏陰性菌中發(fā)現(xiàn)的一種針狀結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)附屬物，病原菌通過這一結(jié)構(gòu)是將自身蛋白直接分泌到寄主細(xì)胞內(nèi)，幫助細(xì)菌侵染真核生物有機(jī)體。3.1

三型分泌系統(tǒng)（TTSS/T3SS

)Atransmissionelectron-microscopeimageofisolatedT3SSneedlecomplexesfromSalmonellatyphimurium第10頁/共29頁第10頁/共30頁

Staskawiez等于1984年通過把含有無毒基因avrA的大豆丁香假單胞桿菌小種的Cosimd克隆結(jié)合轉(zhuǎn)移到不含avrA的小種中，繼之以遺傳互補(bǔ)實(shí)驗克隆了avrA

基因，這是克隆的第一個無毒基因。隨后，許多研究者通過類似的方法從不同的病原物中克隆了幾十個無毒基因，這不僅有力地支持了基因?qū)蚩共⌒詫W(xué)說，而且也促進(jìn)了對其本身的認(rèn)識。4.1病原物無毒基因

4病原物無毒基因及無毒蛋白第11頁/共29頁第11頁/共30頁雖然已有諸多的無毒基因被克隆和測序，但對其確切產(chǎn)物及功能有較詳細(xì)了解的卻僅限于AvrD、Avr9、AvrBs3、AvrPto和煙草花葉病毒外殼蛋白等少數(shù)幾種蛋白質(zhì)。表1總結(jié)了蛋白質(zhì)的某些特性。4.2病原物無毒蛋白第12頁/共29頁第12頁/共30頁植物抗病基因產(chǎn)物可能有兩個功能：識別相應(yīng)的Avr衍生信號；激活下游信號傳導(dǎo)，引發(fā)復(fù)雜的防御反應(yīng)。目前已至少分離出50多個抗病基因。通過對克隆的R基因分析比較，發(fā)現(xiàn)多數(shù)R基因具有較高序列一致性，來源不同的R基因往往存在一些共同的結(jié)構(gòu)基序（motifs），如富亮氨酸重復(fù)序列（leucinerichrepeat,LRR），核苷酸結(jié)合位點(diǎn)（nucleotidebindingsite,NB），亮氨酸拉鏈（leucinezipper,LZ），跨膜結(jié)構(gòu)域（transmembranedomain），絲氨酸/蘇氨酸激酶（Ser/Thrkinase,STK），以及果蠅Toll

蛋白細(xì)胞介素-1受體（Tollandinterleukin-1receptor.TIR）等。依據(jù)基因結(jié)構(gòu)特點(diǎn)和可能的功能，將克隆的R基因劃分9個類型（如下表所示）。5植物抗病基因第13頁/共29頁第13頁/共30頁第14頁/共29頁第14頁/共30頁

截至2004年底，已經(jīng)有近50個抗病基因被克隆。盡管這些抗病基因所抗的病原物種類不同，有真菌、細(xì)菌、病毒等，但這些抗病基因所編碼的產(chǎn)物中卻存在著驚人的類似結(jié)構(gòu)域，即不同抗病基因具有一定的同源性。根據(jù)抗病基因保守結(jié)構(gòu)域的不同，抗病基因編碼的蛋白(抗病蛋白，R蛋白)可分為5大類。6R基因編碼R蛋白的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)第15頁/共29頁第15頁/共30頁6.1核苷酸結(jié)合位點(diǎn)(Nucleotidebindingsite,NBS)高度保守的抗病基因產(chǎn)物中的NBS結(jié)構(gòu)域表明核苷i磷酸是這些蛋白發(fā)揮功能所必需的?？共〉鞍椎腘BS區(qū)有3個特征保守區(qū)，第1區(qū)域為磷酸結(jié)合環(huán)(P-loop)，又稱激酶la(Kinasela)，其共有序列為GM(GPP)GNGKTT(aPT)；第2區(qū)域為激酶2，共有序列為X(XPR)XaaaaDDV(WPD)；第3區(qū)域為激酶3a，其保守區(qū)為SraaaT(TPS)R。NBS結(jié)構(gòu)域在植物抗病中的作用機(jī)制還不十分清楚，未來的研究將集中在核苷三磷酸的合成與水解過程以及這些過程對植物抗病蛋白活性的作用等方面。核苷三磷酸的結(jié)合可能改變抗病蛋白與其防御信號之問的相互作用。第16頁/共29頁第16頁/共30頁6.2富含亮氨酸區(qū)域(Leucinerichrepeats，LRR)LRR存在于多種不同的蛋白中，與蛋白質(zhì)之問的相互作用及信號傳導(dǎo)密切相關(guān)。在功能方面，LRR決定著與配體結(jié)合的專一性，即決定著寄主與病原的特異性識別。1996年，Dixon等提出了LRR促進(jìn)抗病蛋白與其他參與抗病信號傳導(dǎo)的蛋白之間的結(jié)合等模?？共〉鞍姿腖RR結(jié)構(gòu)可大至分為2類：①定位于胞外的LRR；②定位于胞質(zhì)的LRR。胞外LRR的共有序列為“LXLXXLXXLXLXXNXLXGXIPXX”，而胞質(zhì)LRR的共有序列為“aXXXXXLXXLXLXX(XPC)XXXXXaXXX”，可以看出所有LRR都具有“XLXXLXLXX”結(jié)構(gòu)。第17頁/共29頁第17頁/共30頁6.3絲氨酸P蘇氨酸蛋白質(zhì)激酶(SPTproteinkinase)SPT蛋白質(zhì)激酶是植物的受體類蛋白激酶(Receptor-like．kinase。RLX)的主要形式，其功能主要有以下幾點(diǎn)：①是與一些信號分子如激酶、生長因子、性因子等相互作用的傳導(dǎo)信號；②參與防御反應(yīng)。如B細(xì)胞中的抗體和T細(xì)胞中的受體通過識別外來分子啟動下游激酶產(chǎn)生一系列級聯(lián)反應(yīng)，最終產(chǎn)生免疫作用；③在細(xì)胞分裂過程中控制分裂時期；④對一些自然逆境如缺乏關(guān)鍵元素產(chǎn)生反應(yīng)。SPT蛋白激酶的2個特征保守區(qū)分別為DaKXXN和GTaGYXAPCNPE［6］

。6.4亮氨酸拉鏈(Leucinezipper，LZ)LZ

存在于一些寡聚蛋白中，許多DNA結(jié)合蛋白就含有LZ。LZ在真核生物轉(zhuǎn)錄因子的同源及異源二聚體形成中起著重要作用，相似的卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域(Coiled-coildomains)促進(jìn)了蛋白之間的相互作用，并導(dǎo)致許多其他功能的產(chǎn)生，但它們在抗病蛋白功能發(fā)揮中所起的作用目前還知之甚少。第18頁/共29頁第18頁/共30頁6.5白細(xì)胞介素-1受體相似的區(qū)域(TIR)

果蠅的Toll蛋白及哺乳動物的白介素-1受體，在各自的免疫系統(tǒng)信號傳導(dǎo)中起重要作用。通過對病原物的結(jié)合，將信號傳導(dǎo)給傳導(dǎo)因子。如果蠅的Dif因子和哺乳動物的NF-KB因子。這些傳導(dǎo)因子獲得由細(xì)胞質(zhì)向細(xì)胞核內(nèi)運(yùn)輸?shù)哪芰Γ⑴c各免疫反應(yīng)基因的啟動子相結(jié)合，引起免疫反應(yīng)基因的表達(dá)，從而對病原物產(chǎn)生抗性。越來越多的證據(jù)表明，植物中可能也存在與哺乳動物和昆蟲自然免疫系統(tǒng)相似的抗病途徑。第19頁/共29頁第19頁/共30頁

世界上第一個被克隆的抗病基因是玉米抗圓斑病菌基因(Hml)。Hml位于玉米第l染色體的長臂上，編碼1個依賴NADPH的HC2毒素還原酶(HCTR)，能使病原菌產(chǎn)生的致病因子HC-毒素喪失活性。植物抗病基因的克隆方法有以下幾種。

7植物抗病基因的克隆第20頁/共29頁第20頁/共30頁7.1轉(zhuǎn)座子標(biāo)簽法

(Transposontagging)

其基本原理是利用轉(zhuǎn)座子或t-DNA插入到抗病基因的內(nèi)部或鄰近位點(diǎn)，獲得抗病功能喪失的突變體，然后利用插入的片段(轉(zhuǎn)座子或t-DNA)作探針，通過Southern雜交或PCR技術(shù)從基因組文庫中分離克隆抗病基因。轉(zhuǎn)座子標(biāo)簽法運(yùn)用的前提條件是被操作的植物有現(xiàn)成的遺傳轉(zhuǎn)化操作系統(tǒng)或有成熟的根癌農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化系統(tǒng)以及有效的大規(guī)模突變體篩選的方法和手段。第21頁/共29頁第21頁/共30頁7.2圖位克隆法(Map-basedcloning)在目標(biāo)基因精確定位到染色體的特定位置以后，運(yùn)用與目標(biāo)基因緊密連鎖的分子標(biāo)記篩選含有目標(biāo)基因的大片段基因組文庫BAC(細(xì)菌人工染色體載體)或YAC(酵母人工染色體))，再通過染色體步移篩選到含有目標(biāo)基因的亞克隆，最后通過遺傳轉(zhuǎn)化和功能互補(bǔ)試驗進(jìn)行驗證。利用該法克隆的抗病基因主要有番茄Pto

基因、擬南芥RPS2基因、RPMI基因和NPRI基因以及水稻Xa21基因和Pi-b基因等。圖位克隆法以高密度的分子標(biāo)記圖譜為基礎(chǔ)，其關(guān)鍵是尋找與目標(biāo)基因緊密連鎖的分子標(biāo)記，核心任務(wù)是染色體步行。但是對于基因組較大、重復(fù)序列較多的一些植物，采用該方法分離克隆抗病基因不僅投資大而且效率低，因此，該方法也受到一定的限制。第22頁/共29頁第22頁/共30頁7.3根據(jù)抗病基因同源序列(RGA)克隆、定位抗病基因前面已經(jīng)提到抗病基因所編碼的蛋白(R蛋白)間存在著類似結(jié)構(gòu)域，而編碼這些類似結(jié)構(gòu)的抗病基因序列也一定有著同源性?？共』蛲葱蛄袠?biāo)記就是從這些同源序列出發(fā)來定位、克隆抗病基因的一種新的方法。具體方法是根據(jù)抗病基因中編碼蛋白質(zhì)功能保守區(qū)序列設(shè)計特異或簡并引物，擴(kuò)增基因組DNA從而獲得RGA。這些RGA可以作為一種基于特異或簡并引物多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的DNA標(biāo)記m1。自V.Kanazin和YuG.Yong于1996年在Sci連續(xù)2篇關(guān)于用抗病蛋白的保守序列為引物來擴(kuò)增RGA的文章發(fā)表以來，現(xiàn)已在大豆、豌豆、蠶豆、水稻和大麥、油菜、甜瓜、紫花苜蓿、小麥、番茄、辣椒、萵苣和葡萄等多種植物上擴(kuò)增出RGA。第23頁/共29頁第23頁/共30頁8.1植物信號轉(zhuǎn)導(dǎo)研究

植物R因的克隆及其保守功能區(qū)的確定，以及由此而來對R基因介導(dǎo)的抗病防衛(wèi)反應(yīng)途徑的研究，為植物信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的闡明建立了一條很有希望的道路。R基因主要是起識別作用，其產(chǎn)物直接或間接地與來自病原無毒基因的產(chǎn)物進(jìn)行識別互作，然后通過信號轉(zhuǎn)導(dǎo)啟動植物防衛(wèi)反應(yīng)途徑，表達(dá)出功能性產(chǎn)物造成抗病反應(yīng)。通過對多個無毒基因、抗病基因的克隆及其相互作用的研究，為此過程的正確性提供了證據(jù)。8植物抗病基因的應(yīng)用第24頁/共29頁第24頁/共30頁8.2通過轉(zhuǎn)化已克隆的R基因獲得新的抗病品種

用克隆的R基因去轉(zhuǎn)化敏感植株能很快地產(chǎn)生新的抗性系。利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)可允許R基因在種問轉(zhuǎn)移，這對于還沒有鑒定出有效抗病基因的作物很有意義?，F(xiàn)已在煙草中成功地轉(zhuǎn)入Pro基因。但R基因發(fā)揮作用還要與防衛(wèi)機(jī)制的其他成分相配合，因此這種種問轉(zhuǎn)移并不能總獲得理想結(jié)果。

第25頁/共29頁第25頁/共30頁8.3創(chuàng)造新的具廣譜抗病性R基因

通過對已克隆R基因的結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)，R基因的功能與結(jié)構(gòu)是相一致的，且不同的R基因間存在很好的保守性。因此，在實(shí)驗室中創(chuàng)造出新一的可增強(qiáng)抗病性的R基因也成為可能，用馬鈴薯X病毒表達(dá)系統(tǒng)將組裝的Pto導(dǎo)入細(xì)胞后發(fā)現(xiàn)該P(yáng)to同類物可控制細(xì)胞對Fen的敏感性等［7］

。第26頁/共29頁第26頁/共30頁從植物抗病性是相對保守的R蛋白與易變的Avr蛋白相互識別、相互作用的結(jié)果。在野生的植物居群中，抗病基因座一般是復(fù)合的，通常存在著抗病基因簇，而且通過基因座內(nèi)發(fā)生重復(fù)和重組、轉(zhuǎn)座及病原菌識別區(qū)適應(yīng)性選擇等途徑使基因家族成員的抗性得以演變和進(jìn)化。在這種包含多種R基因的混合群體中，既使病原菌Avr突變產(chǎn)生新毒性小種，其適應(yīng)性很難快速提高。由于人為因素，農(nóng)作物栽培品種的植物抗病基因過于簡化。雖然向農(nóng)作物引入R基因可賦予其對當(dāng)前流行的病害產(chǎn)生抗性，可一旦Avr基因突變，這種R基因介導(dǎo)的抗性很快就會喪失，而具有這種R基因的品種就成為毒性小種的哺育品種。因此，在植物育種上，要全面開發(fā)新抗源，在同一品種中應(yīng)盡可能多地聚積不同類型R基因；而在農(nóng)作物生產(chǎn)上，一定要保證多樣性抗源，且具有不同R基因的品種要合理布局，以R基因的遺傳多樣性來抑制新毒性小種的產(chǎn)生和蔓延。8.4從互作的角度看待R基因的應(yīng)用第27頁/共29頁第27頁/共30頁越來越多的實(shí)驗證據(jù)表明，植物抗病原細(xì)菌和真菌的R基因，絕大多數(shù)R蛋白只是“抗病復(fù)合體”的一部分，其主要功能是監(jiān)控寄主的少數(shù)關(guān)鍵蛋白（如病原菌效應(yīng)蛋白致毒性靶蛋白）結(jié)構(gòu)及其活性的改變，啟動植物防御反應(yīng)。如果確實(shí)如此，那么R基因介導(dǎo)的抗性存在上位性作用。由此我們必需思考這樣一個問題，利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)向農(nóng)作物引入