環(huán)境因素對微生物的影響和紫外誘變效應(yīng)實驗報告孫曉川生142011011983一、實驗?zāi)康模?.了解物理因素、化學(xué)因素及生物因素抑制或殺死微生物的作用及其試驗方法。

2.了解紫外線誘變原理，并初步掌握紫外線誘變育種的方法。

3.練習(xí)單菌落劃線分離微生物。

二、實驗原理:在自然界中，微生物分布極其廣泛，幾乎無處不在，微生物的生長發(fā)育受著環(huán)境因素的影響。

而不同的微生物及微生物不同的生理狀態(tài)受環(huán)境因素影響的程度也不同，有的環(huán)境因素是微生物生長繁殖所必需的條件，有的表現(xiàn)為抑制作用，有的表現(xiàn)為殺菌作用。

1.溫度對微生物的影響：溫度通過影響蛋白質(zhì)、核酸等生物大分子的結(jié)構(gòu)與功能以及細(xì)胞結(jié)構(gòu)來影響微生物的生長、繁殖和新陳代謝。微生物群體生長、繁殖最快的溫度為其最適生長溫度，但它并不等于積累某一代謝產(chǎn)物的最適溫度。粘質(zhì)沙雷氏菌能產(chǎn)生紅色或紫紅色色素，菌落表面顏色隨著色素量的增加呈現(xiàn)出由橙黃到深紅色逐漸加深的變化趨勢。

2.化學(xué)因素對微生物的影響：常用的化學(xué)消毒劑主要包括重金屬及其鹽類、有機(jī)溶劑(酚、醇、醛等)、鹵族元素及其化合物和表面活性劑等。根據(jù)是殺死還是抑制微生物，可分為致死劑和抑制劑。常用的3個指標(biāo)：最低抑制濃度（MIC）、半致死劑量和最低致死劑量。

3.生物因素對微生物的影響：許多微生物在其生命活動過程中能產(chǎn)生某種特殊代謝產(chǎn)物如抗生素，具有選擇性地抑制或殺死其他微生物的作用。不同抗生素的抗菌譜是不同的，某些抗生素只對少數(shù)細(xì)菌有抗菌作用。產(chǎn)黃青霉分泌青霉素抑制細(xì)菌細(xì)胞壁的合成。青霉素主要抗G＋細(xì)菌。鏈霉素作用于核糖核酸30S亞基，所以鏈霉素只作用原核生物。鏈霉素以抗G－細(xì)菌為主。

4.紫外線的對微生物的影響:4.1紫外線殺菌：紫外線具有殺菌作用主要是因為它誘導(dǎo)形成胸腺嘧啶二聚體來破壞DNA的結(jié)構(gòu)，使其不能正常行使功能。另外，空氣在紫外線照射下產(chǎn)生臭氧(O3)，也有一定殺菌作用。紫外線殺菌力最強(qiáng)的波長是226-256nm部分。紫外線透過物質(zhì)能力很差，所以只適用于空氣及物體表面的滅菌，它距離照射物以不超過1.2米為宜。紫外線對于人體也有傷害作用。

4.2紫外線誘變：紫外線對細(xì)菌生長的影響是隨著紫外線對微生物照射劑量、時間及距離的不同，對微生物的生理活動也相應(yīng)地產(chǎn)生不同的效果：劑量高、時間長、距離短就易殺死它們，劑量低、時間短、距離長時就會有少量個體殘存下來，其中一些個體的遺傳特性發(fā)生了變異。

我們可以利用這種特性來進(jìn)行滅菌或菌種選育工作。紫外誘變最有效的波長僅僅是在253～265nm，一般紫外線殺菌燈所發(fā)射的紫外線大約有80%是254nm。

三、實驗儀器、材料和用具：紫外照射箱，37℃培養(yǎng)箱、34℃培養(yǎng)箱、30℃培養(yǎng)箱、25℃培養(yǎng)箱

24個淀粉培養(yǎng)基平板

在一邊已長成一直線狀菌落的產(chǎn)黃青霉，鏈霉菌平板各1個

培養(yǎng)18小時的金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、枯草桿菌菌液、粘質(zhì)賽氏桿菌的平板

無菌的小圓濾紙片、接種環(huán)、黑紙、標(biāo)簽紙、酒精燈、記號筆、試管架

0.05%甲紫，5%苯酚，1/200稀釋的84消毒液，1/500甲醛，75%乙醇，95%乙醇，1%過氧化氫，2.5%碘酊四、實驗步驟：（一）溫度對微生物生長的影響：1.用接種環(huán)取培養(yǎng)好的粘質(zhì)賽氏桿菌單菌落，在三個肉湯蛋白胨平板上分區(qū)劃線接種，要保證能得到單一菌落。2.做好標(biāo)記，將第一個平板在25℃，第二個在30℃進(jìn)行培養(yǎng)，第三個在37℃進(jìn)行培養(yǎng)。24h后取出，觀察不同溫度下培養(yǎng)粘質(zhì)賽氏桿菌生長狀況和產(chǎn)生色素情況。3.對未知菌S3進(jìn)行相同操作，最后分別放在30℃、34℃、37℃的培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。（二）化學(xué)因素對微生物生長的影響：1.用無菌吸頭吸取100μl培養(yǎng)18h的金黃色葡萄球菌菌液于肉湯蛋白胨培養(yǎng)基上，用無菌涂布棒涂布均勻。

2.將上述培養(yǎng)皿用記號筆分成八等份，每一等份內(nèi)標(biāo)明一種藥物名稱。

3.用無菌鑷子將小濾紙片分別浸入各種藥劑中，然后對號放入培養(yǎng)皿的小區(qū)內(nèi)（注意不要造成藥品交叉污染）。4.置37℃溫室培養(yǎng)24h后，觀察。比較抑菌圈大小。

（三）生物因素對微生物生長的影響：1.用肉湯蛋白胨培養(yǎng)基制成平板，在平板一側(cè)，用接種環(huán)取產(chǎn)黃青霉的孢子，在平板上劃一直線接種，置于28℃培養(yǎng)48～72h。（助教完成）

2.待形成菌苔后，從距產(chǎn)黃青霉的菌苔邊緣5mm處用接種環(huán)并分別垂直向外劃直線接種已培養(yǎng)18小時的大腸桿菌、枯草桿菌和金黃色葡萄球菌。在37℃培養(yǎng)24h，觀察結(jié)果。注意所取菌的量不要太大。

3.用同樣的方法做涇陽鏈霉菌的抗菌譜試驗。（四）紫外線的對微生物的影響：1.用無菌吸頭吸取100μ1培養(yǎng)18h的金黃色葡萄球菌液于肉湯蛋白胨培養(yǎng)基平板上，用無菌涂棒涂布均勻。

2.用一張三角形或任意形狀的報紙條遮住部分平板培養(yǎng)基，打開皿蓋，置紫外燈下照射3min后取出報紙，蓋上皿蓋。

3.在黑暗中（或紅燈下）用雙層報紙包裹，倒置于37℃培養(yǎng)24h后觀察結(jié)果。

（五）紫外線對微生物的誘變效應(yīng)：1.取搖瓶培養(yǎng)至對數(shù)生長期的枯草芽孢桿菌菌液0.1ml加入0.9ml生理鹽水中，進(jìn)行10倍稀釋，依次做10-1～10-8稀釋。

2.涂布：取各100μl菌液涂平板，每個稀釋度涂平板2只。

3.紫外線（30W,30cm)處理：10-5照射20s，10-4照射30s,10-3照射40s、10-2照射50s,10-1照射60s。以10-6,10-7和10-8平板作對照。處理后的培養(yǎng)皿在黑暗中（或紅燈下）用雙層報紙紙包好，倒置37℃培養(yǎng)，24h后觀察并記錄結(jié)果。五、實驗結(jié)果及分析：（一）溫度對微生物的影響：1）溫度對粘質(zhì)賽氏桿菌的影響：培養(yǎng)溫度/℃253037實驗現(xiàn)象微紅較25℃更紅一些無色結(jié)論：粘質(zhì)賽氏桿菌在30℃左右生長情況最好。圖1：25℃粘質(zhì)賽氏桿菌生長情況圖2：30℃粘質(zhì)賽氏桿菌生長情況圖3：37℃粘質(zhì)賽氏桿菌生長情況2）溫度對未知菌S3的影響：培養(yǎng)溫度/℃303437單菌落直徑/cm1.01.62.1結(jié)論：未知菌S3在37℃或以上生長情況最好。圖4:30℃未知菌S3生長情況圖5：34℃未知菌S3生長情況圖6：37℃未知菌S3生長情況（二）化學(xué)試劑的抑菌現(xiàn)象：化學(xué)試劑抑菌圈半徑（mm）2.5%碘酊1275%乙醇未出現(xiàn)透明圈5%苯酚111/200稀釋的84消毒液101%甲醛溶液110.05%甲紫50.595%乙醇17H2O211抑菌能力：0.05%甲紫的抑菌能力最強(qiáng)，其次是95%乙醇溶液，剩余的5種溶液（不含75%乙醇）抑菌效果相差不多。圖7：不同化學(xué)試劑對金黃色葡萄球菌生長的抑制（三）生物因素對微生物生長的影響：1）產(chǎn)黃青霉的抑菌作用：圖8：青霉素的抑菌效果結(jié)論：產(chǎn)黃青霉產(chǎn)生的青霉素對金黃色葡萄球菌的生長有明顯的抑制作用，而對枯草芽孢桿菌和大腸桿菌則抑制效果不明顯。2）涇陽鏈霉菌的抑菌作用：圖9：鏈霉素的抑菌效果結(jié)論：涇陽鏈霉菌產(chǎn)生的鏈霉素對大腸桿菌的生長有明顯的抑制作用，而對枯草芽孢桿菌和大腸桿菌則抑制效果不明顯。（四）紫外線對微生物的誘變效應(yīng)：稀釋度照射時間（s）處理后的活菌數(shù)平均值（30~300）存活率（%）致死率（%）1210-160無法計數(shù)120120幾乎為0幾乎為10010-250無法計數(shù)2424幾乎為0幾乎為10010-340250無法計數(shù)2500.0299.9810-43001260.00599.99510-5200420.0299.9810-6030604510-7047244710-8006030由10-6、10-7和10-8的結(jié)果，估算出未稀釋時，100μl溶液中大概有1.2×109個?？梢来藖硗扑愦婊盥屎椭滤缆?。圖10：稀釋10倍的枯草芽孢桿菌在紫外線下照射60s后的生長情況圖11：稀釋102倍的枯草芽孢桿菌在紫外線下照射50s后的生長情況圖12：稀釋103倍的枯草芽孢桿菌在紫外線下照射40s后的生長情況圖13：稀釋104倍的枯草芽孢桿菌在紫外線下照射30s后的生長情況圖14：稀釋105倍的枯草芽孢桿菌在紫外線下照射20s后的生長情況圖15：稀釋106倍的枯草芽孢桿菌的生長情況圖16：稀釋107倍的枯草芽孢桿菌的生長情況圖17：稀釋108倍的枯草芽孢桿菌的生長情況圖18：觀察透明圈直徑與菌落直徑的比值。左為實驗組，右為對照組。左圖比值約為2，右圖比值約為1.5，說明紫外線有一定的誘變作用。（五）紫外線殺菌效果的觀察：圖19：紫外線殺菌效果的觀察遮光部分細(xì)菌生長的更好，說明紫外線有一定的殺菌效果。六、討論：1.溫度對粘質(zhì)賽氏桿菌生長的影響實驗中，30℃和25℃實驗條件下的菌落顏色只有細(xì)微差別。其原因可能有兩個：一是接種時兩個板的接種量不同，25℃原細(xì)菌數(shù)要多一些；二是培養(yǎng)時間較短，細(xì)菌色素積累量沒有達(dá)到可以區(qū)分的量。因此可以延長細(xì)胞培養(yǎng)時間來進(jìn)一步確定粘質(zhì)賽氏桿菌生長的最適溫度。2.推測各化學(xué)物質(zhì)的抑菌能力時，75%乙醇的實驗組中并未出現(xiàn)透明圈，然而這并不能說明乙醇沒有抑菌能力。乙醇揮發(fā)性很強(qiáng)，很可能在實驗中迅速揮發(fā)掉了，所以沒有起到抑菌作用。從這個實驗中我們也可以看出，紫藥水的消毒能力是很強(qiáng)的，因此平時生活中，如果出現(xiàn)小的傷口，用紫藥水消毒是一個不錯的選擇。3.從生物因素對微生物生長影響的實驗中可以看出，鏈霉素和青霉素的抗菌譜基本上是互補(bǔ)的。青霉素抗菌譜主要是革蘭氏陽性菌和部分陰性菌而鏈霉素則相反。4.紫外誘變實驗中，可用數(shù)據(jù)量很小，實驗誤差很大，因此得不到準(zhǔn)確的結(jié)果。對照組中的菌落的HC值大約為1。5，而誘變組出現(xiàn)了HC值大于2的菌落，說明紫外線的誘變效果還是比較明顯的。理論上突變率和照射時間正相關(guān)。在誘變時需要把握致死率和突變率的平衡點，即掌握好紫外線照射時間。過長則細(xì)菌存活量少，過短則突變率低。5.未知菌S3的鑒定。通過幾次試驗，我們測出未知菌S3為革蘭氏陰性菌，最適生長溫度在37℃左右，其生理生化反應(yīng)情