細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)2011.12.13細(xì)胞培養(yǎng)概述細(xì)胞培養(yǎng)（cellculture）：從體內(nèi)取出組織或細(xì)胞，在體外模擬體內(nèi)的生理環(huán)境，在無(wú)菌、適宜溫度和一定營(yíng)養(yǎng)條件下使其生長(zhǎng)，并維持其結(jié)構(gòu)和功能的方法。細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)是生命科學(xué)中常用的研究手段，亦是生命科學(xué)各研究領(lǐng)域的基礎(chǔ)技術(shù)和基本技能。細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)的基本要求實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備：超凈臺(tái)紫外線消毒30min；無(wú)菌室每周消毒1-2次；所用器材要經(jīng)過(guò)嚴(yán)格消毒；操作前用消毒液浸泡手或用75%酒精擦拭。實(shí)驗(yàn)后要求：關(guān)閉超凈臺(tái)風(fēng)機(jī)；用酒精紗布擦拭超凈臺(tái)臺(tái)面，紫外線消毒。細(xì)胞培養(yǎng)條件合成培養(yǎng)基：根據(jù)體內(nèi)細(xì)胞生存所需的物質(zhì)種類和數(shù)量，用化學(xué)物質(zhì)模擬合成。常用的培養(yǎng)基有RPMI-1640、DMEM、IMDM等。血清：胎牛血清、新生牛血清、小牛血清。抗菌素：抑制可能存在的細(xì)菌和霉菌的生長(zhǎng)，而不影響細(xì)胞的生長(zhǎng)。常用青、鏈霉素；慶大霉素等。消化液（培養(yǎng)貼壁細(xì)胞用）：0.25%胰蛋白酶、EDTA液pH調(diào)整液NaHCO3溶液：常用濃度為5.6%和7.4%Hepes液：可較長(zhǎng)時(shí)間保持較強(qiáng)的緩沖作用培養(yǎng)條件：無(wú)菌、３７℃、５％ＣＯ２細(xì)胞培養(yǎng)基本技術(shù)細(xì)胞原代培養(yǎng)：從供體獲取組織細(xì)胞的首次培養(yǎng)。原代細(xì)胞離體時(shí)間短，在一定程度上能反映體內(nèi)的生長(zhǎng)特性。適合作藥物測(cè)試、細(xì)胞分化和轉(zhuǎn)化等實(shí)驗(yàn)研究。細(xì)胞傳代培養(yǎng)：原代培養(yǎng)細(xì)胞長(zhǎng)到一定密度時(shí)，需進(jìn)行傳代培養(yǎng)?！虘腋∩L(zhǎng)細(xì)胞傳代：離心法√半懸浮生長(zhǎng)細(xì)胞傳代：直接吹打法√貼壁生長(zhǎng)細(xì)胞傳代：胰酶消化法細(xì)胞培養(yǎng)常見(jiàn)污染及處理方法細(xì)菌污染處理:將污染孔內(nèi)液體棄掉，加入硫酸銅或5mol/LNaOH;重要克隆洗滌數(shù)次后,大劑量聯(lián)用抗生素效果較好;反復(fù)洗滌后注射到小鼠腹腔中(限用于某些細(xì)胞)培養(yǎng)液變混濁，pH改變;細(xì)胞發(fā)生病理改變，胞內(nèi)顆粒增多、增粗，最后變圓脫落死亡。處理:應(yīng)用達(dá)克寧、咪唑康；處理CO2孵箱真菌污染培養(yǎng)液中漂浮著白色或淺黃色的小點(diǎn)，培養(yǎng)液一般不發(fā)生混濁；鏡下可見(jiàn)絲狀、管狀或樹(shù)枝狀的菌絲縱橫交錯(cuò)在細(xì)胞之間，有的呈鏈狀排列;細(xì)胞生長(zhǎng)變慢，最后由于營(yíng)養(yǎng)耗盡及毒性作用而使細(xì)胞脫落死亡。支原體污染難發(fā)現(xiàn),難去除;預(yù)防為主新一代支原體抗生素可殺滅支原體一般過(guò)濾除菌無(wú)法去除，光鏡下難以看清形態(tài)結(jié)構(gòu);能在偏堿條件下生存;對(duì)青霉素有抗藥性;多吸附于細(xì)胞表面或散在于細(xì)胞之間;多數(shù)細(xì)胞污染后無(wú)明顯變化如果發(fā)現(xiàn)破碎的細(xì)胞甚多，培養(yǎng)細(xì)胞需要頻繁改善營(yíng)養(yǎng)環(huán)境才能支持長(zhǎng)期傳代培養(yǎng)時(shí)，應(yīng)該懷疑支原體污染處理:

更換血清;增加細(xì)胞的接種密度，以提高細(xì)胞的生存率黑膠蟲(chóng)污染可以穿過(guò)濾膜.低倍鏡下為黑色點(diǎn)狀,高倍鏡下可見(jiàn)黑點(diǎn)游動(dòng);培養(yǎng)液一般不受影響;細(xì)胞增殖旺盛時(shí)可自然消失淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)2010.12.21淋巴細(xì)胞在體外培養(yǎng)時(shí)，受到刺激劑的刺激后可表現(xiàn)為細(xì)胞體積增大、代謝旺盛、蛋白質(zhì)和核酸合成增加，即向淋巴母細(xì)胞轉(zhuǎn)化和增殖。此現(xiàn)象稱為淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化現(xiàn)象（簡(jiǎn)稱為淋轉(zhuǎn)）。淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率的高低可以反映機(jī)體的免疫水平，因此可作為測(cè)定機(jī)體免疫功能的指標(biāo)之一。原理作用于人和小鼠T/B淋巴細(xì)胞的重要絲裂原對(duì)T/B淋巴細(xì)胞的粗增殖作用人T細(xì)胞人B細(xì)胞小鼠T細(xì)胞小鼠B細(xì)胞刀豆蛋白A（ConAn）+_+_植物血凝素（PHA）+_+_美洲商陸（PWM）++++脂多糖（LPS）___+葡萄球菌A蛋白菌體（SAC）___+分離人外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMC）分離人淋巴細(xì)胞(磁珠分離，流式細(xì)胞術(shù))淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)實(shí)驗(yàn)流程實(shí)驗(yàn)流程

－－PBMC的分離基本原理：由于血液標(biāo)本中各種細(xì)胞比重不同，紅細(xì)胞、中性粒細(xì)胞比重為1.092，單個(gè)核細(xì)胞（淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞）比重為1.075－1.090；Ficoll比重為1.077±0.001。將血液標(biāo)本置于分層上，經(jīng)離心沉淀，比重高的紅細(xì)胞、多核白細(xì)胞沉于管底，而比重小的淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞懸浮于血漿和分層液的界面層中。實(shí)驗(yàn)流程

－－淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)基本原理：在特異性抗原刺激下可使相應(yīng)淋巴細(xì)胞克隆發(fā)生增殖；有絲分裂原可作為多克隆刺激劑，使相應(yīng)淋巴細(xì)胞發(fā)生增殖。形態(tài)計(jì)數(shù)法、MTT法、CCK-8法、同位素法。

（一）形態(tài)計(jì)數(shù)法：計(jì)數(shù)淋巴母細(xì)胞的比例，計(jì)算轉(zhuǎn)化百分率。

（二）MTT法：MTT是一種噻唑鹽?；罴?xì)胞內(nèi)線粒體琥珀酸脫氫酶以MTT為底物，形成藍(lán)色的甲臜（Formazan）顆粒沉積于細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞周圍，經(jīng)ＤＭＳＯ溶解后為紫色溶液，可用酶標(biāo)測(cè)定儀測(cè)定OD570的值。實(shí)驗(yàn)流程

－－結(jié)果觀察（四）3H-TdR摻入法：3H-TdR即胸腺嘧啶核苷，是DNA合成的前體。加入細(xì)胞培養(yǎng)液中后被細(xì)胞攝取作為DNA合成的原料。細(xì)胞合成的DNA越多，則所摻入的3H-TdR就越多。該方法與MTT比較，靈敏度高、準(zhǔn)確性好。（三）CCK-8(CellCountingKit-8)法:原理同ＭＴＴ法。是ＭＴＴ的升級(jí)替代產(chǎn)品，可被還原成橙黃色的甲臜，且為水溶性。本方法重復(fù)性好，靈敏度高，對(duì)細(xì)胞的毒性低。

實(shí)驗(yàn)流程

－－結(jié)果觀察取靜脈血3ml,用PBS（吸管1）稀釋1倍（滴管1）（共6ml）將稀釋好的靜脈血沿管壁緩慢加入到淋巴細(xì)胞分離液（3ml）的上方（滴管1）,2000rpm,20min將滴管（滴管2）插入到白膜層，吸取單個(gè)核細(xì)胞層，轉(zhuǎn)移至另一離心管中，加入PBS（吸管1）至5ml,1500rpm,10min.棄上清，再洗滌細(xì)胞1次（吸管1）（滴管2）.離心之前計(jì)數(shù)細(xì)胞棄上清,加入完全培養(yǎng)基（吸管2）,重懸細(xì)胞（滴管2）.將細(xì)胞濃度調(diào)整為2*106個(gè)/ml.將細(xì)胞加入96孔板（加樣槍）,100ul/孔A組：加入不同濃度的ConA,100ul/孔.每個(gè)濃度為2復(fù)孔.留2個(gè)孔僅加入培養(yǎng)基，作為空白對(duì)照.

B組：加入100ulConA(10ug/ml),則終濃度為5ug/ml.4復(fù)孔.設(shè)空白對(duì)照.實(shí)驗(yàn)步驟A組：置培養(yǎng)箱中培養(yǎng)66h,加入MTT溶液20ul/孔,繼續(xù)培養(yǎng)6hr后,去掉上清,加入DMSO100ul/孔,棄分混勻,測(cè)OD570nm值.

B組：置培養(yǎng)箱中培養(yǎng)66