外源基因在畢赤酵母中表達(dá)水平的預(yù)測表達(dá)產(chǎn)物的SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分離分析鑒定

分析其他目的基因在畢赤酵母中高效表達(dá)的概率綜合性設(shè)計(jì)性實(shí)驗(yàn)-2相關(guān)幫助需要相關(guān)抗體試劑的可以訪問Fantibody全球抗體搜索引擎fantibody全球抗體搜索引擎是一個(gè)供公共檢索的抗體數(shù)據(jù)庫，其抗體信息數(shù)據(jù)來源于全球范圍的研究機(jī)構(gòu)與商業(yè)公司。該引擎由商品化抗體數(shù)據(jù)庫與抗體應(yīng)用評價(jià)數(shù)據(jù)庫兩部分組成，以幫助研究者更高效的尋找并評估該抗體的性能。全球抗體搜索引擎是繼基因與蛋白數(shù)據(jù)庫之后更為復(fù)雜的應(yīng)用型檢索平臺需要相關(guān)的實(shí)驗(yàn)室儀器設(shè)備、生物試劑、醫(yī)療器械、制藥設(shè)備、醫(yī)藥原料、體外診斷試劑及耗材與技術(shù)服務(wù)信息的，可以訪問探生網(wǎng)biomean進(jìn)行咨詢，期待您的加入

第一部分：外源基因在畢赤酵母中高效表達(dá)的預(yù)測第二部分：畢赤酵母蛋白表達(dá)產(chǎn)物的SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分離分析鑒定第三部分：分析其他目的基因在畢赤酵母中高效表達(dá)的概率此實(shí)驗(yàn)共包括如下三個(gè)部分微觀的酵母細(xì)胞5'AOX1啟動(dòng)子片段含有AOX1啟動(dòng)子，在甲醇的誘導(dǎo)下可啟動(dòng)外源蛋白的表達(dá)；

α-因子信號肽序列為約89個(gè)氨基酸的信號肽序列，能使外源蛋白分泌到發(fā)酵上清中，更利于外源蛋白的純化；多克隆位點(diǎn)含多個(gè)酶切位點(diǎn)，為外源基因的插入提供位點(diǎn)；

TT序列提供有效的轉(zhuǎn)錄終止和polyA修飾信號；

HIS4為營養(yǎng)缺陷型篩選標(biāo)志；

3'AOX1基因片段能夠與基因組AOX1基因?qū)偻粗亟M；抗Amp基因和pBR322能使空載體和構(gòu)建的表達(dá)載體在E.coli中篩選和復(fù)制。畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)中常用載體的基本結(jié)構(gòu)pPIC9載體的信號肽序列和多克隆位點(diǎn)甲醇酵母系統(tǒng)高效表達(dá)影響因素載體穩(wěn)定性：是整合還是粘附到酵母染色體上基因劑量：單/多拷貝甲醇利用表型：Muts(利用甲醇慢型)，Mut+(利用甲醇快型)mRNA5′端：應(yīng)盡量避免在UTR區(qū)出現(xiàn)AUG和次級結(jié)構(gòu)AT含量：AT含量越高、越容易出現(xiàn)類似于終止子的結(jié)構(gòu)表達(dá)產(chǎn)物穩(wěn)定性：分泌表達(dá)時(shí)，胞外蛋白酶是要影響因素外源基因的3'末端的最低自由能穩(wěn)定性對于實(shí)現(xiàn)目的基因在畢赤酵母中成功高效表達(dá)是比較重要的因素，汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室李恩民教授課題組聯(lián)合北京軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院李伍舉教授課題組建立了一個(gè)針對pPIC9表達(dá)載體在畢赤酵母中高效表達(dá)的數(shù)學(xué)模型。模型構(gòu)建原理收集40例應(yīng)用pPIC9載體在畢赤酵母GS115株中表達(dá)目的基因的數(shù)據(jù)。擬定以表達(dá)量100mg/L為界限，將40例目的基因表達(dá)水平分為高/低兩組。確認(rèn)表達(dá)載體的翻譯終止密碼子前后各100bp的序列，據(jù)此對每個(gè)數(shù)據(jù)構(gòu)建200bp的片段。從上述每個(gè)基因的200bp片段，截取9,000個(gè)區(qū)間，截取方式為[X,Y],X和Y在200bp片段的范圍為1≤X≤100,和111≤Y≤200。使用RNAfold軟件對每個(gè)區(qū)間計(jì)算最低自由能，構(gòu)建最低自由能矩陣。使用Tclass程序?qū)ψ畹妥杂赡芫仃囘M(jìn)行t檢驗(yàn)及判別分析，得到理論上可以判別表達(dá)水平高低的6個(gè)區(qū)間組合。外源基因在畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)中高效表達(dá)預(yù)測的網(wǎng)頁服務(wù)器

分析流程：在“sequence”方框中輸入由目的基因末端100bp及其后面的載體100bp組成的200bp序列片段；點(diǎn)擊底下的“Evaluation”按鈕，在“Evaluation”方框中顯示預(yù)測的結(jié)果；如果結(jié)果顯示低于0.5，則可點(diǎn)擊“Design”這個(gè)按鈕，則顯示根據(jù)密碼子使用改造后的序列。用該軟件來預(yù)測NGAL在畢赤酵母高效表達(dá)的概率截取NGALcDNA3‘末端最后100bp堿基（包括終止密碼子TGA），與pPIC9載體EcoRI位點(diǎn)后100bp堿基（包括EcoRI位點(diǎn)）組成200bp的序列片段，用RNAfold軟件計(jì)算[18,123],[31,140],[35,150],[90,118],[90,151]和[95,135]六個(gè)區(qū)間的最低自由能（RNAfold的溫度參數(shù)設(shè)為30℃）。其數(shù)值運(yùn)算于1,000個(gè)判別函數(shù)，結(jié)果表明NGAL在畢赤酵母中高效表達(dá)的概率為0.512，雖然0.512僅略高于0.5，但我們?nèi)韵胪ㄟ^表達(dá)這個(gè)基因來驗(yàn)證酵母高效表達(dá)的數(shù)學(xué)模型。帶電質(zhì)點(diǎn)在電場中向帶有異相電荷的電極移動(dòng)，這種現(xiàn)象稱為電泳。電泳使用不同的支持介質(zhì)，早期有濾紙、玻璃珠、淀粉粒、纖維素粉、海砂、海綿、聚氯乙烯樹脂；以后有淀粉凝膠、瓊脂凝膠、醋酸纖維素膜，現(xiàn)在則多用聚丙烯酰胺（PAGE）和瓊脂糖凝膠。電泳的概念和分類 聚丙烯酰胺凝膠是由單體丙烯酰胺(acrylamide，簡稱Acr)和交聯(lián)劑N,N-甲叉雙丙烯酰胺(N,N-methylene-bisacylamide，簡稱Bis)在加速劑N,N,N,N-四甲基乙二胺(N,N,N,N-tetramethylethylenediamine，簡稱TEMED)和催化劑過硫酸銨(ammoniumpersulfate(NH4)2S2O8，簡稱AP)或核黃素(ribofavin即vitaminB2，C17H20O6N4)的作用下聚合交聯(lián)成三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠，以此凝膠為支持物的電泳稱為聚丙烯酰胺凝膠電泳(polyacrylamidegelelectrophoresis，簡稱PAGE)。單體丙烯酰胺和N,N-甲叉雙丙烯酰胺的聚合催化劑AcrBis聚丙烯酰胺凝膠電泳(聚丙烯酰胺凝膠中主要取決于三種因素：蛋白大小，形狀和電荷。SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳:是在聚丙烯酰胺凝膠系統(tǒng)中引進(jìn)SDS（十二烷基硫酸鈉）。1967年，Shapiro等人首先發(fā)現(xiàn)，如果在聚丙烯酰胺凝膠電泳系統(tǒng)中加入一定量的十二烷基硫酸鈉（SDS），則蛋白質(zhì)分子的電泳遷移率主要取決于蛋白質(zhì)的分子量大小。SDS的原理SDS的分子式當(dāng)分子量在15KD到200KD之間時(shí)，蛋白質(zhì)的遷移率和分子量的對數(shù)呈線性關(guān)系，符合下式：logMW=K-bX式中：MW為分子量，X為遷移率，k、b均為常數(shù)，若將已知分子量的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)的遷移率對分子量對數(shù)作圖，可獲得一條標(biāo)準(zhǔn)曲線，未知蛋白質(zhì)在相同條件下進(jìn)行電泳，根據(jù)它的電泳遷移率即可在標(biāo)準(zhǔn)曲線上求得分子量。有許多蛋白質(zhì)是由亞基（如血紅蛋白）或兩條以上肽鏈（如胰凝乳蛋白酶）組成的，它們在SDS和巰基乙醇作用下，解離成亞基或單條肽鏈，因此這一類蛋白質(zhì)，測定時(shí)只是它們的亞基或單條肽鏈的分子量。分子量相對遷移率被分離物質(zhì)分子量與凝膠濃度的選擇按照緩沖液的pH值和凝膠孔徑的差異及有無濃縮效應(yīng)分為連續(xù)系統(tǒng)和不連續(xù)系統(tǒng)兩大類：連續(xù)系統(tǒng)電泳體系中緩沖液pH值及凝膠濃度相同，帶電顆粒在電場作用下，主要靠電荷和分子篩效應(yīng)分離。不連續(xù)系統(tǒng)中由于緩沖液離子成分、pH、凝膠濃度以及電位梯度的不連續(xù)性，帶電顆粒在電場中泳動(dòng)不僅有電荷效應(yīng)，分子篩效應(yīng)，還具有濃縮效應(yīng)，因而其分離條帶清晰度及分辨率均較前者佳。SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分類：濃縮膠的作用濃縮膠的作用是有堆積作用，凝膠濃度較小，孔徑較大，把較稀的樣品加在濃縮膠上，經(jīng)過大孔徑凝膠的遷移作用而被濃縮至一個(gè)狹窄的區(qū)帶。當(dāng)樣品液和濃縮膠選Tris/HCL緩沖液，電級液選Tris/甘氨酸。電泳開始后，HCL解離成氯離子，甘氨酸解離出少量的甘氨酸根離子。蛋白質(zhì)帶負(fù)電荷，因此一起向正極移動(dòng)，其中氯離子最快，甘氨酸根離子最慢，蛋白居中。電泳開始時(shí)氯離子泳動(dòng)率最大，超過蛋白，因此在后面形成低電導(dǎo)區(qū)，而電場強(qiáng)度與低電導(dǎo)區(qū)成反比，因而產(chǎn)生較高的電場強(qiáng)度，使蛋白和甘氨酸根離子迅速移動(dòng)，形成以穩(wěn)定的界面，使蛋白聚集在移動(dòng)界面附近，濃縮成一中間層。A.為電泳前2層凝膠排列順序，2層膠中均有快離子，慢離子

B.顯示電泳開始后，蛋白質(zhì)樣品夾在快、慢離子之間被濃縮成極窄的區(qū)帶。

C.顯示蛋白質(zhì)樣品分離成數(shù)個(gè)區(qū)帶。電泳中離子運(yùn)動(dòng)示意圖固體相上的蛋白質(zhì)針對蛋白質(zhì)的特異性抗體，稱為一抗帶上辣根過氧化物酶針對一抗的抗體，稱為二抗加入底物，在酶的作用下，分解產(chǎn)生熒光垂直電泳系統(tǒng)蛋白轉(zhuǎn)膜系統(tǒng)陽極陰極濾紙凝膠膜多孔墊片轉(zhuǎn)膜系統(tǒng)各組件及其位置NGAL（neutrophil

gelatinase-associatedlipocalin）即中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運(yùn)載蛋白，是脂質(zhì)運(yùn)載蛋白（lipocalin)家族的一個(gè)成員。NGAL基因的蛋白產(chǎn)物具有保護(hù)調(diào)節(jié)基質(zhì)金屬蛋白酶-9的活性，作為小分子鐵配合物結(jié)合蛋白參與機(jī)體鐵代謝和天然免疫反應(yīng)等功能。另外，NGAL作為一種早期標(biāo)志物還可以幫助判定缺血性腎損傷程度。

NGAL的mRNA信息在NCBI核酸數(shù)據(jù)庫中有來自不同實(shí)驗(yàn)室登記的多個(gè)版本，包含完整編碼區(qū)的有BC033089和NM_005564等，編碼區(qū)長為597bp，編碼198個(gè)氨基酸，包含了N端前部長為20個(gè)氨基酸的信號肽序列（為核酸序列的1-60bp）。NGAL基因的簡介NGAL核酸編碼區(qū)序列及其相應(yīng)的蛋白序列：由N端的310螺旋、C端的α螺旋和中間的八段反平行式β折疊構(gòu)成了一個(gè)β折疊桶結(jié)構(gòu)；在β折疊桶底部內(nèi)側(cè)排列著疏水的芳香族和脂肪族氨基酸殘基，形成了一個(gè)疏水核或疏水內(nèi)部，為結(jié)合親脂性配體提供了位點(diǎn)；NGAL在其β折疊桶封閉端的β4-β5環(huán)上有游離的巰基(C87)，這可使NGAL與一些蛋白質(zhì)分子，如MMP-9，形成分子間二硫鍵，并以此來調(diào)節(jié)這些蛋白的功能或活性。NGAL的蛋白三級結(jié)構(gòu)（圖為NGAL蛋白的同源二聚體）：以往，汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室李恩民教授課題組利用大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng)獲得了NGAL蛋白，但是由原核表達(dá)系統(tǒng)對外源蛋白沒有類似真核細(xì)胞中的蛋白修飾，如磷酸化和糖基化，有可能影響這些蛋白在功能研究實(shí)驗(yàn)中的效果，為此，我們選擇了畢赤酵母這種真核表達(dá)系統(tǒng)來表達(dá)NGAL蛋白。由大腸桿菌表達(dá)獲得的NGAL蛋白實(shí)驗(yàn)步驟獲得含目的蛋白的酵母上清

SDS電泳蛋白質(zhì)印跡利用畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行NGAL蛋白外源表達(dá)進(jìn)行驗(yàn)證的實(shí)驗(yàn)技術(shù)路線：構(gòu)建表達(dá)載體→轉(zhuǎn)化至酵母菌中→篩選陽性轉(zhuǎn)化單克隆→篩選高表達(dá)單克隆挑單克隆于培養(yǎng)液振蕩培養(yǎng)3～5天，加甲醇誘導(dǎo)目的蛋白的表達(dá)離心酵母上清將玻璃板用蒸餾水洗凈晾干,準(zhǔn)備2個(gè)干凈的小燒杯；把玻璃板在灌膠支架上固定好，放好密封條和隔離板,固定玻璃板時(shí)，兩邊用力一定要均勻，防止夾壞玻璃板;按照下表配制12％分離膠與4％濃縮膠；樣品的制備：樣品和標(biāo)準(zhǔn)蛋白分別與5倍上樣緩沖液按5：1的比例混勻，并在100度沸水浴中煮5min，取出待用；SDS凝膠的制作

凝膠的成分聚丙烯酰胺具有神經(jīng)毒性，操作時(shí)要戴手套按比例配好分離膠,用移液管快速加入，大約5厘米左右,之后加少許蒸餾水（或異丙醇除泡），靜置至膠凝固；凝膠配制過程要迅速,催化劑TEMED要在注膠前再加入，否則凝結(jié)無法注膠。注膠過程最好一次性完成，避免產(chǎn)生氣泡；水封的目的：保持分離膠上沿平直，排氣泡；膠凝好的標(biāo)志：膠與水層之間形成清晰的界面；倒出水并用濾紙把剩余的水分吸干，按比例配好濃縮膠，連續(xù)平穩(wěn)加入縮膠至離邊緣5mm處，迅速插入梳子，靜置到膠凝固。梳子需一次平穩(wěn)插入，梳口處不得有氣泡,梳底需水平。拔出樣梳后,拆掉密封條，在內(nèi)槽中加入緩沖液；上樣：

marker5μl

樣品20μl+5×上樣buffer5μl共25μl

上樣時(shí)要記清上樣的順序微量注射器不可過低,以防刺破膠體；也不可過高,樣品下沉?xí)r易發(fā)生擴(kuò)散，溢出加樣孔接通電源，100V恒壓電泳，至溴酚藍(lán)距凝膠邊緣約0.5～1cm時(shí)，約2.5h，停止電泳；凝膠的處理：剝離與染色：電泳結(jié)束后，撬開玻璃板，剝膠時(shí)要小心,保持分離膠完好無損,將分離膠做好標(biāo)記后放在大培養(yǎng)皿內(nèi)，加入考馬斯亮藍(lán)染色染色液，染色約4h；染色后的凝膠板用脫色液脫色0.5h，直到蛋白質(zhì)區(qū)帶清晰。蛋白質(zhì)印跡操作將PVDF膜先置于100%甲醇中浸濕15s，然后移至超純水中浸泡2min，最后轉(zhuǎn)至轉(zhuǎn)移液中至少平衡5min；電泳完畢的凝膠，剝落到轉(zhuǎn)移液中平衡30min，將轉(zhuǎn)印用的濾紙和海綿墊均用轉(zhuǎn)移液浸濕；將夾子打開使黑的一面保持水平，在上面墊一張海綿墊，用玻棒搟走里面的氣泡，在墊子上墊2張10×10cm的濾紙，用玻棒搟去其中的氣泡；從轉(zhuǎn)移液中取出平衡好的分離膠蓋于濾紙上，用玻棒搟去氣泡，將平衡好的PVDF膜蓋于膠上，并去除氣泡；在膜上蓋2張7.0×8.0cm的濾紙并除去氣泡，最后蓋上另一個(gè)海綿墊，搟幾下就可合起夾子；將夾子放入轉(zhuǎn)移槽槽中，60V轉(zhuǎn)移2h，將膜用超純水漂洗一下，室溫晾干；蛋白質(zhì)印跡操作步驟蛋白印跡系統(tǒng)免疫檢測的操作將膜用100％甲醇浸濕5min，再用超純水漂洗一下，移至含有50ml封閉液的平皿中，室溫下脫色搖床上搖動(dòng)封閉1h；將一抗（大鼠抗人NGAL單克隆抗體）用封閉液1：200稀釋；鋪保鮮膜于實(shí)驗(yàn)臺面，將抗體溶液（每張膜500μl液體）加到保鮮膜上；從封閉液中取出膜，用濾紙吸去殘留液后，將膜蛋白面朝下放于抗體液面上，室溫下孵育2h；用PBST在室溫下脫色搖床上漂洗兩次，每次5min，再用PBS漂洗一次，5min；二抗