乙肝病毒DNA的實驗室檢測第1頁，共24頁，2023年，2月20日，星期三1、熒光定量PCR技術(shù)2、乙肝病毒的感染3、HBV-DNA與臨床第2頁，共24頁，2023年，2月20日，星期三熒光定量PCR技術(shù)第3頁，共24頁，2023年，2月20日，星期三熒光定量PCR技術(shù)Polymerasechainreaction(PCR)，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，是一種DNA的快速擴增技術(shù)。PCR技術(shù)通過兩個短的稱為引物的DNA小片段和一種耐熱酶（TaqDNA聚合酶）的作用，經(jīng)過高溫變性、低溫退火、適溫延伸三個步驟在3個小時內(nèi)反復(fù)循環(huán)25-30次，把特定的DNA片段擴增1000萬倍。每個PCR體系含4種主要成分：含有待擴增序列的DNA模板、引物、TaqDNA聚合酶、脫氧核糖核酸三磷酸（dNTP）第4頁，共24頁，2023年，2月20日，星期三

實時熒光定量PCR技術(shù)，是指在反應(yīng)體系中加入熒光標(biāo)記，利用熒光信號積累實時檢測整個PCR過程，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對PCR終產(chǎn)物的分析，最終實現(xiàn)對未知的起始模版進(jìn)行定量分析的一種技術(shù)，是迄今對已知基因序列的核酸測定中最靈敏的方法。熒光定量PCR技術(shù)第5頁，共24頁，2023年，2月20日，星期三PCR反應(yīng)過程5’5’3’3’d.NTPsTaq酶Primers5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’反應(yīng)組分變性5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’第6頁，共24頁，2023年，2月20日，星期三延伸5’3’5’3’5’3’5’3’3’5’3’TaqTaq5’5’重復(fù)退火第7頁，共24頁，2023年，2月20日，星期三5’3’5’3’5’3’5’3’5’5’3’3’5’3’5’3’循環(huán)24個拷貝循環(huán)38個拷貝5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’3’5’5’3’5’3’5’3’5’3’第8頁，共24頁，2023年，2月20日，星期三熒光定量PCR原理插入染料法

SYBRGreenI雜交探針法(最常用)

TaqMan第9頁，共24頁，2023年，2月20日，星期三TaqMan探針5’5’3’3’d.NTPsTaq酶Primers5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’反應(yīng)體系變性5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’Taql5’3’RQProbe5’3’RQ第10頁，共24頁，2023年，2月20日，星期三5’3’5’3’5’3’RQ退火5’3’1.鏈取代Taq3’QR5’5’3’3’QTaqR5’2.水解3.聚合5’3’QTaqR3’5’4.檢測熒光5’3’3’QTaqR5’l第11頁，共24頁，2023年，2月20日，星期三乙肝病毒的感染第12頁，共24頁，2023年，2月20日，星期三乙肝病毒的感染

（一）乙型肝炎病毒結(jié)構(gòu)及特點HBsAg：是HBV感染的主要標(biāo)志HBsAb：保護(hù)性抗體HBcAg：僅存于感染的肝細(xì)胞核內(nèi)，一般不存在于血循環(huán)中HBcAb:非保護(hù)性抗體，HBcAb-IgM提示HBV處于復(fù)制狀態(tài)HBeAg：HBV復(fù)制及強感染性的指標(biāo)HBeAb：有一定的保護(hù)作用，預(yù)后良好第13頁，共24頁，2023年，2月20日，星期三乙肝病毒的感染（二）HBV-DNA與“兩對半”1.“兩對半”：機體的免疫反應(yīng)狀態(tài)；2.“攜帶者”、“大三陽”、“小三陽”等免疫學(xué)指標(biāo)不能反應(yīng)體內(nèi)病毒復(fù)制水平與感染程度。FQ-PCR：檢測的是HBV本身的遺傳物質(zhì)—DNA，是病毒存在和復(fù)制的最可靠、最直接的指標(biāo)。HBsAg(－)

HBV-DNA(＋)

HBeAg(－)HBV-DNA(＋)3.血清學(xué)指標(biāo)(－)不能排除HBV感染。第14頁，共24頁，2023年，2月20日，星期三乙肝病毒的感染5.HBeAg陽性標(biāo)本HBVDNA檢出率90％左右

HBeAg與HBVDNA有著良好的相關(guān)性4.也可能出現(xiàn)HBsAg(＋)，HBV-DNA(－)。第15頁，共24頁，2023年，2月20日，星期三乙肝病毒的感染HBVDNAHBVDNA貫穿感染者的終生，是評價病毒復(fù)制的金標(biāo)準(zhǔn)ALT正常增高或者波動正常增高或者波動免疫耐受期免疫清除期非活動或低（非）復(fù)制期再活動期肝組織學(xué)無明顯異常,或輕度炎癥纖維化中度或嚴(yán)重炎癥、纖維化快速進(jìn)展無炎癥或僅有輕度炎癥中度或嚴(yán)重炎癥、肝纖維化臨床診斷慢性HBV攜帶者HBeAg陽性慢性乙型肝炎乙型肝炎肝硬化非活動性HBsAg攜帶者HBeAg陰性慢性乙型肝炎乙型肝炎肝硬化第16頁，共24頁，2023年，2月20日，星期三乙肝病毒的感染慢性HBV感染分期及相關(guān)實驗室檢測指標(biāo)魯鳳民，莊輝，乙型肝炎實驗室診斷研究進(jìn)展2009第17頁，共24頁，2023年，2月20日，星期三HBV-DNA與臨床第18頁，共24頁，2023年，2月20日，星期三HBVDNA檢測的臨床意義HBVDNA是HBV存在最直接的依據(jù)HBVDNA是HBV復(fù)制的標(biāo)志HBVDNA是患者具有傳染性的標(biāo)志HBVDNA對乙肝兩對半起補充作用HBVDNA是目前判斷乙肝抗病毒藥物療效最敏感的指標(biāo)HBVDNA可檢測出隱匿性慢性乙型肝炎第19頁，共24頁，2023年，2月20日，星期三

PCR檢測“窗口期”核酸檢測縮短的“窗口期”的天數(shù)HBV566-15HCV7041-60HIV2210-15有利于獻(xiàn)血員窗口期病毒核酸的篩查和早期診斷提供直接證據(jù)縮短“窗口期”HBVDNA檢測的臨床意義第20頁，共24頁，2023年，2月20日，星期三

調(diào)查表明并不是所有“大三陽”的病人都處于HBV復(fù)制期，具有傳染性；也不是所有“小三陽”的病人HBV都無復(fù)制。因此，要準(zhǔn)確知道HBV是否處于復(fù)制狀態(tài)，最準(zhǔn)確的方法還是通過檢測HBVDNA來決定。HBVDNA檢測的臨床意義第21頁，共24頁，2023年，2月20日，星期三第22頁，共24頁，2023年，2月20日，星期三第23頁，共24頁，2023年，2月20日，星期三HBVDNA檢測的臨床意義