分子生物學(xué)蛋白組學(xué)第1頁，共75頁，2023年，2月20日，星期四梁漱溟-做學(xué)問的八個境界形成主見發(fā)現(xiàn)不能解釋的事情融會貫通知不足以簡御繁運(yùn)用自如一覽眾山小通透精髓-言簡意賅實用-會用-駕輕就熟歸納-系統(tǒng)化比較-推敲-設(shè)問求證-旁征博引問題-疑惑中心思想辨真?zhèn)?證優(yōu)劣-識差別文獻(xiàn)的閱讀-理解-掌握的八個步驟意義-方法-應(yīng)用第2頁，共75頁，2023年，2月20日，星期四Inviewofproteinexpression,whatcancausethedifferenceincolorsensitivity?Feb26,2015Internet第3頁，共75頁，2023年，2月20日，星期四

驗證Validation

闡明機(jī)制Mechanism

假說（基因型-候選基因）Hypothesis-CandidateGene求證Test

生物表象-疾?。ū硇停㏄henomenon

假說主導(dǎo)的生物系統(tǒng)科研思維邏輯PHTMV給予或剝奪候選基因功能GainorLossofCandidateGeneFunction

生物表象或疾病PhenomenonorDisease候選基因功能體現(xiàn)/喪失系統(tǒng)的組份-結(jié)構(gòu)-功能Component-Structure-Function

候選基因-作用方式，等CandidateGene-style,etc.分子機(jī)制驗證于新的生物系統(tǒng)Mechanismvalidatedinanewbio-system第4頁，共75頁，2023年，2月20日，星期四LogicalEvolutionaryofBiochemistryLiu(2010)AnnRevBiochem分析-研究

組份-結(jié)構(gòu)-功能某種生命癥象重構(gòu)系統(tǒng)分子功能干預(yù)

樣品分析

揭示分子機(jī)制組份-結(jié)構(gòu)-功能分子特性分子復(fù)合物代謝-調(diào)節(jié)環(huán)路轉(zhuǎn)基因動物模型Knock-outKnock-inScientificInterrogationStrategy第5頁，共75頁，2023年，2月20日，星期四Inviewofproteinexpression,whatcancausethedifferenceincolorsensitivity?Feb26,2015Internet第6頁，共75頁，2023年，2月20日，星期四

驗證Validation

闡明機(jī)制Mechanism

生物表象或疾病TraitorDisease求證Test

多個組學(xué)數(shù)據(jù)（DateofMultiomes）

數(shù)據(jù)主導(dǎo)的生物系統(tǒng)科研思維邏輯DTTMVorDDTMV

表型組數(shù)據(jù)（DateofPhenome）

第7頁，共75頁，2023年，2月20日，星期四BiologicalSystemsMultiple-OmicsfromMultiomestoPhenomeRitchie(2015)NatRevGenetic,Synder(2012)Cell-Trait第8頁，共75頁，2023年，2月20日，星期四PhenotypicOutcomesGeneratedGenetically&EpigeneticallybyMulti-OmesRitchie(2015)NatRevGeneticEstrogen→carcinogenicbyproduct→DNAdamage→cancercells↑←dysregulationofcellcycleCYPmutant↑↓↑COMTmutant↑DNArepairXRCC↓↓第9頁，共75頁，2023年，2月20日，星期四Complex-TraitPhenotypesRevealedbyMulti-OmesRitchie(2015)NatRevGenetAsystemsgenomicsapproachestoachieveamorethoroughandinformativeinterrogationofgenotype-phenotypeassociation,throughbuildingamultivariatemodelassociatedwithgivenoutcomes第10頁，共75頁，2023年，2月20日，星期四CategorizationofMulti-StagedAnalysisofPhenotypeRitchie(2015)NatRevGenet第11頁，共75頁，2023年，2月20日，星期四CategorizationofMeta-DimensionalAnalysisRitchie(2015)NatRevGenet第12頁，共75頁，2023年，2月20日，星期四IntroductiontoProteome&ProteomicsTostudyproteinmolecules,theprinciplesofproteinseparationandquantification,andtheidentityanalysisofproteincharacterizationhavetobedeveloped.Proteome

indicatestheentireofproteinscompletelyexpressedbyagenomeoratissueoracelltype.(theentirety)Proteomicsistostudyquantitativechangeinexpressionlevelsofprotein,

andtheirapplicationtodrugdiscovery,diagnosticsandtherapy.(thequantity)Therightstrategythroughproteomicswouldbeappliedtoquantitativelyanalyzetheinducedbiologicalchangesversustheinherentbackgroundexpressionofavarietyofproteinsinsourcesamplestoidentifythedifferenceinproteinexpressionthatmaycausedisease.(comparisonviadifferentialproteinexpression)第13頁，共75頁，2023年，2月20日，星期四定義：蛋白組與蛋白組學(xué)蛋白質(zhì)組（Proteome）在一個細(xì)胞、一個組織、一個個體內(nèi)，由基因組編碼的所有全部的蛋白質(zhì)組分。蛋白質(zhì)組學(xué)（Proteomics）:研究蛋白質(zhì)組的科學(xué)。蛋白質(zhì)的種類、數(shù)量（2維電泳2DE,液相層析LC,質(zhì)譜分析MS,蛋白質(zhì)免疫共沉淀IP&Westernblotting,核糖體輪廓分析RibosomeProfiling）蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)與其它生物大分子的相互作用（酵母雙雜交Y2H,熒光共振的能量傳遞FRET,染色質(zhì)免疫共沉淀ChIP）蛋白質(zhì)的生物學(xué)功能（pathway,circuitry）研究策略（i）組級研究proteome-wideinvestigation(ii)差減比較（subtractivecomparison）第14頁，共75頁，2023年，2月20日，星期四組學(xué)研究的基本策略組級的輪廓研究（Ome-wideProfiling）Massive-Highthroughput-Parallel大規(guī)模-高產(chǎn)出-平行對照（全部、所有）。差別-差減比對（differential-subtractivecomparison）有比較就有鑒別；差別因子就是差別表觀的動因，動因是事物發(fā)生機(jī)制的線索與事物演變的預(yù)設(shè)軌道（差別、差異）。第15頁，共75頁，2023年，2月20日，星期四AnnotationofSubtractiveComparisonofProteome甲乙兩樣品間蛋白質(zhì)的差別：A+b-c-d+e-F-G乙-樣品：B-C-D-E-F-G甲-樣品：A-B-C-D-E?)蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)組級規(guī)模的蛋白質(zhì)輪廓分析與差減比較組級范圍的蛋白質(zhì)的差別：種類-數(shù)量次要差異蛋白-疾病關(guān)聯(lián)次要差異蛋白形成原因-機(jī)制主要差異蛋白-疾病關(guān)聯(lián)主要差異蛋白形成原因-機(jī)制致病機(jī)制-疾病診斷-治療方案-疾病預(yù)后第16頁，共75頁，2023年，2月20日，星期四Inviewofproteinexpression,whatcancausethedifferenceincolorsensitivity?Feb26,2015Internet第17頁，共75頁，2023年，2月20日，星期四蛋白質(zhì)組復(fù)雜性蛋白質(zhì)組復(fù)雜性，（i）是指蛋白質(zhì)組的蛋白質(zhì)數(shù)量-氨基酸序列常與基因組的基因數(shù)量-核苷酸序列不一致（ii）蛋白質(zhì)的功能結(jié)構(gòu)與修飾的多樣性（iii）蛋白復(fù)合物的組成-功能-分布的多樣性基因轉(zhuǎn)錄的始點(diǎn)與終點(diǎn)是可變的。初始mRNA常經(jīng)歷可選擇性剪接，或反式剪接。蛋白質(zhì)常經(jīng)歷翻譯后的修飾，如，P,Ub,Me,poly(ADP),etc。蛋白質(zhì)多以復(fù)合物的形式既參與細(xì)胞的代謝活動又參與細(xì)胞的組成結(jié)構(gòu)。第18頁，共75頁，2023年，2月20日，星期四OverviewonTechnology&ResourceinProteomicsCelis(2003)CancerCell第19頁，共75頁，2023年，2月20日，星期四三個主要應(yīng)用于蛋白組學(xué)的技術(shù)與方法2-維電泳（2-DementionalElectrophoresis2DE）液相層析（LiquidChromatographyLC）質(zhì)譜分析（MassSpectrometryMS）生物信息學(xué)（Bioinformatics）第20頁，共75頁，2023年，2月20日，星期四Spatial&TemporalProteinExpressionTimecourseofexpressionLocationofexpressionTissue-orOrgan-specificexpressionCell-specificexpressionMultipleTestsforProteinIDMSanalysisPMF&P/rDeterminationofN-&C-terminalAAMoleculeWeight,pIDifferencesbetweenSamplesHealthyvsdiseaseInducedvsbackgroundSpeciesvsspeciesOverviewonProteinID&AbundanceDIGE-orLC-MSProteinMicroarrayDatabaseSearchProteinResponse&CoordinationSignalingPathwayMetabolicPathwayProteinParticipatinginDevelopmentProliferationDifferentiationMatterMetabolismAnnotationofProteomicsStrategy蛋白質(zhì)表達(dá)的輪廓分析蛋白質(zhì)相互作用蛋白質(zhì)細(xì)胞綜合功能差減對比組設(shè)立蛋白質(zhì)時-空表達(dá)差別分析多重驗證蛋白質(zhì)ID*蛋白質(zhì)組學(xué)的研究策略第21頁，共75頁，2023年，2月20日，星期四HPLC-MS*TechnologicalStrategy(GE-LC-MS-Database)toProteomicsGapelo(2010)Proteomics第22頁，共75頁，2023年，2月20日，星期四2-維電泳層析分離樣品蛋白質(zhì)制備質(zhì)譜分析肽質(zhì)量指紋(PMF)、峰值比率(P/R)胰蛋白酶電泳蛋白斑點(diǎn)膠切割與酶消化*蛋白質(zhì)組學(xué)研究策略的方法程序蛋白質(zhì)類別與豐度比對蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫第23頁，共75頁，2023年，2月20日，星期四Celis(2003)CellCancerCell第24頁，共75頁，2023年，2月20日，星期四ConceptiononExperimentalPlanningBiologicalReplicates:(i)forcellcultures,animalandplantexperimentsusuallythreebiologicalexperimentstendtobesufficienttodetectinducedbiologicalvariationsonthebackground(ii)forpatientsinclinical,itisadvisedtoanalyzeatleastsixpatientsforcontrol,dieased,andtreatedsamples,ormore.PoolingofSamples:YesorNo?No!Poolingofsamplesisonlyperformedforcreatinganinternalstandardfordifferentialgelelectrophoresis(DIGE).Pre-fractionationofSamples:YesorNo?Yes,itwillincreasethenumberofidentifications.WhatistheBestWorkflowforproteinanalysistoStartWith?2-Dgelallowshigh-throughputanalysisontheproteinlevel.第25頁，共75頁，2023年，2月20日，星期四DIGE原理

DifferentialImagingofGelElectrophoresis

電泳膠熒光差別影像分析不同蛋白樣品標(biāo)記不同染料，1:1混合。1st–等電電泳聚焦

（蛋白等電點(diǎn)）。2nd–SDS-聚丙烯凝膠電泳

（蛋白分子量）。電泳膠分離激光差別掃描的影像-分析

（電泳膠的單個與重疊影像圖上的蛋白質(zhì)斑點(diǎn)位置-色度提示蛋白質(zhì)ID與豐度）。DIGE電泳影像上的蛋白質(zhì)斑點(diǎn)位置，代表該類蛋白質(zhì)分子量和等電點(diǎn)；斑點(diǎn)色度代表該類蛋白質(zhì)在對比的樣品中其含量上的差別。第26頁，共75頁，2023年，2月20日，星期四熒光差別掃描與影像紀(jì)錄依樣品標(biāo)記的染料選擇激光波長鑒別蛋白質(zhì)類別與豐度依蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫單個、重疊電泳影像分析依蛋白電泳斑點(diǎn)位置-色度（檢測-對照）蛋白質(zhì)標(biāo)記不同染料蛋白質(zhì)樣品（檢測：對照）1:1混合2-維電泳分離（Mw&pI）DIGE方法程序第27頁，共75頁，2023年，2月20日，星期四等電點(diǎn)電泳聚焦IEF

IsoelectricElectrophoresisFocusingIEFforPurposes:1stdimensionalfractionationofproteinmixturesinhigh-resolution2-DelectrophoresisPre-fractionationofproteinmixturesaccordingtochargeFortheseparationofveryheterogeneousmixturesoftrypticpeptides等電點(diǎn)電泳聚焦理論基礎(chǔ)

IEF是在含有pH梯度膠上進(jìn)行的。蛋白質(zhì)是帶電荷的，帶正或負(fù)電荷取決于(i)蛋白分子結(jié)構(gòu),和(ii)環(huán)境pH.環(huán)境pH:在堿性緩沖液,蛋白帶負(fù)電荷；在酸性緩沖液，蛋白帶正電荷。

蛋白等電點(diǎn)(pI):在某個pH,蛋白所帶的凈電荷為零

。IPG非移動pH梯度膠

immobilizedpHgradientIPGStripforIEFpH10.0Cathode(-)pH3.0Anode(+)pH10→3第28頁，共75頁，2023年，2月20日，星期四等電點(diǎn)聚焦原理：蛋白依等電點(diǎn)在pH梯度膠上分離兩性電解質(zhì)與pH梯度:兩性電解質(zhì)（含有多個氨基與多個羧基的脂肪酸分子）的混合物，在電場條件下，自動排列形成pH梯度，負(fù)極具有高pH值，正極具有低pH值。兩性電解質(zhì)特性:(i)在等電點(diǎn)，具有高緩沖和溶解性(ii)良好電導(dǎo)性(iii)無生物學(xué)效應(yīng)(iv)小分子量兩性電解質(zhì)膠:2%(w/v)電解質(zhì),4%(T)電泳膠&3%(C)交聯(lián)度IPG非移動pH梯度膠條:(i)當(dāng)?shù)鞍咨蠘佑贗PG，蛋白可以帶正、負(fù)電荷或零電荷(ii)正電荷蛋白向負(fù)極移動，并停留在相當(dāng)于它等電點(diǎn)的pH處；負(fù)電荷蛋白向正極移動，停留在相當(dāng)于它等電點(diǎn)的pH處。第29頁，共75頁，2023年，2月20日，星期四ImmobilizedpHGradientPolyacrylamideTheGeneralStructureofImmobiline(Ampholyte)第30頁，共75頁，2023年，2月20日，星期四ThePrincipleofIsoelectricElectrophoresisFocusing+H+-H+OrientationofelectricfieldvspHgradientProteinchargedwithcationoranion第31頁，共75頁，2023年，2月20日，星期四*2-DimensionalElectrophoresisExample:Protein2-DE(-)DecreasingpI(+)(-)DecreasingMr(+)LehningerPrincipleofBiochemistryp95(-)(+)pH10pH3斑點(diǎn)位置，代表某類蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)和分子量第32頁，共75頁，2023年，2月20日，星期四不同蛋白樣品標(biāo)記不同染料:染料標(biāo)記幫助區(qū)分不同樣品來源的同類蛋白質(zhì)在混合樣品中的含量?；旌系鞍踪|(zhì)樣品(1:1),進(jìn)行2-維電泳:不同來源的同類蛋白質(zhì)，在電泳中可行進(jìn)在電泳膠上同一位置，但，具有不同的染料顏色。激光差別掃描:依不同染料選擇不同掃描波長，則，不同蛋白樣品來源的蛋白質(zhì)呈現(xiàn)各自顏色的電泳膠影像。結(jié)果分析-閱讀:蛋白斑點(diǎn)的位置代表蛋白質(zhì)類別，斑點(diǎn)的顏色代表該蛋白含量或相對含量。單個電泳膠影像和多個電泳膠影像重疊的分析閱讀。*電泳膠熒光差別影像DIGEDifferentialImagingofGelElectrophoresis第33頁，共75頁，2023年，2月20日，星期四MinimalLabelingofLysinewithCyDye0Cx30minGE(2004)2-DElectrophoresisLysineLabeling(minimallabeling)Inpractice400pmolofdyeisaddedto50ugofprotein.Inthiswayonly3-5%oftheproteinswillreceiveatag(95-97%remainunlabeled)Labelingreaction:noIPGbuffer,noreductant,pH8.5,0ocx30minwithdye,theepsilon-aminosidegroupoflysineislabeledwithdye.第34頁，共75頁，2023年，2月20日，星期四SaturationLabelingofCysteinewithCyDyeCysteineLabeling(saturationlabeling)Thehighsensitivity,downto1000humancells(around2.5ugprotein)couldprovidegood2-DELabelingreaction:noIPGbuffer;TCEPreductantpH8.0,37oC1h;dyeaddedpH8.0,37oC30min;thethiogroupofcysteinelabeledwithdyes(Cy3orCy5).第35頁，共75頁，2023年，2月20日，星期四*DIGE方法程序第36頁，共75頁，2023年，2月20日，星期四*ProcedureforDIGEofProteinSamplesGE(2004)2-DElectrophoresis蛋白樣品標(biāo)記染料熒光差別影像蛋白質(zhì)2-DE分離蛋白斑點(diǎn)位置-色度分析第37頁，共75頁，2023年，2月20日，星期四ExampleforDIGEImageDifferentialWavelength

ProteomicsinPracticep69第38頁，共75頁，2023年，2月20日，星期四Cy3redCy5blueCy2greenIEFSDSImageAnalysisSchematicforDIGEProcedureWestermeier(2008)ProteomicsinPractice第39頁，共75頁，2023年，2月20日，星期四2-DEofMouseLiverExtractGE(2004)2-DElectrophoresis第40頁，共75頁，2023年，2月20日，星期四2-DEofProteinsStainedwithSyproRuby(A)&DeepPurpleStrain(B)AndProteinSpot3-DPlotAnalysisDE(2004)2-DElectrophoresis第41頁，共75頁，2023年，2月20日，星期四ExperimentalStrategyofGE&MSApplication:FusionProteinTagGavin(2002)NatureConstructoffusionproteintagConstructoffusiongeneHRCreateofexpressionlocioffusionprotein第42頁，共75頁，2023年，2月20日，星期四Example:DataAnalysisviaBioinformaticsinProteomicsGavin(2002)NatureActual:Theory第43頁，共75頁，2023年，2月20日，星期四層析柱

：靜止相-層析基質(zhì)，它與蛋白樣品中的各類蛋白組分具有差別的親和結(jié)合力；移動相-蛋白樣品和層析洗脫液，層析洗脫液可以降低-減弱層析基質(zhì)與蛋白組分間的親和結(jié)合力。液相層析原理：蛋白質(zhì)樣品是處于液相中，樣品內(nèi)的各個蛋白質(zhì)組份與層析基質(zhì)之間的不斷結(jié)合-解離作用的強(qiáng)弱差異，決定著各個蛋白質(zhì)組份通過層析基質(zhì)所需要時間的長短，即決定各個蛋白質(zhì)組份通過層析基質(zhì)的慢-快。在層析過程中，弱相互作用的蛋白，最先通過層析柱；強(qiáng)相互作用的蛋白，最后通過層析柱。如此，各個蛋白質(zhì)組份與層析柱的相互作用的強(qiáng)弱不同，它們通過層析柱的次序就有先有后，因而達(dá)到各個蛋白質(zhì)組份經(jīng)層析基質(zhì)逐個被分離。液相層析原理第44頁，共75頁，2023年，2月20日，星期四2-DLC:2-dimensionalliquidchromatographyIEX:ionexchangechromatographyRPC:reversephasechromatographyMALDI:matrixassistantleaserdesorptionionizationHMW:highmolecularweightPMF:peptidemassfingerprintviam/zvalueP/r:theratioofpeaksatsamemass/zvaluebetweendiffsamplesConcentration&HMWcutoffProteinIsolation蛋白質(zhì)提?。ńM織-細(xì)胞-體液）蛋白質(zhì)消化，免疫親和分離2-次液相層析(離子交換和反相層析）4.質(zhì)譜分析(PMF&P/R)鑒別蛋白ID與豐度蛋白數(shù)據(jù)庫比對蛋白質(zhì)層析-質(zhì)譜分析的方法程序第45頁，共75頁，2023年，2月20日，星期四*舉例：離子交換層析分離蛋白質(zhì)的原理圖示Thesequentialorderofproteinstodisassociatefromthesolid-phase(SP)isreversetoproteinaffinitywithSP.Weak(highpI)Strong(lowpI)+++Pr-Pr-Pr2-Peaksequential-site:ProteinIDPeakheight:proteinabundanceProteinscoulddifferentiallyassociatewiththesolid-phase(SP)byproteins’teinstronglyorweaklytoassociatewithSP.AnionExchangeChromatography第46頁，共75頁，2023年，2月20日，星期四MolecularWeightHydrophobicGroupOppositeChargedIonLigandSpecificityHydrophobicGroupofProteins

PrincipleinChromatographicPurificationGE(2004)Handbook第47頁，共75頁，2023年，2月20日，星期四ColumnChromatographyLehningerPrinciplesofBiochemistryp90第48頁，共75頁，2023年，2月20日，星期四第49頁，共75頁，2023年，2月20日，星期四*離子交換層析(IECorIEX)蛋白帶正負(fù)電荷不一

:蛋白的化學(xué)結(jié)構(gòu)，溶液的pH值蛋白帶電量不一:溶液的pH值與蛋白的等電點(diǎn)之間的差距帶電荷的蛋白與帶相反電荷的介質(zhì)（離子交換柱）相互作用，作用的強(qiáng)弱正比于蛋白所帶凈電荷的量影響因素：鹽溶度，洗脫液pH

TheoreticalProteinTitrationCurveASuitableIonExchangerSelectionCationExchangerAnionExchanger第50頁，共75頁，2023年，2月20日，星期四強(qiáng)結(jié)合的蛋白質(zhì)，最后解離被洗脫(具有較低pI的蛋白質(zhì))弱結(jié)合的蛋白質(zhì)，最先解離于離子層析柱，最先被洗脫(具有較高pI的蛋白質(zhì))洗脫液的梯度改變(鹽溶度-pH)蛋白質(zhì)(負(fù))結(jié)合于陰離子交換層析柱(陽)樣品蛋白質(zhì)經(jīng)處理而帶負(fù)電荷pHHtoLAnionConcLtoH*舉例:蛋白質(zhì)經(jīng)陰離子交換層析柱的分離第51頁，共75頁，2023年，2月20日，星期四蛋白質(zhì)被離子化為陽離子或陰離子。離子蛋白在電場或磁場內(nèi)飛行。由于離子蛋白質(zhì)質(zhì)量的差異決定了具有不同質(zhì)量的離子蛋白質(zhì)飛過電場或磁場的快慢。小質(zhì)量離子蛋白-飛行快，大質(zhì)量-飛行慢檢測儀捕獲每一個離子蛋白質(zhì)，依據(jù)它們的飛行時間(TOF)或質(zhì)量/電荷比值(m/z,質(zhì)-荷比值)，進(jìn)行排序(TOF=m/z)，

繪制出質(zhì)譜圖（離子蛋白質(zhì)質(zhì)量對離子蛋白質(zhì)檢測信號強(qiáng)度作圖）。數(shù)據(jù)分析經(jīng)蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫比對(肽質(zhì)量指紋PMF&峰值比率P/R），鑒別-定量樣品中蛋白質(zhì)的類別-含量。*質(zhì)譜分析原理MassSpectrometryMS第52頁，共75頁，2023年，2月20日，星期四*質(zhì)譜分析原理

蛋白質(zhì)離子化帶正或負(fù)電荷離子蛋白質(zhì)飛經(jīng)電場或磁場檢測儀捕獲離子蛋白質(zhì)，計量飛行時間（TOF）或，質(zhì)-荷比值（m/z）數(shù)據(jù)分析與比對蛋白數(shù)據(jù)庫，依據(jù)

PMF(TOForm/z)&P/R;第53頁，共75頁，2023年，2月20日，星期四定義DefinitionTOF(timeofflight):離子蛋白質(zhì)飛經(jīng)電場所需要的時間。蛋白質(zhì)的質(zhì)量不同，則它們飛經(jīng)電場的快慢不一、所需要的時間長短不同。小質(zhì)量離子蛋白-飛行快，大質(zhì)量離子蛋白-飛行慢m/z(masspercharge)：質(zhì)-荷比，單位電荷的離子蛋白質(zhì)所具有的質(zhì)量。蛋白質(zhì)的氨基酸的組成不一（種類-數(shù)量的不一），就具有不同的質(zhì)-荷比。PMF(peptidemassfinger)：能夠代表某類蛋白質(zhì)組成特征的一組多肽的特征質(zhì)量譜圖，被稱為肽質(zhì)量指紋。P/R(peakratio)：峰值比率，質(zhì)譜圖中的所檢測到的離子蛋白質(zhì)的信號強(qiáng)度的比較，代表著所檢測到的離子蛋白質(zhì)的相對含量。第54頁，共75頁，2023年，2月20日，星期四PrincipleforMassSpectrometryMicallef(2010)JHematol&OncolProteinsIonizedwithchargecationoranionProteinsIonizedtoflightthroughelectricfieldProteinsIonizedtobesequentiallycapturedbyDetectorviaTOFMatrix-assistedlaserdesorptionionizationElectrosprayionization第55頁，共75頁，2023年，2月20日，星期四PrincipleforMassSpectrometrySchematicofQuadrupoleTOFHybridAnalyzerWestermeier(2008)ProteomicsinPracticeProteincouldbeionized,representedasm/z.(M/Zvalue)Differentproteinshavingdifferentialm/zvaluemaybeseparatedbyelectricfield,bigion(bigm/z)takesmoretimeofflyingthroughtheelectricfield.(TOF)Detectorcansequentiallycaptureionshavingpassedtheelectricfield,smallion(smallm/z)flyingfastermayfirstbecaptured,andbigiontobelatercaptured.第56頁，共75頁，2023年，2月20日，星期四Example:MSDataDiagram第57頁，共75頁，2023年，2月20日，星期四2x6x*圖示質(zhì)譜分析原理1xMedialLargeSmall第58頁，共75頁，2023年，2月20日，星期四質(zhì)譜數(shù)據(jù)的提呈和閱讀蛋白質(zhì)樣品的質(zhì)譜圖就是該樣品中的各個離子蛋白質(zhì)的質(zhì)-荷比值對它的信號強(qiáng)度作圖。X-軸(m/z，質(zhì)-荷比值):依離子蛋白質(zhì)的質(zhì)-荷比值或離子蛋白質(zhì)飛行時間進(jìn)行排序。

?。欤?前，大（慢）-后Y-軸(SignalIntensity，信號強(qiáng)度):用計數(shù)檢測儀，測量每個離子蛋白質(zhì)的信號強(qiáng)度（每秒計數(shù)或電壓），離子蛋白質(zhì)被檢測的信號強(qiáng)度代表該離子蛋白質(zhì)的含量。注：所測得的信號強(qiáng)度并不能精確反映該離子蛋白質(zhì)的數(shù)量，但其之間是相關(guān)的，這是由于許多干擾因素所致。如，離子大小，離子速率，離子的電荷數(shù)；設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)參可校正誤差。第59頁，共75頁，2023年，2月20日，星期四質(zhì)譜數(shù)據(jù)解讀:PMF&P/R蛋白數(shù)據(jù)庫：蛋白質(zhì)可被水解為許多肽段，每一個肽段都有其特定的分子質(zhì)量與理化特性，如此許多蛋白質(zhì)的信息匯集總和即為蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫，它可作為實驗中被檢測蛋白質(zhì)的比對參考。每類蛋白質(zhì)因其固有的氨基酸組成與序列，在質(zhì)譜分析中可被電離為一組特定的多肽肽段。能夠代表某類蛋白質(zhì)特征的一組特定多肽的特征質(zhì)量譜圖被稱為肽質(zhì)量指紋(PMF)。肽質(zhì)量指紋代表蛋白質(zhì)的類別，即，PMF=ProteinID每個蛋白質(zhì)離子的信號強(qiáng)度，即峰值高低，即為該蛋白質(zhì)離子在此系統(tǒng)中被檢測到的數(shù)量（豐度）。峰值比率(P/R)，在任意兩個蛋白質(zhì)離子的位點(diǎn)上，兩個峰值間的比率就代表著這兩類蛋白質(zhì)離子在此系統(tǒng)內(nèi)的相對豐度。因此，

P/R=蛋白質(zhì)相對豐度ProteinAbundancerelative第60頁，共75頁，2023年，2月20日，星期四質(zhì)譜分析揭示蛋白質(zhì)的信息肽質(zhì)量指紋能揭示蛋白質(zhì)的部分序列信息：

在質(zhì)譜分析中，由于分子碰撞產(chǎn)生的蛋白質(zhì)斷裂總是出現(xiàn)質(zhì)量數(shù)值特定的成對互補(bǔ)離子—N-末端的離子系列(b-離子)和C-末端的離子系列(y-離子)—據(jù)此，邏輯推繹出蛋白質(zhì)的氨基酸排列順序。肽質(zhì)量指紋能揭示蛋白質(zhì)的組成信息：如，蛋白的酸性氨基酸的羧基可以被酯化修飾。在某種條件下，質(zhì)譜分析（經(jīng)比對原初蛋白的質(zhì)譜）即可揭示這類細(xì)微的分子修飾的質(zhì)量改變。質(zhì)譜分析揭示某些蛋白質(zhì)特性：如，蛋白翻譯后的修飾。據(jù)估計，人類蛋白組含有105潛在的磷酸化位點(diǎn)。蛋白翻譯后修飾可改變原初蛋白的質(zhì)量，質(zhì)譜分析可鑒別這類因修飾發(fā)生改變的蛋白質(zhì)質(zhì)量。第61頁，共75頁，2023年，2月20日，星期四*Example:質(zhì)譜分析揭示小肽的氨基酸組成及序列

Campbell(2002)DiscoveringTheprotonatedtotalpeptidemassis1410.6(13-aapeptide).ThepeptidetobeionizedintoN-terminalions(b-ions)andC-terminalions(y-ions).Thealignmentoftheseions,fromsmalltolargeaccordingtotheirm/z,auniquemassspectrumforthepeptide.Thesignalintensity(theheight)ofeachionrepresentstheabundanceofthefragmentioninsystem.Contrastofb-ionstoy-ionscouldinferthepeptidesequence.CampbellAM(2002):p187第62頁，共75頁，2023年，2月20日，星期四

質(zhì)譜分析：蛋白質(zhì)特異結(jié)合位點(diǎn)的染色質(zhì)組蛋白的修飾變化Vermeulen(2010)Cell142:967-980ChIP-ProteinMSAnalysis第63頁，共75頁，2023年，2月20日，星期四Figure6.TripleSILACPulldownsRevealingHistoneModificationCrosstalkThree-dimensionalrepresentationoftheMSsignalofanSgf29peptideidentifiedinatriplepulldownSILACexperiment(them/zscaleisthexaxis,thechromatographicretentiontimeistheyaxis,andtheMS-signalisthezaxis).Eachgroupofsignalsrepresentsthenaturalisotopepatternofthepeptide.TherelativeintensitiesofthetripletpeakoftheSgf29peptideindicatesthepreferenceofbindingtothemodificationstates(unmethylatedhistoneH3peptide[leftpeak],H3K4me3peptide[middlepeak],andthedouble-modifiedH3K4me3/H3K9,14Acpeptide[rightpeak]).Sameas(A)foraPHF8peptideidentifiedinthesametriplepulldown.NuclearextractsderivedfromHeLacellswereincubatedwiththeindicatedhistonepeptides.TheamountofSgf29proteinboundtothesepeptideswasdeterminedbywesternblottingusinganantibodyagainstendogenousSgf29.BacteriallysatesexpressingrecombinantHis-taggedSgf29wereincubatedwiththeindicatedpeptides.Followingincubationandwashes,theamountofboundSgf29proteinwasdeterminedbywesternblottingusingananti-Hisantibody.NotethatSgf29doesnotbindtoapeptidecontainingH3K9,14acetylationandthatthebindingofSgf29toH3K4me3isnotaffectedbyasymmetricdimethylationofH3R2.(E–G)Three-dimensionalrepresentationofanHP1a(E),Orc5(F),andCDYL(G)peptideidentifiedinatriplepulldownSILACexperiment.ThespectrashowtheMS-signalrepresentingtherelativebindingofthesepeptidestotheunmethylatedhistoneH3peptide(leftpeak),theH3K9me3peptide(middlepeak),andthedouble-modifiedH3K9me3/H3S10Ppeptide(rightpeak).HistonepeptidepulldownsinHeLanuclearextractswereperformedwiththeindicatedpeptides.TheamountofHP1aandCDYLbindingtothesepeptideswasdeterminedbywesternblottingusinganantibodyagainstHP1aandCDYL.第64頁，共75頁，2023年，2月20日，星期四*質(zhì)譜分析應(yīng)用:蛋白定量分析

如何鑒別不同來源樣品的蛋白種類與數(shù)量的差別分子標(biāo)簽：用不同質(zhì)量的分子標(biāo)簽標(biāo)記不同的蛋白樣品，就是為了在樣品蛋白組的比較分析中，區(qū)分-鑒別同一類蛋白質(zhì)的不同樣品來源，這是基于質(zhì)譜分析能很好區(qū)分不同的分子標(biāo)簽的細(xì)微質(zhì)量差別，如同位素。在質(zhì)譜分析中,由于不同來源的同類蛋白質(zhì)標(biāo)記著質(zhì)量細(xì)微差別的不同的分子標(biāo)簽，就具有不一致但極為相似的質(zhì)-荷比值(m/z)；它們的峰值比率(P/R)就代表著該類蛋白質(zhì)在不同來源的樣品中的相對含量。在質(zhì)譜分析中，用不同分子標(biāo)簽進(jìn)行樣品標(biāo)記的方法：蛋白消化：在O18

標(biāo)記的水中。代謝標(biāo)記：使用重氨基酸

（S35orN15

）同構(gòu)異質(zhì)的分子標(biāo)簽

，如，重質(zhì)量-ICAT或輕質(zhì)量-ICAT同質(zhì)異構(gòu)的分子標(biāo)簽（具有不同的核磁共振）如，iTRAQ第65頁，共75頁，2023年，2月20日，星期四*舉例:不同質(zhì)量同位素經(jīng)代謝標(biāo)記于蛋白質(zhì)樣品

Campbell(2002)Discoveringp189不同的蛋白樣品標(biāo)記著不同質(zhì)量的同位素。混合樣品（1:1），電泳分離，部分酶消化。質(zhì)譜分離與分析：(1)在每個m/z位點(diǎn),出現(xiàn)成對的峰，意味著標(biāo)記著不同質(zhì)量同位素的同一類蛋白質(zhì)，前峰代表輕同位素標(biāo)記的蛋白質(zhì)，后峰為重同位素標(biāo)記的同一類蛋白質(zhì)。(2)在每個m/z位點(diǎn),成對峰的比率代表著那個蛋白質(zhì)在不同樣品中的相對豐度。123PMFAAseq&constituentofprotein***第66頁，共75頁，2023年，2月20日，星期四*質(zhì)譜圖的解讀（Massgram）成對峰-等高:不同樣品中的同類蛋白質(zhì)因標(biāo)記不同質(zhì)量的同位素而具有相鄰的質(zhì)-荷比值并具有相似的含量。成對峰-不等高:不同樣品中的同類蛋白質(zhì)有著含量上的差別。單個峰:某類蛋白質(zhì)只存在于一個樣品中。2-DE(A:B=1:1),蛋白電泳分離，&斑點(diǎn)切割與消化B-樣品蛋白標(biāo)記為N14A-樣品蛋白標(biāo)記為N15質(zhì)譜分析與閱讀(PMF&P/R)am/zIntensitybm/zIntensitycm/zIntensity第67頁，共75頁，2023年，2月20日，星期四*舉例:質(zhì)譜分析揭示蛋白質(zhì)的磷酸化修飾不同的蛋白樣品標(biāo)記著不同質(zhì)量的同位素?；旌蠘悠罚?:1），電泳分離，部分酶消化。質(zhì)譜分離與分析：蛋白質(zhì)磷酸化，即為Xp;蛋白質(zhì)未磷酸化，即為X。在Xp位