4.4.5絲氨酸蛋白酶水解機(jī)制什么是絲氨酸蛋白酶？絲氨酸蛋白酶是一個(gè)蛋白酶家族，其激活是通過(guò)活性中心一組氨基酸殘基變化實(shí)現(xiàn)的，它們之中一定有一個(gè)是絲氨酸（Ser，serine）。在哺乳類動(dòng)物里面，絲氨酸蛋白酶扮演著很重要的角色，特別是在消化，凝血和補(bǔ)體系統(tǒng)方面。最典型的三種絲氨酸蛋白酶：胰蛋白酶胰凝乳蛋白酶彈性蛋白酶同屬消化酶系，在胰腺泡內(nèi)合成并分泌到十二指腸中。均可催化肽鍵的水解反應(yīng)，但對(duì)肽鍵的選擇性則有所不同這一反應(yīng)過(guò)程具有兩相特征：快速反應(yīng)相：對(duì)硝基苯酚離子快速形成，與酶的濃度成正比。恒態(tài)反應(yīng)相：對(duì)硝基苯酚離子形成較緩慢，形成速率恒定。（決定反應(yīng)速率的關(guān)鍵步驟）快速反應(yīng)相過(guò)程中酶和底物結(jié)合釋放出對(duì)硝基苯酚離子，同時(shí)形成乙?；?酶中間體；而恒態(tài)反應(yīng)相過(guò)程則是乙酰基-酶中間體緩慢水解，放出酶，使之與底物相結(jié)合繼續(xù)釋放出對(duì)硝基苯酚離子。由于乙酰基-酶的水解很慢，使體系中酶濃度下降，進(jìn)而導(dǎo)致對(duì)硝基苯酚釋放速率變慢。2.酶活化中心必需基團(tuán)的測(cè)定(1)活性Ser基團(tuán)：二異丙基磷酰氯（DIPF）能特異性與Ser基團(tuán)的-OH反應(yīng)，其結(jié)果導(dǎo)致作為酶活性中心的Ser的殘基發(fā)生不可逆失活，此方法可有效確定胰凝乳蛋白酶中的Ser-195是酶活性中心必需氨基酸殘基。

DIPF作用于動(dòng)物上時(shí)，即可顯示出很高的神經(jīng)毒性，動(dòng)物體內(nèi)的乙酰膽堿酯酶（絲氨酸蛋白水解酶的一種）能夠與DIPF反應(yīng)，使其自身失活，失去對(duì)乙酰膽堿的水解作用。乙酰膽堿是一種生物體內(nèi)常見(jiàn)的神經(jīng)傳導(dǎo)物質(zhì)，自身具有很高的毒性，而負(fù)責(zé)水解完成傳遞信息任務(wù)后的乙酰膽堿的乙酰膽堿酯酶（乙酰膽堿酯酶可將乙酰膽堿分解成無(wú)毒性的乙酸和膽堿）失活之后就會(huì)導(dǎo)致乙酰膽堿在生物體內(nèi)不斷地積累，最終導(dǎo)致生物中毒死亡。(3)絲氨酸蛋白水解酶的空間結(jié)構(gòu)：X射線衍射法：通常，都是將表達(dá)蛋白的基因PCR之后克隆到一種表達(dá)載體中，然后在大腸桿菌中誘導(dǎo)表達(dá)，提純之后摸索結(jié)晶條件。結(jié)晶后，將晶體進(jìn)行x射線衍射，收集衍射圖譜，通過(guò)一系列的計(jì)算，很快就能得到蛋白質(zhì)的原子結(jié)構(gòu)。牛的胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶以及住的彈性蛋白酶在結(jié)構(gòu)上很相似，這三種酶大約由240個(gè)氨基酸殘基組成，三者的一級(jí)結(jié)構(gòu)大約有40%是相同的，且活性中心的必需氨基酸也大致相同（Ser、His、Asp）3.催化作用機(jī)制（1）結(jié)構(gòu)特性

以胰凝乳蛋白酶舉例，其活性中心有三個(gè)必需氨基酸殘基：Ser-195，His-57和Asp-102，這三部分通過(guò)氫鍵結(jié)合，整體呈三角形，即所謂的“催化三元區(qū)”。“催化三元區(qū)”的最顯著特征是Ser-195的羥基高度極化，具有很高的親核進(jìn)攻能力。（2）親核共價(jià)催化作用——易形成四聯(lián)體結(jié)構(gòu)的中間物Step1：Ser-195作用于底物的肽鍵酰基，發(fā)起親核進(jìn)攻，形成一個(gè)包括Ser-195的羥基、底物?；桶被?/p>