蔗糖酶分離純化產(chǎn)物的SDS－PAGE檢測(cè)分析及蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量測(cè)定實(shí)驗(yàn)五一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮鸵?、學(xué)習(xí)SDS－聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE)的基本原理和操作方法2、蔗糖酶分離純化產(chǎn)物的SDS－PAGE檢測(cè)分析3、學(xué)習(xí)測(cè)定蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量(Mr)的方法二、實(shí)驗(yàn)基本原理1、電泳是帶電顆粒在電場(chǎng)作用下，作定向運(yùn)動(dòng)即向著與其電荷相反的電極移動(dòng)的現(xiàn)象。2、電泳法分離、檢測(cè)蛋白質(zhì)混合樣品，主要是根據(jù)各蛋白質(zhì)組分的分子大小和形狀以及所帶凈電荷多少等因素所產(chǎn)生的電泳遷移率的差別。3、區(qū)帶電泳：是樣品物質(zhì)在一惰性支持物上進(jìn)行電泳,因電泳后，樣品不同組分形成帶狀區(qū)間，故稱區(qū)帶電泳。4、聚丙烯酰胺凝膠（polyacrylamidegel,簡(jiǎn)稱PAG)是由丙烯酰胺（Acr)和交聯(lián)試劑N,N’-甲叉雙丙烯酰胺(Bis)在有引發(fā)劑（如過(guò)硫酸銨或核黃素）和增速劑（如N,N,N’,N’-四甲基乙二胺，TEMED）的情況下聚合而成的。丙烯酰胺N,N’-甲叉雙丙烯酰胺

5、聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)是在恒定的、非解離的緩沖系統(tǒng)中來(lái)分離蛋白質(zhì)，這主要是由蛋白質(zhì)樣品所帶的電荷和分子質(zhì)量的差異性進(jìn)行分離；在電泳過(guò)程中仍保持蛋白質(zhì)的天然構(gòu)象、亞基之間的相互作用及其生物活性。6、聚丙烯酰胺凝膠電泳可分為：⑴連續(xù)系統(tǒng)凝膠緩沖液的pH值及凝膠濃度不變。該電泳系統(tǒng)具有電荷效應(yīng)、分子篩效應(yīng)；⑵不連續(xù)系統(tǒng)凝膠緩沖離子成分、pH值、凝膠濃度、電位梯度不連續(xù)，由濃縮膠和分離膠組成。由于濃縮膠的堆積（濃縮）作用，可使樣品（即使是稀釋樣品）在濃縮膠和分離膠的界面上先濃縮成一窄帶，然后在一定濃度（或一定濃度梯度）的凝膠上進(jìn)行分離。該電泳系統(tǒng)具有濃縮效應(yīng)、電荷效應(yīng)、分子篩效應(yīng)。

7、SDS－聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS)以PAG為支持物的電泳，由于各種蛋白質(zhì)所帶靜電荷、分子量大小和形狀不同而有不同的遷移率。為消除靜電荷對(duì)遷移率的影響，在整個(gè)電泳體系中加入一定量的陰離子去污劑“十二烷基硫酸鈉（簡(jiǎn)稱SDS）”和“強(qiáng)還原劑（巰基乙醇）”后，蛋白質(zhì)樣品就會(huì)與SDS結(jié)合形成帶負(fù)電荷復(fù)合物，而SDS作為一種變性劑和助溶劑，它能破壞蛋白質(zhì)分子內(nèi)和分子間的非共價(jià)鍵，并結(jié)合到蛋白質(zhì)分子上，使分子去折疊，破壞蛋白質(zhì)分子內(nèi)的二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)，使蛋白質(zhì)變性而改變?cè)械目臻g構(gòu)象。另外，SDS－蛋白質(zhì)復(fù)合物在強(qiáng)還原劑（巰基乙醇）存在下，可打開蛋白質(zhì)分子內(nèi)或肽鏈間的二硫鍵，并能避免重新氧化，這樣分離出的譜帶即為蛋白質(zhì)亞基。蛋白質(zhì)亞基的電泳的遷移率主要取決于亞基的相對(duì)分子質(zhì)量大小，而電荷的因素可以忽略。

8、蛋白質(zhì)亞基相對(duì)分子質(zhì)量的測(cè)方法在聚丙烯酰胺凝膠系統(tǒng)中，加入一定量的SDS時(shí)，蛋白質(zhì)－SDS復(fù)合物在水溶液中的形狀，近似于雪茄煙形的長(zhǎng)橢圓棒。不同蛋白質(zhì)的SDS復(fù)合物的短軸長(zhǎng)度都一樣，約為1.8nm，而長(zhǎng)軸則隨蛋白質(zhì)的分子量成正比變化。這樣的蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物在凝膠中的遷移率，不再受蛋白質(zhì)原有電荷和形狀的影響，而只主要取決于它的橢圓棒的長(zhǎng)度即蛋白質(zhì)的相對(duì)分子質(zhì)量的大小，而其他因素對(duì)電泳遷移率的影響幾乎可以忽略不計(jì)。由于蛋白質(zhì)的相對(duì)分子質(zhì)量不同，所形成復(fù)合物的相對(duì)分子質(zhì)量不同，在電泳中反映出不同的遷移率。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)或亞基的相對(duì)分子質(zhì)量在15,000～200,000之間時(shí)，電泳遷移率與相對(duì)分子質(zhì)量的對(duì)數(shù)呈直線關(guān)系，符合下列方程式：lgMr=K－bRf式中Mr代表相對(duì)分子質(zhì)量，K代表常數(shù)，b代表斜率，Rf代表遷移率。若將已知分子量的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)的遷移率對(duì)分子量的對(duì)數(shù)作圖，可獲得一條標(biāo)準(zhǔn)曲線。未知蛋白質(zhì)在相同條件下進(jìn)行電泳，根據(jù)它的電泳遷移率即可在標(biāo)準(zhǔn)曲線上求得蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量。(8)蛋白質(zhì)樣品溶解液（2×蛋白質(zhì)樣品溶解液）：內(nèi)含1%SDS，1%巰基乙醇，40%蔗糖或20%甘油，0.02%溴酚藍(lán)，0.01mol/LTris-HClpH8.0緩沖液。(9)染色液：0.25g考馬斯亮藍(lán)R-250，加90.8ml50%甲醇，加9.2ml乙酸，溶解混勻后使用。(10)脫色液：75ml乙酸，50ml甲醇，加蒸餾水875ml，混勻使用。(11)蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)溶液：①β-半乳糖苷酶（MW116,000），②牛血清白蛋白(MW66,200)，③卵清蛋白（MW45,000），④乳酸脫氫酶（MW35,000），⑤限制性內(nèi)切酶Bsp981（MW25，000），⑥β-乳球蛋白（MW18,400）,⑦雞蛋清溶菌酶（MW14,400）。四、實(shí)驗(yàn)器材1、電泳儀、垂直電泳槽及配件（長(zhǎng)短玻璃板各1塊、封膠條2條、梳子1個(gè)）

；2、微量移液器：10μl、20μl、200μl、1000μl；3、燒杯、長(zhǎng)滴管；4、微量注射器50μl；5、恒溫水浴100℃；6、高速臺(tái)式離心機(jī)；7、離心管（1.5ml、0.5ml）及離心管架；8、￠15cm培養(yǎng)皿（染色、脫色用）；9、搖床（染色、脫色用）。五、操作步驟1、準(zhǔn)備電泳裝置：電泳槽、電泳儀。2、配膠及凝膠的制備（1）配制凝膠：

不連續(xù)體系SDS－聚丙烯酰胺凝膠配制注：1、為去除抑制膠聚合的氧，加入AP前可進(jìn)行抽氣處理；2、過(guò)硫酸銨和TEMED的量應(yīng)根據(jù)室溫或聚合情況而定；12%分離膠所需試劑量(ml)5%濃縮膠所需試劑量(ml)30.8%凝膠貯液30.853mol/LTris-HCLpH8.9分離膠緩沖液0.950.5mol/LTris-HCLpH6.7濃縮膠緩沖液0.6310%SDS0.0750.05TEMED0.0050.005蒸餾水3.423.4510%Ap0.050.025總體積(ml)7.553、樣品處理與加樣⑴樣品制備取蔗糖酶樣品（樣品Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ）各50ul（樣品濃度約2～5mg/ml)

，分別放入1.5ml離心管中，10000r/min離心3min,收集上清為樣品溶液。⑵樣品處理將樣品溶液分別按等體積加入“2×蛋白質(zhì)樣品溶解液”，100℃保溫3分鐘，取出冷卻后，10000r/min離心1min,取上清直接加樣。⑶加樣用微量注射器向樣品槽內(nèi)注入10～20μl樣品混合液(每孔蛋白質(zhì)上樣量在20～40μg）

。如樣品濃度較低，可適當(dāng)增加上樣量。

蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)溶液加10μl/孔。

4、電泳在電泳槽中加入電泳緩沖液，上槽（加樣孔端）接負(fù)極、下槽接正極，接電泳儀電源，電流控制在2～3mA/樣品孔，一般樣品進(jìn)濃縮膠前，電流控制在10～20mA，待樣品進(jìn)分離膠后，將電流調(diào)到20～30mA，保持電流強(qiáng)度不變（恒流），待指示染料遷移至下沿約0.5～1cm處停止電泳。5、剝膠、固定和染色電泳結(jié)束后，取下凝膠模，用專用鏟子撬開短玻璃板，將凝膠一角切下做一加樣標(biāo)記，將凝膠板放在￠15cm培養(yǎng)皿內(nèi)，加入染色液，固定、染色30min左右，6、脫色棄去染色液，加入蒸餾水漂洗數(shù)次，再用脫色液脫色，直至蛋白質(zhì)區(qū)帶清晰為止。六、實(shí)驗(yàn)結(jié)果1、計(jì)算蛋白質(zhì)樣品相對(duì)分子質(zhì)量將￠15cm培養(yǎng)皿放在一張坐標(biāo)紙上，量出加樣端距溴酚藍(lán)區(qū)帶中心間的距離（cm）以及各蛋白質(zhì)樣品區(qū)帶中心與加樣端(凝膠頂端)的距離（cm），按下式計(jì)算相對(duì)遷移率Rf蛋白樣品距加樣端距離(cm)相對(duì)遷移率Rf＝溴酚藍(lán)區(qū)帶中心距加樣端距離(cm)列出電泳后各種蛋白質(zhì)的遷移率和分子量。以標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)的相對(duì)遷移率為橫坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)分子質(zhì)量lgM為縱坐標(biāo)在半對(duì)數(shù)坐標(biāo)紙上作圖，可得到一條標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)蛋白質(zhì)樣品的相對(duì)遷移率可直接在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出其相對(duì)分子質(zhì)量。蛋白質(zhì)樣品相對(duì)分子質(zhì)量（Mr)＝

3、作標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)相對(duì)分子量的對(duì)數(shù)與電泳相對(duì)遷移