致病菌的生態(tài)研究

在致病菌篩選中的應(yīng)用

國家副食品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心2008.10.26。北京微生物檢驗(yàn)用培養(yǎng)基歷史最初從水中大腸菌群開始（19世紀(jì)后半葉)，食品微生物（包括飲用水）檢驗(yàn)歷史有100多年。后來逐漸研究出許多培養(yǎng)基。使用的抑制劑有膽鹽類、染料類（如煌綠、結(jié)晶紫、品紅、美蘭等等)、無機(jī)鹽類（如氯化鈉、疊氮化鈉、氯化鋰、亞硒酸鹽、亞硫酸鹽類等)、甘氨酸等氨基酸類、醋酸鈉等有機(jī)酸類等等。后來，使用抗生素越來越多，選擇性逐漸提高，但使用起來不太方便。初期由于培養(yǎng)基都是國外研究出的，因此我們不易看到原始資料和基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。而我國自己研究出的檢驗(yàn)用培養(yǎng)基數(shù)量有限。當(dāng)前情況系統(tǒng)研究少，沒有形成真正意義上的系統(tǒng)的檢驗(yàn)理論體系。造成大學(xué)里目前沒有合適教材講解食品衛(wèi)生微生物檢驗(yàn)學(xué)的傳統(tǒng)方法部分。（推薦有關(guān)書籍）當(dāng)然由于目前技術(shù)水平的限制，現(xiàn)代檢測部分也不夠完善，大學(xué)教材與實(shí)際工作結(jié)合的不是很理想。傳統(tǒng)檢驗(yàn)方法目前存在的問題：選擇系統(tǒng)不夠精確。如腸桿菌科某一屬的精確篩選達(dá)不到。顯色培養(yǎng)基是目前選擇性培養(yǎng)基發(fā)展的主要方向。達(dá)到快速檢驗(yàn)的目的。微生物生長有關(guān)的生態(tài)因子溫度營養(yǎng)成分水分活度氧氣及其他氣體酸堿度滲透壓氧化還原電位抑菌物質(zhì)其他生命體其他溫度按照不同細(xì)菌的生長溫度范圍食品中的細(xì)菌可分為嗜冷細(xì)菌、冷營細(xì)菌、嗜中溫細(xì)菌、嗜熱細(xì)菌。在空腸彎曲菌檢驗(yàn)中使用42℃培養(yǎng)，可抑制其他不耐熱的彎曲菌和部分弓形桿菌。鮮肉在不同溫度放置以后，普通變形桿菌、奇異變形桿菌、摩根氏菌摩根菌和堿化普羅威登氏菌均出現(xiàn)生長。如果放置10℃以下主要出現(xiàn)堿化普羅威登氏菌。

豬肉保存過程中菌相的變化（佐藤善博金子精一1986）菌落數(shù)30℃培養(yǎng)4日35℃培養(yǎng)2日保存時(shí)間02日3日5日7日02日3日5日7日假單胞菌1932383433117641不動(dòng)桿菌3200022000莫拉氏菌0010010000黃桿菌3000061000弧菌1100021210氣單胞菌000002171070腸桿菌科201121010202839微球菌4100011100鏈球菌0001000000乳桿菌0003300000棒桿菌3201031000微桿菌0000200000芽孢桿菌1100000100酵母4100020000合計(jì)(菌落數(shù)）40404040404040404040注：菌落數(shù)為4個(gè)豬肉保存樣的平均值。細(xì)菌鑒定時(shí)從平板中挑出任意10個(gè)菌落（4個(gè)樣共40個(gè)菌落）進(jìn)行純培養(yǎng)后進(jìn)行鑒定。營養(yǎng)成分水碳源氮源硫源磷源礦物質(zhì)生長因子有的致病菌生長需要特殊的營養(yǎng)。因此要滿足其特殊的營養(yǎng)要求。如大多數(shù)金黃色葡萄球菌為脯氨酸缺陷型。使用酸水解的蛋白胨，可能分離不到樣品中存在的金黃色葡萄球菌。受傷菌特殊營養(yǎng)要求受傷菌的恢復(fù)生長，常常需要豐富的營養(yǎng)，但在培養(yǎng)饑餓狀態(tài)的受傷細(xì)菌，如水中的和海水中的受傷菌時(shí)低營養(yǎng)反而有利。檢驗(yàn)用稀釋液一般使用蛋白胨水，并添加觸酶、鎂離子、丙酮酸、鐵離子等。稀釋液的成分有時(shí)是很關(guān)鍵的。0.1%的蛋白胨水對冷凍受傷的大腸桿菌活菌回復(fù)率高。有的細(xì)菌生長需要脂肪酸。油酸以吐溫80的形式加入。志賀氏菌增菌液中使用吐溫80利于受傷菌的修復(fù)。小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌培養(yǎng)中添加吐溫80刺激其生長。

營養(yǎng)成分的比例有選擇性明串珠菌。腌制朝鮮泡菜時(shí)，如果蔗糖添加過量，就容易長明串珠菌。蛋白質(zhì)含量高時(shí)容易生長變形桿菌族等蛋白分解力強(qiáng)的細(xì)菌。氧氣等氣體根據(jù)生長需氧，把細(xì)菌分成專性好氧菌、厭氧菌、兼性厭氧菌、微需氧菌和耐氧菌。個(gè)別細(xì)菌(如布魯氏菌)生長需要提供5-10%的CO2，否則不生長。5%的CO2促進(jìn)乳桿菌屬的生長。1%或更低濃度的CO2刺激需氧菌對O2的吸收利用，但大多數(shù)細(xì)菌生長被高濃度CO2(5-50%)抑制，甚至被殺滅。高濃度CO2不抑制沙門氏菌和產(chǎn)氣莢膜梭菌，但抑制金黃色葡萄球菌。假單胞菌對二氧化碳最敏感，乳酸菌和梭菌不敏感。變形桿菌耐CO2，而芽孢桿菌、腸桿菌、黃桿菌、微球菌不耐CO2。酸堿度嗜酸醋桿菌2.8---4.3枯草桿菌4.5---8.5糞產(chǎn)堿菌6.4---9.7嗜熱脂肪芽孢桿菌5.2---9.2大腸桿菌4.4---9.0肉毒梭狀芽孢桿菌4.7---8.5肺炎克雷伯氏菌4.4---9.0生孢梭菌5.0---9.0普通變形桿菌4.4---9.2雙歧雙歧桿菌3.8---7.2粘質(zhì)沙雷氏菌4.0---9.0堿性胨水為增菌液分離副溶血性弧菌銅綠假單胞菌5.6---8.0微球菌5.6---8.1副傷寒沙門氏菌4.5---7.8金黃色葡萄球菌4.0---9.8傷寒沙門氏菌4.0-4.5---8.0-9.6乳酸鏈球菌4.3-4.8---9.2副溶血性弧菌4.8---11釀膿鏈球菌6.35---9.2蠟樣芽孢桿菌4.9---9.3屎腸球菌4.4-4.7---9.2乳桿菌3.8-4.4---7.2應(yīng)用舉例堿性胨水為增菌液分離副溶血性弧菌。MM增菌液就是利用酸性條件篩選沙門氏菌。小腸耶爾森氏菌通過胃時(shí)能耐胃酸是靠分解尿素來實(shí)現(xiàn)的。小腸耶爾森氏菌在短時(shí)間內(nèi)比其他腸道桿菌更耐堿。在該菌的分離中使用堿殺死增菌液中雜菌。在樣品中假單胞菌多時(shí)，堿殺菌效果明顯。另外，革蘭氏陰性桿菌比革蘭氏陽性桿菌對堿更敏感。相容性與不相容性相容性溶質(zhì)（compatablesolute）:為達(dá)到滲透壓平衡，細(xì)胞不斷積累非離子的或高水活性的即時(shí)在很高濃度下也不影響其代謝的物質(zhì)。所謂不相容性是指某些分子或離子在細(xì)胞內(nèi)的積累會影響細(xì)胞及其組分特別是生物大分子的正常結(jié)構(gòu)和功能。原因是各種中性鹽對蛋白質(zhì)和膠體的結(jié)構(gòu)和溶解度不同，不同的陰、陽離子會引起生物大分子不同級別的構(gòu)象變化。體外試驗(yàn)表明鈉離子嚴(yán)重抑制大腸桿菌、枯草桿菌和金黃色葡萄球菌的醛醇酶、異檸檬酸脫氫酶和磷酸己糖異構(gòu)酶。OsmolyteOsmolyte：為達(dá)到并平衡細(xì)胞內(nèi)外的滲透壓而積累于細(xì)胞內(nèi)的有機(jī)或無機(jī)溶質(zhì)。兩個(gè)來源：外源的和自身合成的。不同細(xì)菌具有不同的抗高滲的機(jī)制。一般是在細(xì)胞內(nèi)積累合適的溶質(zhì)，如鉀離子、谷氨酸、谷氨酰胺、脯氨酸、丙氨酸、γ-氨基丁酸、甜菜堿、蔗糖、海藻糖、葡萄糖、甘油、1,4,5,6-四氫-2-甲基-4-嘧啶羧酸(Ectoine，“四氫嘧啶”)等。其中甜菜堿、脯氨酸、Ectoine和海藻糖被認(rèn)為最重要。細(xì)菌在不同滲透壓下使用不同的Osmolyte。幾種重要的Osmolyte沙門氏菌選擇性增菌液的選擇作用（M.A.Morinigo等1993）培養(yǎng)基及培養(yǎng)溫度TB/43℃SC/36℃RV/43℃菌名24h48h24h48h48h白色念珠菌CECT1349-----巨大芽孢桿菌CECT44-----藤黃微球菌CECT244-----金黃色葡萄球菌CECT232-----弗隆迪檸檬酸桿菌CECT401-++++-產(chǎn)氣腸桿菌CECT400--++-大腸桿菌CECT102-----肺炎克雷伯氏菌CECT143--+++++-奇異變形桿菌CECT170+++++++++綠膿桿菌CECT108--++-粘質(zhì)沙雷氏菌CECT137--++-沙門氏菌UM100--++++++腸炎沙門氏菌UM497-++++++++副傷寒沙門氏菌CECT504-++++++++傷寒沙門氏菌CECT409---+-鼠傷寒沙門氏菌CECT159-+-+++注：+++最適生長++中等生長+低生長-不生長TB:四硫磺酸鹽培養(yǎng)基SC:亞硒酸鹽胱氨酸培養(yǎng)基RV:氯化鎂孔雀綠培養(yǎng)基（以海水和淡水樣品測試）氧化還原電位食品中的微生物區(qū)系處于一個(gè)動(dòng)態(tài)變化之中。有人總結(jié)了肉等蛋白質(zhì)含量高的食品中的細(xì)菌變化規(guī)律：水系桿菌（低溫細(xì)菌）→腸桿菌科細(xì)菌→乳酸菌→普通球菌→產(chǎn)芽孢菌。其中水系桿菌指有些假單胞菌、產(chǎn)堿菌、黃桿菌等。這一變化的部分原因在于氧化還原電位的變化。在培養(yǎng)基中加入還原劑硫酸亞鐵0.25mg/ml、次亞硫酸鈉(Sodiummetabisulfite)0.25mg/ml和丙酮酸鈉0.25mg/ml時(shí)，不需要微需氧特殊氣體環(huán)境。因?yàn)榇藭r(shí)氧氣已經(jīng)不能傷害空腸彎曲菌。抑菌物質(zhì)自然界中的抑菌物質(zhì)。氨基酸類。常用的有甘氨酸，需要較高濃度。其他有抗菌作用的氨基酸有丙氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、胱氨酸、精氨酸等。因經(jīng)濟(jì)原因只使用甘氨酸。當(dāng)然不同氨基酸對細(xì)菌的選擇性也不同。有機(jī)酸類。如檸檬酸：低濃度下抑制革蘭氏陽性球菌類（0.1%抑制微球菌屬和葡萄球菌屬），高濃度下抑制革蘭氏陰性桿菌（0.5%以上抑制腸桿菌科細(xì)菌和芽孢桿菌及霉菌、酵母，0.5%的濃度用于篩選乳酸菌）。pH6.0以下時(shí)有抑菌效果。脂肪酸類。如壬二酸抑制丙酸桿菌和葡萄球菌，還抑制部分真菌。膽鹽類各種抗生素及其他許許多多尚不知道的物質(zhì)。微生物檢驗(yàn)中常用的抑菌物質(zhì)可分為以下幾類：無機(jī)鹽類、氨基酸類、有機(jī)醇類、有機(jī)酸及其衍生物、表面活性劑類、染料類、抗生素類、二氧化碳等。二氧化碳。在沙門氏菌檢驗(yàn)中使用TTB增菌液，其中有碳酸鈣。除起緩沖作用外，還提供二氧化碳，具有選擇作用。其他生命體抑制生長乳酸鏈球菌產(chǎn)生尼生素，抑制革蘭氏陰性菌的生長?？莶輻U菌產(chǎn)生桿菌肽，能抑制許多革蘭氏陽性菌和部分革蘭氏陰性菌。多粘芽孢桿菌產(chǎn)生多粘菌素，能殺死大部分革蘭氏陰性菌的生長。粘質(zhì)沙雷氏菌產(chǎn)生靈紅菌素抑制大腸桿菌、產(chǎn)氣腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、綠膿桿菌等。短桿菌屬產(chǎn)生脂肪酸抑制肉毒桿菌；乳桿菌屬產(chǎn)生過氧化氫，抑制假單胞菌屬、芽孢桿菌屬和變形桿菌屬的一些種。腸道中的某些厭氧菌產(chǎn)生脂肪酸抑制沙門氏菌在局部生存。研究方法由此可見致病菌的生態(tài)學(xué)研究在致病菌選擇中的重要性。研究方法模擬自然環(huán)境，尋找環(huán)境中關(guān)鍵生態(tài)因子與所出現(xiàn)的致病菌的對應(yīng)關(guān)系。如膽鹽的利用與腸道細(xì)菌的篩選。利用不同生態(tài)因子，改變同一生態(tài)因子的不同參數(shù)或不同化學(xué)成分進(jìn)行試驗(yàn)，找出最適合目的菌生長的參數(shù)和化學(xué)物質(zhì)。不同生態(tài)環(huán)境中生長著與其生態(tài)環(huán)境相對應(yīng)的不同生命體。土壤中生長大量蠟樣芽胞桿菌。食物保存時(shí)間過長時(shí)容易生長乳酸菌等。溫血?jiǎng)游锬c道中生長著腸桿菌科細(xì)菌和許多種厭氧菌。在動(dòng)物腸道，食物、由膽汁等各種消化液成分、不同比例的氮?dú)?、氧氣、二氧化碳、氫氣、甲烷、腸道中的其他細(xì)菌等給不同腸道菌提供不同的生態(tài)條件，因此在不同的腸段生長不同的優(yōu)勢菌種。如空腸彎曲菌生活于空腸和回腸，不同的致瀉性大腸桿菌或結(jié)病灶于小腸（EPEC、ETEC、DAEC），或結(jié)病灶于結(jié)腸（EIEC、STEC）。利用一種細(xì)菌或某一類細(xì)菌在自然界中生長有其特殊的生態(tài)環(huán)境。如果我們提供完全適合特定目的菌生長的生態(tài)環(huán)境，就比較容易分離到目的菌。微生物檢驗(yàn)中使用的各種培養(yǎng)條件和培養(yǎng)基就是在提供特殊的生態(tài)環(huán)境。特殊生態(tài)條件的研究不同致病菌和不同細(xì)菌菌群的特殊生態(tài)沙門氏菌沙門氏菌與肉關(guān)系密切，其次為蛋和乳。馬在經(jīng)受刺激時(shí)（坐船、麻醉、驅(qū)蟲藥、外科手術(shù)、抗生素、強(qiáng)的松等）易感染沙門氏菌病。幼雞的嗉囊中未形成乳酸菌時(shí)易感染沙門氏菌病。沙門氏菌的感染似乎與肌肉中某種化學(xué)成分的出現(xiàn)有關(guān)?？梢梢蜃樱耗憠A、鎂離子、肌肽、血液成分等等。金黃色葡萄球菌葡萄球菌源于人和動(dòng)物，容易出現(xiàn)于含高淀粉的干燥的高營養(yǎng)食品，具有在低水分活度下生長的本領(lǐng)。普通細(xì)菌生長需要的最低水分活度為0.91，而金黃色葡萄球菌為0.86。金黃色葡萄球菌多為脯氨酸缺陷型。在含高濃度氯化鈉溶液中也需要通過細(xì)胞內(nèi)積累脯氨酸解高滲環(huán)境。埃希氏菌據(jù)調(diào)查，某抗生素廠排出的廢水中有大腸埃希氏菌、費(fèi)氏埃希氏菌、中間埃希氏菌、淡黃假單胞菌、卵狀假單胞菌、緩慢假單胞菌、莓實(shí)假單胞菌、糞產(chǎn)堿菌、放線菌、諾卡氏菌、蠟樣芽孢桿菌、遲緩芽孢桿菌、生枝動(dòng)膠菌、無色桿菌、節(jié)桿菌、黃桿菌等。分析菌相會發(fā)現(xiàn)埃希氏菌與需氧菌在一起生活。而其他腸桿菌科細(xì)菌很少出現(xiàn)，說明這些埃希氏菌屬細(xì)菌的生長有與其他腸桿菌科細(xì)菌不同的生態(tài)要求。在志賀氏菌增菌液中使用厭氧培養(yǎng)，此時(shí)志賀氏菌就能夠與大腸桿菌競爭。結(jié)論大腸桿菌有人對天然牛黃和?；铙w膽汁中的菌群進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)天然牛黃及產(chǎn)牛黃的?；铙w膽汁中都有細(xì)菌存在，而且都是大腸桿菌，但同一產(chǎn)牛黃的膽囊中有的存在數(shù)種血清型和不同生化特性的大腸桿菌。而正常牛膽汁中，56.8%的牛存在細(xì)菌，其中80.9%為大腸桿菌，還有其他細(xì)菌。說明產(chǎn)牛黃的膽汁對大腸桿菌有專一的選擇性。有研究結(jié)果表明，成黃膽汁與正常牛膽汁比較，膽紅素和鈣、鈉含量顯著增加，膽固醇含量也顯著增加。志賀氏菌志賀氏菌等通過人的手指傳播。流行病學(xué)調(diào)查顯示，在志賀氏菌流行季節(jié)可以從病人相關(guān)的門把手、椅子、床單、兒童玩具、衣服等地方分出志賀氏菌。汗液可能是糞便外的另一種致病菌傳播媒介物。證據(jù)之一是大腸桿菌O157：H7、霍亂、傷寒、副傷寒的流行似乎也與正常汗液成分的變化有關(guān)。小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌豬是小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌的主要攜帶者，多棲息于豬的咽喉?？赡芘c豬的喊叫造成細(xì)胞膜破裂有關(guān)。引起食物中毒的食品為含豬肉食品、巧克力、豆腐等，隨冷藏肉和沙拉的普及而流行。這樣看來，脂肪成分可能是小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌生長的關(guān)鍵。吐溫80刺激其生長，說明了脂肪酸對于小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌生長的重要性。李斯特菌李斯特菌在青貯飼料中容易出現(xiàn)，因此李斯特菌病也叫青貯飼料病。是由于青草發(fā)酵不正常造成的。另外在羊群中李斯特菌的攜帶率最高。上世紀(jì)80年代以來，在西方與李斯特菌有關(guān)的食物中毒越來越突出，可能與食品中經(jīng)常使用添加劑（如蛋白粉、甘氨酸等）有關(guān)系，因?yàn)檫@樣做改變了原來食品的微生物生態(tài)環(huán)境，李斯特菌可能利用甘氨酸、或肽類物質(zhì)適應(yīng)高滲環(huán)境成為優(yōu)勢菌。副溶血性弧菌目前有的沿海城市副溶血性弧菌食物中毒占細(xì)菌性食物中毒的第一位。副溶血性弧菌是生長于海水和海泥中的細(xì)菌。當(dāng)海水溫度大于20℃時(shí)爆發(fā)性增值，污染魚貝類。這種菌生長很快，每10分鐘分裂一次。魚貝類的副溶血性弧菌污染過程研究中“汽水域”越來越受到關(guān)注。所謂“汽水域”指河水進(jìn)入?？谔幒蜐q潮時(shí)海水倒入河水處。這種地方鹽分比海水少，鹽水濃度發(fā)生變化。這種菌在汽水域和鹽分低的泥土及海底泥土中過冬，到夏天海水溫度升高后爆發(fā)生長由汽水域擴(kuò)散到沿岸海水中?？漳c彎曲菌通過食物進(jìn)入人體的彎曲菌屬有四種：空腸彎曲菌、大腸彎曲菌、紅嘴鷗彎曲菌和烏普薩拉彎曲菌。由于在42℃培養(yǎng)時(shí)生長者多為空腸彎曲菌和大腸彎曲菌（也叫結(jié)腸彎曲菌），因此也叫耐熱彎曲菌。從其生活的生態(tài)來看與膽汁和腸液關(guān)系密切。除動(dòng)物膽汁中發(fā)現(xiàn)有彎曲菌外，沾有膽汁的肝臟中也發(fā)現(xiàn)有彎曲菌。雞直腸中約90%為陽性。鳥類的盲腸部分彎曲菌含量最高。在屠宰車間要求結(jié)扎膽管和腸管，以減少空腸彎曲菌的污染。利用致病菌特殊生態(tài)條件研究篩選致病菌的培養(yǎng)基

我們可以從致病菌感染的生態(tài)出發(fā)，研究致病菌最關(guān)鍵的生長條件，來找到分離致病菌的方法。對培養(yǎng)基研究可能有借鑒意義的腸道生態(tài)研究皮膚粘膜生態(tài)研究口腔生態(tài)研究病灶特殊生態(tài)研究皮膚生態(tài)皮膚的正常菌群為凝固酶陰性的葡萄球菌、微球菌、棒桿菌、短桿菌等，當(dāng)汗液成分發(fā)生變化時(shí)生長一些過路菌，如金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、綠膿桿菌、變形桿菌、糞產(chǎn)堿菌、不動(dòng)桿菌、丙酸桿菌等。不動(dòng)桿菌在汗液增加時(shí)明顯增多。汗液成分變化的研究可能對致病菌的篩選方法研究有幫助。通過接觸傳播的致病菌的營養(yǎng)要求可能與汗液成分有關(guān)。汗液及口腔生態(tài)不同人的汗液成分是不同的，而且同一個(gè)人在不同的時(shí)期隨食物和運(yùn)動(dòng)情況汗液成分也不一樣。汗液成分的變化以及其中鹽度隨水份蒸發(fā)造成的的變化可能是皮膚中細(xì)菌菌相復(fù)雜的關(guān)鍵原因。據(jù)研究汗液中有250多種細(xì)菌?？谇恢姓{(diào)查有600多種細(xì)菌，與腸道的菌群不一樣。重要的生態(tài)因子如唾液中的硫氰酸根離子，一氧化氮等。硫氰酸根離子對有些菌有殺菌作用，一氧化氮高時(shí)患牙周