ClinicalApplicationsofSerologicalDiagnosticsinTuberculosis

血清學檢測在結(jié)核病中的

診斷價值精選課件結(jié)核病的歷史

紀元前一萬年紀元前500年漢唐隋時代1650年命名結(jié)核1865年證實結(jié)核病具有傳染性1882年發(fā)現(xiàn)結(jié)核菌1921年卡介苗1944年1908年結(jié)核菌素皮試鏈霉素1952年異煙肼1966年利福平1971年短程化療1995年DOTS策略STOPTB策略2005年精選課件結(jié)核病的今天全球范圍內(nèi)結(jié)核病疫情急劇惡化結(jié)核病與艾滋病同時流行結(jié)核菌耐藥現(xiàn)象益發(fā)嚴重人口大規(guī)模流動我國是世界上僅低于印度的第二結(jié)核病大國結(jié)核菌感染率44.5%新發(fā)活動性結(jié)核患者130萬/年死亡13萬/年早期快速診斷與治療成為制約結(jié)核病控制的關鍵常規(guī)實驗室診斷結(jié)核病方法陽性率不到60%精選課件結(jié)核病的數(shù)字全世界約1/3的人口（近20億）攜帶結(jié)核菌。自1882年以來已經(jīng)有2億人死于結(jié)核病。每年有2000萬人患活動性結(jié)核病。每年約有300萬人死于結(jié)核病。結(jié)核病每15秒鐘就殺死1人。預計未來20年還將有3600萬人死于結(jié)核病。精選課件結(jié)核分枝桿菌結(jié)核分枝桿菌(M.tuberculosis)生物學主要特點：1.細胞壁中含有大量脂質(zhì)2.引起的疾病都呈慢性，并伴肉芽腫3.抗酸染色陽性精選課件實驗室檢查方法的歷史1880s Tuberclebacilli的發(fā)現(xiàn) Ziehl-Neelsen染色方法1900s Mantouxtest(TSTwithtuberculin)1920s Petragnanimedium PurifiedProteinDerivative（PPD）1930s Lewenstein-Jensen培養(yǎng)基1940s Dubosagar,Ogawa培養(yǎng)基1950s Middlebrook7H91990s 核酸擴增方法2000s ELISPOT,QuantiFERON20XX ?????精選課件當前結(jié)核研究的熱點新型抗結(jié)核藥物(50%)新型快速診斷技術(40%)新型結(jié)核疫苗(10%)精選課件結(jié)核病的實驗室診斷細菌學涂片：敏感性低傳統(tǒng)固體培養(yǎng)：所需時間長，2~3月分子生物學TB-DNATB-RNAHAIN技術XpertMTB/RIFDNA微陣芯片血清/免疫學IGRA：有望替代TST，但不能區(qū)分活動性TB與潛伏感染血清學：存在抗原純度和特異性差等方面的問題液體培養(yǎng)及藥敏試驗：平均時間20天精選課件血清學診斷技術血清學診斷技術優(yōu)勢：是一種對疾病進行早期診斷的理想方法。無需活細胞培養(yǎng)和特殊儀器設備操作簡便結(jié)果顯示快速目前用于血清學診斷的主要方法:酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELlSA)斑點金免疫滲濾法(DIGFA)免疫印跡法(WesternBlotting)等等精選課件脂阿拉伯甘露聚糖(LAM)抗原

脂阿拉伯甘露聚糖是分枝桿菌細胞壁的重要組成部分，是屬特異性抗原，具有較強的免疫原性和免疫調(diào)節(jié)功能，可刺激機體產(chǎn)生相應的抗體，因而是結(jié)核病的血清學診斷應用較廣的抗原。有關LAM抗原的應用報道很多,Antunes等用美國生產(chǎn)的結(jié)明(MycoDotTM)試劑盒檢測活動性肺結(jié)核病人的敏感性為63.0%，特異性為92.4%，認為檢測LAM抗體是結(jié)核病一項有效的輔助診斷方法。精選課件A60(antigen60)

A60是從牛分枝桿菌胞漿中提取的一種大分子物質(zhì)，是脂質(zhì)蛋白和多糖的復合抗原。Wu等用ELISA法檢測了178例活動性肺結(jié)核患者和151例其他疾病患者血清中的IgGA60，根據(jù)受試者工作特性曲線(ROC)取261.2單位為截切值(cutoffpoint)，其敏感性和特異性分別為49.4%和79.5%，認為胸部X片異常的患者結(jié)合IgGA60陽性將有助于肺結(jié)核病的準確臨床診斷。精選課件結(jié)核菌糖脂(TBGL)抗原

結(jié)核菌糖脂抗原是分枝桿菌細胞壁上的糖脂類物質(zhì)，具有菌屬特異性。近年來的研究表明，糖脂類抗原在診斷方面有很大的優(yōu)勢。Maekura等建立了糖脂類抗原抗體快速檢測方法，并做了臨床評價，對痰涂片陰性的活動性肺結(jié)核的靈敏度為56.8％，對痰培養(yǎng)陰性的活動性肺結(jié)核的靈敏度為51.2％。將TBGL與核酸擴增方法(NAA)聯(lián)合用于檢測，檢出率比兩者單獨使用時進一步提高。Tiwari等用脂質(zhì)體顆粒作為載體，利用純化的TBGL抗原特異的與結(jié)核病患者血清中的TBGL抗體結(jié)合，形成藍色凝集顆粒來診斷活動性結(jié)核病，其敏感性、特異性分別達94%和98.3%。該方法快速(4min)、經(jīng)濟，且可以區(qū)別活動性肺結(jié)核、卡介苗(BCG)免疫接種者與健康人群，可用于人群大規(guī)模篩選肺結(jié)核病人。精選課件38kDa蛋白

38kDa蛋白是一定位在質(zhì)膜上的磷酸鹽轉(zhuǎn)運蛋白，只在分枝桿菌復合體中表達，BCG合成38kDa蛋白的量僅為結(jié)核分枝桿菌的十分之一。

38kDa蛋白為一分泌蛋白，可刺激T細胞和B細胞免疫反應，廣泛應用于結(jié)核病的血清學試驗。英國公司生產(chǎn)的OMEGA結(jié)核抗體定量檢測MycoG、A、M試劑盒聯(lián)合應用38kDa和脂多糖(LPS)抗原，而TBComplexPlus試劑盒選用的是38kDa和16kDa抗原。Butt等對OMEGA試劑盒進行了評價，認為具有種特異性的TBComplexPlus和有屬特異性的MycoM聯(lián)合應用可取得最好的效果，檢測肺結(jié)核的敏感性和特異性分別為87%和93%。38kDa對活動性肺結(jié)核的診斷非常有效，但和大腸埃希菌同源蛋白有30%以上的交叉，所以對不同人群的靈敏度波動較大，尤其對涂片陰性和合并HIV感染的結(jié)核病患者效果較差。

精選課件Ag85抗原85復合體(Ag85)

是一組具有較強細胞免疫及體液免疫活性的分枝桿菌分泌性蛋白，分子量約為30～32kDa。分枝桿菌各菌株均可分泌Ag85。結(jié)核分枝桿菌Ag85中至少包括三種蛋白成分—Ag85A、Ag85B和Ag85C，其中有免疫作用的主要為Ag85A和Ag85B。Ag85具有分枝菌酸轉(zhuǎn)移酶的活性，在分枝桿菌細胞壁合成的最后階段發(fā)揮必要的作用。它還能和人纖連蛋白(FN)相結(jié)合，有助于結(jié)核菌入侵宿主細胞。Ag85可能發(fā)展成為結(jié)核病的血清學診斷抗原?；顒有越Y(jié)核病人血清中的Ag85抗體平均水平比其他分枝桿菌疾病患者和健康對照者高50～150倍，可通過檢測血循環(huán)中Ag85抗體，對活動性結(jié)核加以診斷。Kashyap等用間接ELISA法檢測89%疑似結(jié)核性腦膜炎患者腦脊液中存在Ag85抗體，認為檢測Ag85抗體為結(jié)核性腦膜炎的早期和確定性診斷提供了一個更靈敏的選擇。精選課件ESAT-6和CFP10

ESAT-6即6kDa早期分泌性抗原，是從結(jié)核分枝桿菌短期培養(yǎng)濾液中分離純化出的一種低分子量分泌性蛋白，具有較強的細胞免疫活性，在抗結(jié)核感染的免疫回憶應答中起重要作用。ESAT-6僅存在于致病性分枝桿菌中，包括人型結(jié)核桿菌、牛型結(jié)核桿菌、非洲分枝桿菌以及蘇爾加分枝桿菌、海水分枝桿菌和堪薩斯分枝桿菌等非典型分枝桿菌，而BCG及其他非致病性分枝桿菌缺失。CFP-10即培養(yǎng)濾液蛋白10，與ESAT-6位于同一基因簇上，兩者分布相同，都是RDl區(qū)編碼的。ESAT-6和CFP10能刺激機體產(chǎn)生特異性IgG，利用ESAT-6和CFP10蛋白抗原能與結(jié)核分枝桿菌感染者血中特異性IgG結(jié)合的特點，采用ELISA等方法可特異性區(qū)分是真正的結(jié)核分枝桿菌感染或是接種BCG后所致敏，該方法明顯優(yōu)于PPD作包被抗原的ELISA法。陳全等以CFP10-ESAT-6融合蛋白為抗原，用ELISA法檢測豚鼠血清中抗結(jié)核分枝桿菌抗體，11份H37Rv感染豚鼠血清全部呈陽性反應，11份BCG免疫豚鼠血清僅1份呈陽性反應。精選課件U1蛋白

Mukherjee等收集結(jié)核分枝桿菌H37Rv株靜脈感染C57BL/6小鼠早期(10～14d)尿液分離到一種結(jié)核抗原，氨基酸測序鑒定后，克隆并表達相應的基因，純化得到可溶的重組蛋白命名為U1蛋白(UrineProtein1)，分子量大約為16.8kDa。進一步用ELISA法檢測肺結(jié)核病人血清中U1抗體的敏感性為60%，檢測合并HIV感染的結(jié)核病患者其敏感性為87%，而正常人血清不與U1蛋白反應。將U1蛋白與Mtb81聯(lián)合用于檢測合并HIV感染的結(jié)核病患者的敏感性為93.6%。同時檢測了12名HIV感染的非結(jié)核病人，其中9名患者血清中無可檢測的U1抗體，另外3名U1抗體的水平處于ELISA法檢測的臨界點。因此認為，檢測U1抗體可增加結(jié)核病血清學診斷的敏感性，尤其對合并HIV感染的結(jié)核病患者。精選課件其它抗原

Weldingh等在大腸埃希菌中克隆表達了4種超抗原—TB9.7、TB15.3、TB16.3和TB51，并用它們來檢測痰涂片陽性和涂片陰性的結(jié)核病人，靈敏度為36%～93%，而特異性超過97%，其中TB16.3最為有效，TB16.3與TB9.7聯(lián)合檢測合并HIV感染的結(jié)核病患者其敏感性超過85%。Bahk等基因重組表達Rv3369和Rv3874兩個基因，并用它們做抗原檢測結(jié)核病患者的敏感性分別為60%、74%,特異性分別為96%、97%，表明是有價值的結(jié)核病血清學診斷抗原。其它抗原，如MPT64、P90、TB4等，也曾被做為快速血清學檢測的侯選抗原加以研究，但大都未達到診斷靈敏度的要求。精選課件摘自：陽幼榮等《結(jié)核分枝桿菌12種抗原在結(jié)核病血清學診斷中應用價值的研究》結(jié)核分枝桿菌12種抗原在結(jié)核病血清學診斷中應用價值的研究精選課件精選課件血清學診斷的關鍵是尋找靈敏度高、特異性強的理想抗原。但這方面的應用似乎并不理想。對于結(jié)核病的血清學診斷技術的研發(fā)，到現(xiàn)在已經(jīng)有100多年的歷史，但至今還沒有一種血清學診斷方法可以替代結(jié)核病痰涂片鏡檢。WHO對來自不同國家的19種試劑盒產(chǎn)品進行評估，結(jié)果表明：與痰培養(yǎng)相比，這些試劑盒檢測的靈敏度為1%~60%，特異度為53~99%1。原因：由于所用的測定方法、使用的試劑種類或抗原、抗體的不同等，導致測定結(jié)果差異較大，并且缺乏可比性。WHO認為現(xiàn)有的血清學診斷試劑的敏感度和特異度都有待進一步提高，不推薦其作為一種快速診斷的方法在臨床使用。1WHOWorldHealthOrganization.DiagnosisevaluationseriesNo.2:laboratory-basedevalutionof19commerciallyavailablerapiddiagnostictestsfortuberculosis.2008.血清學檢測精選課件結(jié)核抗體測定存在的問題1.假陽性：3%~15%。假陽性的發(fā)生原因：1)共同抗原所致的交叉反應；2)隱性結(jié)核菌感染包括初染、再染、非結(jié)核分支桿菌感染、卡介苗接種、結(jié)核桿菌L型感染等，結(jié)果均可致結(jié)核抗體短期或較長時期的升高；3)實驗操作/試劑質(zhì)量。

精選課件2.假陰性：30%~2%。假陰性發(fā)生的原因：1)機體方面所致的假陰性：如某些臨床確診的活動性結(jié)核患者，而體液免疫測定結(jié)果則為陰性，其原因可能與個體的免疫功能異常有關。上述原因均可導致機體不產(chǎn)生或僅產(chǎn)生少量特異性結(jié)核抗體，以致于無法與正常人群的結(jié)核抗體水平相區(qū)分。2)特異性免疫復合物的形成：由于活動性結(jié)核患者體內(nèi)產(chǎn)生的特異性抗體，可與結(jié)核抗原結(jié)合，形成免疫復合物，從而導致結(jié)核抗體測定為陰性。3)方法方面的因素所致的假陰性：如測定方法本身靈敏度不夠、儀器不夠靈敏和影響技術條件的各種因素均可導致假。4)試劑質(zhì)量和操作因素：試劑靈敏度偏低是造成假陰性的主要原因之一，操作人員的業(yè)務素質(zhì)也是影響因素之一。精選課件WHO不推薦血清學檢測方法診斷活動性結(jié)核病2011年WHO正式公告：由于目前的商業(yè)血清學試劑在結(jié)核檢測中存在較大差異，且檢測結(jié)果很高比例的假陽性和假陰性，因此不建議使用血清學方法作為結(jié)核桿菌的診斷實驗1。1WHOCommercialSerodiagnosticTestsforDiagnosisofTuberculosis./publications/2011/9789241502054_eng.pdf不能早期診斷！容易漏診、誤診！精選課件2012年4月16日，SFDA發(fā)布了《關于進一步加強結(jié)核病血液檢測試劑監(jiān)管有關事宜的通知》（食藥監(jiān)辦械【2012】48號），要求各省、自治區(qū)、直轄市食品藥品監(jiān)督管理局按照通知要求對行政區(qū)域內(nèi)有關結(jié)核病血液檢測試劑的注冊審評情況開展檢查，試圖通過對國內(nèi)生產(chǎn)結(jié)核病診斷血清學制品的企業(yè)進行一次背景調(diào)查。分析目前國內(nèi)核病血清學檢測試劑在生產(chǎn)過程質(zhì)量控制和在臨床評價中存在的問題及解決問題的方法。精選課件我國目前結(jié)核病血清學檢測試劑的情況1.我國結(jié)核病血清學檢測試劑現(xiàn)狀市場上銷售的結(jié)核病血清學診斷試劑有近百家，經(jīng)國家食品藥品監(jiān)督管理局批準的國產(chǎn)診斷制品抗體檢測試劑盒29個，其中經(jīng)國家級批準的26個，省級批準的1個，進口制品1個。抗原檢測試劑盒3個，其中省級批準的1個。大多數(shù)未經(jīng)批準的結(jié)核病血清學診斷試劑游離于國家監(jiān)管范圍之外，值得引起國家有關部門及人員的關注與重視。精選課件2.

結(jié)核病血清學診斷試劑生產(chǎn)企業(yè)背景調(diào)查情況調(diào)查資料的內(nèi)容主要包括試劑盒背景資料、試劑盒成品檢測、試劑盒檢測參考品制備與標化，參考品使用情況及臨床研究等方面；通過對各生產(chǎn)企業(yè)報送的資料進行分析，共收回調(diào)查問卷29份.我國目前結(jié)核病血清學診斷制品的品種與近3年的數(shù)量見下表.由于無法掌握未經(jīng)批準的結(jié)核病血清學診斷試劑的非法銷售情況，結(jié)果并不能代表國內(nèi)實際銷售狀況。精選課件存在的問題：1.陽性參考品的選擇多數(shù)企業(yè)在陽性參考品選擇時通常只選擇菌陽患者抗體強陽性血清，如果試劑某批次質(zhì)量出現(xiàn)問題，敏感度偏低時，若陽性參考品中全部使用強陽性血清，所有陽性參考品反應均呈陽性，則無法反映該試劑的真實敏感度。如標準品中有弱陽性血清的反應可能呈陰性，提示試劑敏感度可能存在問題。因此，血清學抗體檢測試劑在質(zhì)量控制中需要強、中、弱三種不同效價的血清用于敏感度的質(zhì)量控制。同理，在試劑制備過程出現(xiàn)問題，可能產(chǎn)生假陽性時。如果陰性參考血清都選擇本底極低的樣品，可能無法檢出，因此陰性參考品應含有臨界陰性參考血清。精選課件2.參考品的標化為獲得陽性與陰性不同效價的血清，獲得血清后應先進行初篩，再用不同的方法學對血清進行效價標定，確定血清的效價，從中選擇不同反應強度的樣本，作為陽性或陰性參考品。但多數(shù)企業(yè)未進行細致的效價標化，通常以試劑盒篩選后就作為檢測參考品。標準品的建立應有規(guī)范的操作細則，至少樣品采集、檢測與標化的過程中所有的實驗操作均需先制定SOP，再嚴格遵循SOP進行操作，并有對應的原始記錄。從已收到的資料來看，多數(shù)企業(yè)存在不足之處。精選課件3.參考品的制備結(jié)核病體外診斷試劑參考品通常由陽性參考品、陰性參考品、最低檢出量或最低檢出限參考品和精密性或重復性參考品組成，用來控制試劑盒的敏感度、特異度、檢出限和精密度等。但部分試劑廠家僅有陽性與陰性檢測參考品。由于參考品用于體外診斷試劑質(zhì)量控制，所以參考物質(zhì)原料的選擇取決于診斷試劑的預期用途。原料應與試劑盒的使用要求相一致或盡可能接近，這樣可以消除方法基體效應引入的系統(tǒng)誤差，陽性參考品應包括痰菌陰性和痰菌陽性患者的血清，但個別企業(yè)僅采用采血站篩選的抗體陽性血清作為陽性參考品。精選課件4.參考品的穩(wěn)定性參考物質(zhì)的均一性和穩(wěn)定性：均一性可保證一批原料所制備的參考品均勻一致，即在不同空間檢測結(jié)果的一致性和可比性；穩(wěn)定性可使一批參考品長期分發(fā)使用，為企業(yè)或科研院所提供用于質(zhì)量評價的參考品，保證在不同時間檢測結(jié)果的一致性和可比性。穩(wěn)定性考察一般需要觀察在不同溫度下放置不同時間，或經(jīng)過反復凍融后，觀察效價降低的情況。通過測定不同溫度，不同凍融次數(shù)時特征活性的降低速率，從而確定貯存的適宜溫度和時間，或反復凍融的次數(shù)。精選課件臨床檢驗中發(fā)現(xiàn)的問題：1.敏感度與特異度虛高WHO評估結(jié)果顯示，市售不同廠家的血液（血清學診斷）試劑的敏感度和特異度變化很大，敏感度變化范圍為0~100%，特異度變化范圍為31~100%。根據(jù)收集的各企業(yè)臨床資料顯示，我國血液診斷試劑的敏感度平均值為80%左右，高于70%的占79%；特異度平均值為92%，高于90%的占95%。2.臨床評價僅采用與同類制品進行比較評價的缺陷部分企業(yè)根據(jù)《體外診斷試劑臨床研究技術指導原則》，“已有同品種批準上市”品的臨床研究可采用已批準上市’質(zhì)量較好的產(chǎn)品作為對比試劑，進行對比試驗研究。3.臨床研究的規(guī)范性多數(shù)未規(guī)范進行臨床研究，不能隨機入選客觀評價，數(shù)據(jù)經(jīng)處理修改痕跡明顯，這是導致臨床研究的特異度與敏感度不真實的主要因素。精選課件32/45近期結(jié)核病診斷方法的相關研究JID2012:205(Suppl2),S147.精選課件結(jié)核感染者體內(nèi)存在特異的效應T淋巴細胞，效應T淋巴細胞再次受到結(jié)核抗原刺激時會分泌多種細胞因子（IFN-γ）。因此，檢測效應T淋巴細胞可用于結(jié)核病或結(jié)核潛伏感染者的診斷。由于效應T細胞存活時間很短，而且具有特異性，因此可以作為機體是否正處于被感染的指標，無論是否有臨床癥狀?；贗GRA原理的產(chǎn)品目前已被美國、加拿大、英國、德國、意大利、瑞士、法國、荷蘭、日本等二十余個國家寫入本國的結(jié)核診療指南中。目前應用的進口IGRA主要有兩種商品化的試劑：1）澳大利亞Cellestis公司的QuantiFERON-TBGOLDInTube（QFT-GIT）2）英國OxfordImmunotec公司的T-SPOT.TB蛋白水平分子診斷:γ-干擾素釋放實驗（IGRA)精選課件γ-干擾素釋放實驗（IGRA）γ

干擾素檢測陰性γ干擾素檢測陽性TB抗原多肽T細胞活化T細胞γ干擾素精選課件T-SPOT?.TB原理T-SPOT?.TB是以擁有專利的特異抗原（ESAT-6/CFP-10），通過酶聯(lián)免疫斑點技術（ELISPOT）檢測受試者體內(nèi)是否存在結(jié)核效應T淋巴細胞，從而判斷目前該受試者是否感染結(jié)核桿菌（現(xiàn)癥感染）的新方法。結(jié)核桿菌特異抗原：早期分泌抗原靶6（EarlySecretedAntigenicRarget6，ESAT-6）培養(yǎng)濾液蛋白10（CultureFiltrateProtein10，CFP10）精選課件結(jié)核桿菌特異抗原由結(jié)核桿菌基因組RD1區(qū)相同的操縱子編碼的蛋白所有的卡介苗（BCG）均丟失該基因序列絕大多數(shù)的環(huán)境分枝桿菌也不存在RD1區(qū)ESAT-6與CFP-10抗原精選課件結(jié)核桿菌特異抗原蘇氏?？八_斯戈登牛非洲精選課件酶聯(lián)免疫斑點技術結(jié)合了細胞培養(yǎng)技術與酶聯(lián)免疫吸附技術（即ELISA技術），能夠在單細胞水平檢測細胞因子的分泌情況，靈敏度高。精選課件準確—T-SPOT?.TB臨床性能指標特異性只針對結(jié)核分枝桿菌復合群敏感，與絕大多數(shù)環(huán)境分枝桿菌和卡介苗（BCG）無交叉反應

美國FDA數(shù)據(jù)：特異性97.1%(297/306)國內(nèi)臨床數(shù)據(jù)：特異性94.1%(478/508)靈敏度基本不受免疫力低下/受抑制影響，在肺外結(jié)核患者中有很高的檢出率美國FDA數(shù)據(jù)：靈敏度95.6%(175/183)國內(nèi)臨床數(shù)據(jù)：靈敏度95.3%(624/655)精選課件靈敏度精選課件特異性精選課件可信—T-SPOT?.TB國外指南T-SPOT?.TB是采用γ-干擾素釋放試驗（IGRA）原理，獲得美國FDA認證、歐盟CE認證和中國SFDA認證的唯一商業(yè)化產(chǎn)品列入美國、英國等歐美25個國家結(jié)核診療指南2011年英國NICE指南、2010年美國最新結(jié)核診療指南、2010年加拿大結(jié)核指南美國CDC推薦—卡介苗（BCG）接種人群結(jié)核感染檢測首選精選課件各國對潛伏感染風險人群的篩查指南精選課件快速—T-SPOT?.TB的實驗步驟用BDCPT管或Ficoll提取液收集外周血單個核細胞結(jié)核特異抗原（ESAT-6/CFP10）刺激結(jié)核特異的效應T淋巴細胞使其分泌γ-干擾素效應T淋巴細胞分泌的γ-干擾素與膜板預包被的抗γ-干擾素抗體結(jié)合并固定在細胞周圍1個斑點=1個效應T細胞加入顯色液