基因重組Chapter35DNA的重組Geneticrecombination4/10/20231

DNA重組的幾種類型及其主要特點(diǎn)

了解Holliday模型細(xì)菌基因轉(zhuǎn)移的幾種方式

轉(zhuǎn)座重組及其生物學(xué)意義4/10/20232DNA重組（基因重組、遺傳重組geneticrecombination

基因重排generearrangenment）

DNA分子內(nèi)或分子間遺傳信息的重新組合

DNA片段在細(xì)胞內(nèi)、細(xì)胞間，甚至在不同物種之間進(jìn)行交換，交換后的片段仍然具有復(fù)制和表達(dá)的功能意義：迅速增加群體遺傳多樣性、區(qū)分有利、不利突變、通過優(yōu)化組合積累有意義的遺傳信息參與許多重要的生物學(xué)過程（438頁）

自然界基因轉(zhuǎn)移、重組：基因變異、物種進(jìn)化的基礎(chǔ)繁殖、病毒感染、基因表達(dá)、癌基因激活等過程中起重要的作用4/10/20233二、同源重組兩條同源區(qū)的DNA分子，通過配對(duì)、鏈的斷裂和再連接產(chǎn)生片段交換（crossingover）的過程一般性重組（generalrecombination）兩個(gè)染色體或DNA分子相互交換對(duì)等部分的過程雙倍體真核生物：減數(shù)分裂，非姐妹染色單體交換相對(duì)應(yīng)的區(qū)域，產(chǎn)生的單倍體配子包含父母本兩方的遺傳信息4/10/202354/10/202364/10/202374/10/202394/10/2023104/10/2023113、功能：1）維持種群的遺傳多樣性2）有助于DNA的損傷修復(fù)3）真核生物減數(shù)分裂中染色體正確分離到子細(xì)胞4/10/202313(二)細(xì)菌的基因轉(zhuǎn)移與重組1、結(jié)合作用conjugation結(jié)合作用：質(zhì)粒DNA從一個(gè)細(xì)胞（細(xì)菌）轉(zhuǎn)移至另一個(gè)細(xì)胞

致育因子（F因子）通過結(jié)合作用由F+細(xì)胞向F-細(xì)胞轉(zhuǎn)移，F(xiàn)質(zhì)粒約1/3的基因與轉(zhuǎn)移有關(guān)，traS和traT基因編碼表面排斥蛋白，阻止F+細(xì)胞之間的轉(zhuǎn)移，F(xiàn)+細(xì)胞的性菌毛與F-細(xì)胞結(jié)合后收縮，使二者靠近，TraD蛋白構(gòu)成轉(zhuǎn)移的通道，在TraI在TraY的幫助下結(jié)合到轉(zhuǎn)移起點(diǎn)oriT上，切開一條鏈，使其5?端進(jìn)入受體細(xì)胞，并合成其互補(bǔ)鏈，使F-細(xì)胞轉(zhuǎn)化為F+細(xì)胞，給體細(xì)胞中的單鏈也可以合成互補(bǔ)鏈。4/10/202314當(dāng)細(xì)胞與細(xì)胞、或細(xì)菌通過菌毛相互接觸時(shí)，質(zhì)粒DNA從一個(gè)細(xì)胞（細(xì)菌）轉(zhuǎn)移至另一細(xì)胞（細(xì)菌）的DNA轉(zhuǎn)移稱為～4/10/2023154/10/202317

在細(xì)菌基因轉(zhuǎn)移的不同時(shí)間將配對(duì)細(xì)胞分開，可以確定基因在染色體上的位置。F質(zhì)粒DNA可以通過重組整合到受體的染色體中，使受體菌成為高頻重組（Hrf)菌株，若F質(zhì)粒的DNA未能完整地進(jìn)入受體菌，則受體菌不能轉(zhuǎn)化為F+,F質(zhì)粒的DNA可以被切割出來，有時(shí)可攜帶宿主菌的染色體DNA，稱作F?因子，F(xiàn)?因子攜帶的基因可在受體菌表達(dá)。4/10/202318大腸桿菌染色體的基因圖自然條件下感受態(tài)的形成需要10多種蛋白質(zhì)參與通過自動(dòng)獲取或人為地供給外源DNA，使細(xì)胞或培養(yǎng)的受體細(xì)胞獲得新的遺傳表型的過程——轉(zhuǎn)化2、轉(zhuǎn)化transformation實(shí)驗(yàn)室：高濃度的Ca2+處理使細(xì)菌形成感受態(tài)4/10/202319普遍性轉(zhuǎn)導(dǎo)：宿主菌任意部位的基因取代噬菌體DNA的一部分轉(zhuǎn)入受體菌3、轉(zhuǎn)導(dǎo)作用

transduction通過噬菌體將細(xì)菌基因從供體菌轉(zhuǎn)移到受體菌限制性轉(zhuǎn)導(dǎo)：宿主整合部位的DNA取代噬菌體的部分DNA進(jìn)入受體菌的基因與染色體重組4/10/202321噬菌體的基因重組4/10/202322當(dāng)病毒從被感染的細(xì)胞（供體）釋放出來，再次感染另一細(xì)胞（受體）時(shí)，發(fā)生在供體細(xì)胞與受體細(xì)胞之間的DNA轉(zhuǎn)移及基因重組4/10/2023234/10/2023254、細(xì)胞融合細(xì)胞質(zhì)膜融合導(dǎo)致基因轉(zhuǎn)移、重組實(shí)驗(yàn)室：溶菌酶除細(xì)菌細(xì)胞壁，人工促使原生質(zhì)體融合，引起廣泛的重組。4/10/202326依賴RecBCD起始的重組模型:RecBCD有依賴ATP的核酸外切酶、核酸內(nèi)切酶和解螺旋酶活性，當(dāng)DNA斷裂時(shí)，它結(jié)合在其游離端，使其解旋并降解，直至酶移動(dòng)到chi位點(diǎn)（GCTGGTGG)，在其3＇側(cè)4-6核苷酸處將鏈切斷，產(chǎn)生3＇游離單鏈，隨后單鏈與RecA結(jié)合，開始同源區(qū)重組。4/10/202329RecA蛋白的絲狀聚合體與DNA的相互作用RecA蛋白的帶狀圖解RecA蛋白的絲狀聚合體，每一圈螺旋由6個(gè)RecA蛋白單體構(gòu)成，其中一個(gè)單體由紅色標(biāo)出。4/10/202330RecA蛋白引起DNA同源重組的模型4/10/202331在大腸桿菌中由RuvA,RuvB和RuvC蛋白參與的同源重組。（a）RuvA四聚體的圖解。四個(gè)亞基形成的結(jié)構(gòu)像四個(gè)花瓣的花。（b）RuvA/RuvB的作用：（左）RuvA四聚體結(jié)合到Holliday位點(diǎn)；（中）RuvB六聚體結(jié)合到雜合雙螺旋的兩對(duì)面，DNA穿過其中心，RuvB六聚體的作用像馬達(dá)，促進(jìn)超螺旋分叉點(diǎn)通過復(fù)合體移動(dòng)。（右）RuvC結(jié)合到Holliday位點(diǎn)，由其核酸酶活性切斷核酸鏈，切割位點(diǎn)由剪切體辨認(rèn)。（c）RuvA四聚體的電荷分布，藍(lán)色表示正電荷，紅色表示負(fù)電荷，注意正電荷位于四聚體的表面，有四個(gè)負(fù)電荷區(qū)域位于其中心。（d）假設(shè)的RuvA四聚體與Holliday位點(diǎn)結(jié)合的結(jié)構(gòu)模型。4/10/202332三、特異位點(diǎn)重組原核生物中，有時(shí)基因重組依賴于小范圍的同源序列的聯(lián)會(huì)，重組只限于該小范圍內(nèi)，只涉及特定位點(diǎn)的同源區(qū)，這類重組稱作～由整合酶催化，在兩個(gè)DNA序列的特異位點(diǎn)間發(fā)生的整合4/10/2023331、λ噬菌體DNA的整合與切除噬菌體的整合酶識(shí)別噬菌體DNA和宿主染色體的特異靶位點(diǎn)，而后發(fā)生的選擇性整合4/10/202334

通過attP和attB間的相互重組，環(huán)狀的噬菌體DNA轉(zhuǎn)換為整合的原噬菌體，原噬菌體通過attL和attR間的相互重組而切除4/10/2023352、細(xì)菌的特異位點(diǎn)重組沙門氏菌兩種鞭毛蛋白表達(dá)的調(diào)控4/10/2023363、免疫球蛋白基因的重組IgG的分子結(jié)構(gòu)4/10/202337（1）（2）（3）（4）（5）4/10/202338重組位點(diǎn)有7和9nt的信號(hào)序列,中間間隔12或23bp。4/10/202339免疫球蛋白基因重組的模型重組酶（RAC1/RAC2)復(fù)合體與重組信號(hào)序列結(jié)合復(fù)合體使編碼序列與重組信號(hào)序列之間的雙連斷裂，編碼序列的末端形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)。重組信號(hào)序列結(jié)合形成環(huán)狀結(jié)構(gòu)。編碼序列連接前經(jīng)過加工，連接位點(diǎn)不十分確定，增加了免疫球蛋白的多樣性。DNA依賴性蛋白激酶(DNA-PK)和DNA連接酶參與了加工和連接過程。9堿基序列7堿基序列4/10/202340在不同的核苷酸位點(diǎn)重組可以生成不同的蛋白質(zhì)4/10/202341四、轉(zhuǎn)座重組（transposition）

McClintock的重要發(fā)現(xiàn)4/10/2023421950，麥克林托克，玉米籽粒顏色遺傳，存在著一種轉(zhuǎn)座因子（transposableelements）控制籽粒顏色，這些因子可在染色體上移動(dòng)，控制著某些基因表達(dá)70年代，夏皮羅（Shapiro），E.coli乳糖操縱子突變株，進(jìn)行雜交分析，確認(rèn)轉(zhuǎn)座子的存在。存在于染色體DNA上可自主復(fù)制和位移的基本單位稱為轉(zhuǎn)座子4/10/202343大多數(shù)基因在基因組內(nèi)的位置是固定的有些基因可以從一個(gè)位置移動(dòng)到另一位置可移動(dòng)的DNA序列包括插入序列和轉(zhuǎn)座子由插入序列和轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)的基因移位或重排稱為～4/10/202344轉(zhuǎn)座子移位：導(dǎo)致DNA鏈的斷裂/重接or某些基因啟動(dòng)/關(guān)閉。引起：a.插入突變；b.產(chǎn)生新的基因；c.染色體畸變；d.生物進(jìn)化，遺傳效應(yīng)。轉(zhuǎn)座子：原、真核細(xì)胞與同源染色體重組相比，轉(zhuǎn)座子作用頻率低得多，構(gòu)建突變體有重要意義4/10/202345插入序列轉(zhuǎn)座插入序列（insertionsequences，IS）：750～1500bp反向重復(fù)序列：9～41bp，位于兩側(cè)轉(zhuǎn)座酶編碼基因：產(chǎn)物引起轉(zhuǎn)座，位于中間正向重復(fù)序列：4～12bp，位于反向重復(fù)序列外側(cè)插入序列特有組成：4/10/202346保守性轉(zhuǎn)座：從原位遷至新位 復(fù)制性轉(zhuǎn)座：插入序列復(fù)制后，一個(gè)復(fù)制本遷到新位，另一個(gè)保留在原位方式4/10/2023474/10/2023484/10/202349轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)座轉(zhuǎn)座子（transposons）：可從一個(gè)染色體位點(diǎn)轉(zhuǎn)移到另一位點(diǎn)的分散重復(fù)序列組成反向重復(fù)序列轉(zhuǎn)座酶基因特殊基因：如抗生素抗性基因等4/10/202350轉(zhuǎn)座子具有反向末端重復(fù)序列以及在靶部位兩側(cè)產(chǎn)生的同向重復(fù)序列。在該例中靶序列為5bp，轉(zhuǎn)座子末端由9bp反向重復(fù)序列組成，數(shù)字1-9指序列重復(fù)堿基對(duì)。*兩側(cè)正向重復(fù)***末端反向重復(fù)**(一)細(xì)菌的轉(zhuǎn)座因子1.插入因子4/10/2023512.組合型轉(zhuǎn)座子：兩個(gè)插入序列之間夾著一段序列（如抗性基因）。兩個(gè)插入序列可以同向或反向排列，有時(shí)均有轉(zhuǎn)座活性，有時(shí)只有一個(gè)有轉(zhuǎn)座活性。3.復(fù)合型轉(zhuǎn)座子：插入序列被轉(zhuǎn)座酶基因取代，圖示為Tn3(TnA家族）的結(jié)構(gòu)。兩端為38bp的反向重復(fù)，其兩側(cè)為5bp的靶序列，tnpA編碼轉(zhuǎn)座酶，tnpR編碼的蛋白質(zhì)可以作為解離酶（使轉(zhuǎn)座子與受體DNA形成的共整合體重組和解離），也可以作為阻遏蛋白調(diào)節(jié)tnpA和tnpR兩個(gè)基因的表達(dá)，res為解離的控制位點(diǎn)，TnpR蛋白結(jié)合于其上發(fā)揮調(diào)控作用。4/10/2023524.轉(zhuǎn)座的方式轉(zhuǎn)座子可用不同的方式轉(zhuǎn)座，轉(zhuǎn)座因子插入基因后可使基因失活，也可引起染色體的斷裂、重復(fù)、缺失、倒位、易位等變化。兩個(gè)IS10組件構(gòu)成一個(gè)復(fù)合轉(zhuǎn)座子，它能使位于他們之間的任何DNA易位。當(dāng)Tn10是一個(gè)小的圓形分子的一部分時(shí)，IS10重復(fù)序列可轉(zhuǎn)座至環(huán)狀分子的任一側(cè)。4/10/202353插入序列使靶序列的數(shù)量增加，在插入序列兩側(cè)各有一個(gè)。4/10/202354

復(fù)制轉(zhuǎn)座作用產(chǎn)生了轉(zhuǎn)座子的一個(gè)拷貝，它插入到一個(gè)接受位點(diǎn)。給予位點(diǎn)保持不變，給予者和接受者都有轉(zhuǎn)座子的一個(gè)拷貝。4/10/202355

非復(fù)制轉(zhuǎn)座作用在未被修復(fù)的情況下，可能造成致死突變。4/10/202356

保守的轉(zhuǎn)座作用不造成核苷酸的丟失，如λ噬菌體的整合和切除。4/10/202357轉(zhuǎn)座子引起DNA的重排，正向重復(fù)序列的重組引起其間序列的切除或插入。4/10/202358反向重復(fù)序列的重組能引起其間序列反向排列。4/10/202359轉(zhuǎn)座作用可引起給體和受體的整合或分割，并可引起轉(zhuǎn)座子拷貝數(shù)的增加4/10/202360(二)真核生物的轉(zhuǎn)座因子

原核生物的轉(zhuǎn)座酶主要作用于產(chǎn)生它的轉(zhuǎn)座因子，表現(xiàn)出順式顯性。真核生物的轉(zhuǎn)座酶可以作用于任何末端具有該酶所識(shí)別的反向重復(fù)順序的DNA,使其轉(zhuǎn)移到相應(yīng)的靶位點(diǎn)。在玉米的激活-解離系統(tǒng)（activator-dissociationsystem,Ac-Ds)中，Ac編碼轉(zhuǎn)座酶(自主因子)，Ds（非自主因子）是Ac不同程度的缺失中間序列形成的，無轉(zhuǎn)座酶活性，但隨Ac轉(zhuǎn)座后可抑制鄰近基因的表達(dá)。在玉米的抑制-促進(jìn)-增變系統(tǒng)（suppressor-promotor-mutator,Smp)中,Smp和En（增強(qiáng)子）序列相似，均為自主因子，與其對(duì)應(yīng)的非自主因子dSmp為有缺陷的Smp因子，轉(zhuǎn)座后，若Smp插入靶基因附近的合適部位，可以促進(jìn)靶位點(diǎn)基因的表達(dá)，若Smp插入外顯子，可抑制基因的表達(dá)。4/10/2023614/10/202362玉米的控制元件形成轉(zhuǎn)座子的不同家族，每個(gè)家族均有自主和非自主成員。4/10/202363

P品系的果蠅含有40-50個(gè)P因子（一種轉(zhuǎn)座子），P因子的mRNA前體含有3個(gè)內(nèi)含子，若P品系雄性與M品系雌性交配，子一代的體細(xì)胞mRNA前體加工時(shí)保留了第3個(gè)內(nèi)含子，合成阻遏蛋白，不發(fā)生轉(zhuǎn)座，性細(xì)胞mRNA前體加工時(shí)切除了全部3個(gè)內(nèi)含子，活躍的轉(zhuǎn)座使性細(xì)胞失去功能。P雄性或M雄性與P雌性交配時(shí)，由于雌性的卵細(xì)胞質(zhì)中存在抑制P因子轉(zhuǎn)座酶活性的蛋白質(zhì)，子代的生殖功能正常。4/10/202364四、真核生物基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄前調(diào)控

1.染色體丟失:如四膜蟲的大核為營養(yǎng)核，由小核發(fā)育而來，約10%的DNA在發(fā)育過程中被丟失。

2.基因擴(kuò)增：如非洲爪蟾卵母細(xì)胞的rDNA可以大量擴(kuò)增，形成1000個(gè)以上的核仁。

3.基因重排:重排可以使表達(dá)的基因發(fā)生切換，也可以產(chǎn)生新的基因。

4.組蛋白的乙?；腿ヒ阴；航M蛋白的乙?；突虮磉_(dá)的狀態(tài)相關(guān)。組蛋白H4的乙?；蛔?underacetylation)是雌性哺乳動(dòng)物一條X染色體失活的原因之一。去乙?；突蚧钚缘淖瓒粲嘘P(guān)。

5.染色體DNA的修飾和異染色質(zhì)化：DNA的甲基化可以使其失去轉(zhuǎn)錄活性，高度甲基化的DNA可以形成高度壓縮的異染色質(zhì)，異染色質(zhì)的基因無轉(zhuǎn)錄活性。4/10/2023656.染色質(zhì)結(jié)構(gòu)改變模型-組蛋白置換

占先模型(pre-emptivemodel)：決定的因素是轉(zhuǎn)錄因子和組蛋白誰先占據(jù)調(diào)控位點(diǎn)。DNA復(fù)制時(shí)，組蛋白8聚體解離，轉(zhuǎn)錄因子乘機(jī)結(jié)合到調(diào)控位點(diǎn)上，一直持續(xù)到下一個(gè)復(fù)制周期，抑制了組蛋白和DNA的結(jié)合。

例1：當(dāng)5SrRNA基因與組蛋白結(jié)合時(shí)TFⅢA不能激活此基因。而TFⅢA可與游離的5SrRNA基因結(jié)合，再加入組蛋白不能使此基因失活。例2：含腺病毒啟動(dòng)子的質(zhì)粒能被TFⅡD結(jié)合，再被RNApolⅡ轉(zhuǎn)錄，如先加入組蛋白，則不起始轉(zhuǎn)錄，如先加入TFⅡD則形成的染色質(zhì)中，模板仍轉(zhuǎn)錄。

動(dòng)態(tài)模型(dynamicmodel)：組蛋白置換需輸入能量。一些轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合DNA時(shí)可裂解核小體，或建立一個(gè)可產(chǎn)生核小體定位結(jié)合位點(diǎn)的邊界。如果蠅Hsp70啟動(dòng)子上的核小體在體外實(shí)行重建。GAGA(細(xì)胞核結(jié)合蛋白)轉(zhuǎn)錄因子與啟動(dòng)子中4個(gè)富含(CT)n位點(diǎn)結(jié)合，破壞了核小體，形成一高敏感區(qū)，而且導(dǎo)致鄰接的核小體重排，這樣它們就優(yōu)先插入到隨機(jī)位點(diǎn)。核小體打開的過程是需要水解ATP的耗能過程。4/10/2023667.細(xì)胞周期的調(diào)控最關(guān)鍵的是兩個(gè)蛋白質(zhì)家族：周期素（cyclin)家族和依賴周期素的蛋白激酶（cyclin-dependingproteinkinase,CDK)家族,目前發(fā)現(xiàn)的周期素有10種以上，用字母A,B,C等表示，CDK有8種以上，用CDK1，CDK2，CDK3等表示。周期素AD,CDK2,CDK4的合成受轉(zhuǎn)錄因子E2F的調(diào)節(jié)，共同控制G1期向S期的轉(zhuǎn)化，周期素A、B與CDK2的結(jié)合對(duì)有絲分裂的啟動(dòng)是必要的。新合成的促細(xì)胞分裂周期素與CDK結(jié)合，形成促M(fèi)期因子(M-phasepromotingfactor,MPF)，活化的CDK使自身的Y15和T161先后被磷酸化，隨后細(xì)胞周期基因（cell-division-cyclegene