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文檔簡介

MTT實驗操作流程MTT實驗標準操作流程1.原理瓚(Formazan)并沉積在細胞中，而死細胞無此功能。二甲基亞砜(DMSO)能溶解形成的量與細胞數(shù)成正比。根據(jù)測得的吸光度值(即OD值)，來判斷活細胞數(shù)量，OD值越大，細胞活性越強(如果是測藥物毒性，則表示藥物毒性越小)。2.試劑及耗材3.注意事項，小劑量分裝，用避光袋或錫箔紙包住避光以免分解，當MTTDMSO準曲線制作la)每孔加入10μLMTT溶液(5mg/ml)，繼續(xù)細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)4-6h；b)小心吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液；c)每孔加入150μLDMSO，使結(jié)晶物充分溶解；d)加DMSO后10min內(nèi)，用酶標儀檢測各孔波長μl570nm的吸光值；細胞計數(shù)后調(diào)整其濃度至5-10×104/ml，藥物毒性實驗一般每孔細胞數(shù)量5000—10000個(具體數(shù)目根據(jù)預實驗判斷)。此外，還應(yīng)根據(jù)細胞本身特性，如生長快慢，來決定細胞數(shù)量。比如：生長較快l度為5000—10000/孔(邊緣孔用無菌PBS填充)。5%CO2，37C培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)，待細胞單層鋪滿孔底(96孔平底板),加入濃度梯度的藥物。(原則上，細胞貼壁后即可加藥，或兩h，或半天時間，但我們常在前一天下l釋好的藥物體積應(yīng)略按照藥物作用時間點，每24h取出一塊96孔板檢測：a)每孔加入10μLMTT溶液(5mg/ml)，繼續(xù)細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)4-6h；b)小心吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液；c)每孔加入150μLDMSO，置上低速振蕩10min，使結(jié)晶物充分溶解；d)加DMSO后10min內(nèi)，用酶標儀檢測各孔波長570nm的吸光值；同時設(shè)置調(diào)零孔(培養(yǎng)基、MTT、二甲基亞砜)，對照孔(細胞、相同濃度的藥物溶解分別收集各組對數(shù)期的細胞，調(diào)整細胞懸液濃度；取4塊96孔板，每孔加入100μL細胞懸液，鋪板使待測細胞為5×103cell/孔(邊緣孔用無菌PBS填充以消除邊緣效應(yīng))，每組設(shè)置3個復孔；5%CO2，37C培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)，每24h取出一塊96孔板檢測：a)每孔加入20μLMTT溶液(5mg/ml)，繼續(xù)細

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