新一代基因測序技術(shù)第1頁/共37頁

新一代基因測序技術(shù)(NextGenerationSequencingTechnologies)是一系列在2004年后問世的新的DNA測序技術(shù)。這些新技術(shù)使用不同以往的化學測序法，依靠高度并行的基因序列讀取方式，取得了令人難以置信的DNA測序高通量。新一代基因測序技術(shù)能在數(shù)天內(nèi)完成第一代基因測序技術(shù)花費1O年完成的人類基因組測序。第2頁/共37頁

自2004年問世起，不斷發(fā)展的新一代基因測序技術(shù)（NGS）在生物醫(yī)學領(lǐng)域引發(fā)了許多突破性的發(fā)現(xiàn)，推動了基因組學的革命，促進新學科的創(chuàng)立，如個人基因組學，細菌基因組流行病學。第3頁/共37頁

基因測序技術(shù)起源與發(fā)展新一代基因測序技術(shù)平臺簡介新一代基因測序技術(shù)的臨床應(yīng)用

腫瘤分子診斷領(lǐng)域腫瘤研究領(lǐng)域遺傳病篩查領(lǐng)域傳染病研究領(lǐng)域細菌基因組流行病領(lǐng)域第4頁/共37頁基因測序技術(shù)起源與發(fā)展20世紀70年代初期，分別在幾個獨立的實驗室，以不同的方法實現(xiàn)了基因測序直到1977年，可靠的基因測序方法——Sanger測序法和Maxam—Gilbert測序法才問世Sanger測序法因為其試劑高效低毒，因而得到不斷的改善，進一步發(fā)展成依靠染色的自動化分析基因測序法2001年，完成了第一個人類基因組序列圖譜。該基因組序列圖譜不僅可以幫助快速識別單個基因，而且為探索研究人類基因組的主要區(qū)域提供了便利第5頁/共37頁Sanger測序法的局限性對常規(guī)DNA測序來說太昂貴，太耗時。隨著各種動植物基因組數(shù)據(jù)的大量產(chǎn)生，科學家開始專注于基因的個體多樣性，并嘗試用新的方法來描述個體的基因組由于成本和測序數(shù)據(jù)輸出量的限制，用Sanger測序法獲取不同個體的基因組進行大規(guī)模的對比研究是不可行的從2004年起，一系列新的DNA測序技術(shù)，名為“新一代基因測序技術(shù)”，不斷得到開發(fā)，在生物醫(yī)學領(lǐng)域引發(fā)了許多突破性的發(fā)現(xiàn)，并徹底改變了基因組測序領(lǐng)域的發(fā)展第6頁/共37頁自動化Sanger方法被認為是“第一代”基因測序技術(shù)“新一代基因測序技術(shù)”(NextGenerationSequencingTechnologies，NGS)

相對Sanger法，新一代基因測序技術(shù)的主要優(yōu)點是能夠快速，低價地提供巨量的基因序列數(shù)據(jù)。它們每次測序運行能讀取的堿基數(shù)高達百億?？梢源嫔锞蚨ㄐ?、定量分析?？梢钥焖贉y序全基因組，大規(guī)模對比研究不同個體的基因組成為可能；第7頁/共37頁2004年起開始面世的一系列新的DNA測序技術(shù)有統(tǒng)一的名稱——“新一代基因測序技術(shù)”。事實上各種新一代基因測序技術(shù)的化學測序方法有著顯著的不同，但是有3個共同特征：1.新一代基因測序技術(shù)都能夠同時處理以百萬計的基因序列讀取，這也是它們能高通量地測序基因的原因。2.新一代基因測序技術(shù)通過PCR擴增創(chuàng)建它們的基因序列讀取片段庫，勞動強度大大低于傳統(tǒng)的使用載體克隆的Sanger測序。3.與自動化Sanger測序技術(shù)相比，新一代基因測序技術(shù)所產(chǎn)生的讀長都比較短(35—700堿基)。第8頁/共37頁NGS技術(shù)平臺簡介

Roche(454)GSFLX基因測序技術(shù)

首先對目標DNA的酶切短鏈進行油包水PCR擴增，然后以擴增的DNA酶切短鏈為模版來合成新的DNA。當對應(yīng)的三磷酸脫氧核苷酸(dNTP)被加入到新合成的DNA鏈上時，添加的熒光素酶能產(chǎn)生光。根據(jù)閃光次序以及對應(yīng)加入的dNTP，測序儀所攜帶的軟件就可以創(chuàng)建目標DNA模板的具體序列信息。第9頁/共37頁Sanger法是根據(jù)核苷酸在某一固定的點開始，隨機在某一個特定的堿基處終止，并且在每個堿基后面進行熒光標記，產(chǎn)生以A、T、C、G結(jié)束的四組不同長度的一系列核苷酸，然后在尿素變性的PAGE膠上電泳進行檢測，從而獲得可見的DNA堿基序列。第10頁/共37頁諾貝爾獎得主FrederickSanger和WalterGilbert

第11頁/共37頁第12頁/共37頁第13頁/共37頁Illumina的GenomeAnalyzer測序技術(shù)對目標DNA的酶切短鏈進行擴增是通過橋式PCR來完成的。經(jīng)過PCR擴增后，芯片上的目標DNA片段簇被用來做為模版來合成新的DNA鏈，四個差異化標記的熒光dNTP為每個目標DNA片段簇的復(fù)制提供原料。一旦單個dNTP被加入新合成DNA的末端，此dNTP的差異化標記熒光就會被讀取并記錄，由此實現(xiàn)邊合成邊測序。當DNA延伸步驟完成，測序儀所攜帶的電腦軟件程序就會分析每個目標DNA簇的序列，并完成各個短鏈序列的對齊，以及目標基因組的組合。第14頁/共37頁第15頁/共37頁

近年來，Illumina公司在基因測序儀行業(yè)一直占據(jù)主導地位，其產(chǎn)品占據(jù)60％市場份額。2010年推出的IlluminaGA測序儀，HiSeq2000,就是一個標準高通量大規(guī)模平行基因測序的典范。HiSeq2000一次測序耗時為10天，能完成600億個堿基對的測序，試劑成本僅為24000美元。Illumina公司在2011年推出的測序儀，MiSeq，針對較小的實驗室和臨床診斷市場，其數(shù)據(jù)輸出量小于2010年推出的HiSeq200。

第16頁/共37頁BiosystemsSOLID基因測序儀

該測序技術(shù)采用了獨特的以四色熒光標記寡核苷酸的連續(xù)連接反應(yīng)為基礎(chǔ)測序方法。具體操作也是開始于油包水PCR擴增連接在微珠上的目標DNA酶切短鏈。擴增后，用共價鍵把微珠及其擴增目標DNA短鏈連接到芯片表面，然后放置到SOLID基因測序儀的緩沖液測試槽內(nèi)進行DNA測序。

第17頁/共37頁第18頁/共37頁PacificBioSciences公司的PacBioRS測序儀

采用熒光素標記的dNTPs進行單分子實時測序，又稱為SMRT技術(shù)(singlemolecule，real-time)，因此該公司的PacBioRS為第3代DNA測序儀。

第19頁/共37頁SMRT技術(shù)將DNA聚合酶固化在每個稱為ZMW的小池里，僅照射ZMW底部30nm的區(qū)域，實時檢測熒光素標記的4種核苷酸摻入。利用其專有的SMRT芯片(SMRTcel1)，內(nèi)含約75000個ZMW，因此可以同時對近75000個單分子進行平行測序。不同于傳統(tǒng)方法將熒光素標記在核苷酸堿基上，SMRT技術(shù)的核苷酸標記在磷酸鏈上，避免了染料基團干擾DNA聚合酶的活性；一個核苷酸摻入后，DNA聚合酶切斷磷酸鏈，釋放出染料分子，降低了干擾信號。這些技術(shù)保證了PacBioRS能夠進行單分子實時測序，讀長在1000bp以上，反應(yīng)時間從30min到1d。

第20頁/共37頁第21頁/共37頁LifeTechnologies公司／IonTorrentPGM測序平臺

自然條件下，DNA聚合酶將1個核苷酸摻入DNA鏈中，就會釋放1個H+，該H+所帶電荷改變了溶液的pH值，可供離子探頭檢測分析。

IonTorrent測序又被標榜為第4代測序技術(shù)。無需熒光物質(zhì)標記和使用高清晰度攝像頭，測序成本大幅降低，能在2～3h內(nèi)完成。模板讀長較短是其缺點。第22頁/共37頁第23頁/共37頁自2010年以來，使用新一代測序儀的臨床試驗數(shù)量有大幅度的增加。有全基因組測序，也有全外顯子組測序，還有RNA測序和定向測序（targetedsequencing）。不論采取哪種測序方式，所有這些臨床試驗都是為了發(fā)現(xiàn)致病的遺傳異常，并且根據(jù)這些異常信息來指導臨床診療工作。與此同時，這些信息也有助于生物制藥企業(yè)開發(fā)出更多的靶向治療藥物，也可以幫助了解某些藥物產(chǎn)生耐藥性的原因。新一代基因測序技術(shù)的臨床應(yīng)用

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腫瘤分子診斷領(lǐng)域

第26頁/共37頁BRCA是BreastCancerSusceptibilityGene的縮寫。BRCA基因變異最早被發(fā)現(xiàn)與女性的乳腺癌和卵巢癌發(fā)病有密切的關(guān)系。BRCA1和BRCA2屬于抑癌基因，叫乳腺/卵巢腫瘤易感基因。正常細胞中，BRCA1和BRCA2可以幫助DNA損傷修復(fù)和維護DNA完整，防止癌細胞的產(chǎn)生。如果BRCA1/2產(chǎn)生基因變異，失去了這一保護，細胞產(chǎn)生癌變的幾率大大增加。而BRCA2基因變異與男性的乳腺癌，胰腺癌和前列腺癌有密切關(guān)系。第27頁/共37頁38歲的美國女星AngelinaJolie在《紐約時報》上發(fā)表了《我的醫(yī)療選擇》一文，稱由于自己攜帶有變異BRCA1基因，醫(yī)生估計她患上乳腺癌的風險高達87%，患上卵巢癌的風險高達50%，她母親在56歲時死于癌癥。朱莉說切除術(shù)后，她患上乳腺癌的風險已降至5%。將來有與安吉麗娜?朱莉同樣擔憂的女性就可以借助NGS技術(shù)進行BRCA檢測，提早采取相關(guān)措施。第28頁/共37頁遺傳病篩查領(lǐng)域

新一代測序技術(shù)對于新生兒孟德爾式遺傳病篩查項目也很有幫助。臨床醫(yī)生們通常都會根據(jù)表型與基因型的關(guān)系進行單基因遺傳檢測，以此來明確診斷。不過孟德爾式遺傳病也能夠以非常復(fù)雜的形式存在，同一種表型可能是由多個基因來決定的，其中就有可能存在目前尚未被發(fā)現(xiàn)的基因。在這種情況下單基因檢測就顯得無能為力了，新一代測序技術(shù)解決起這種問題來卻毫不費力，能夠以極快的速度完成這一切。第29頁/共37頁腫瘤研究領(lǐng)域中的應(yīng)用全基因組測序

Parsons等利用新一代基因測序技術(shù)對22例多形性膠質(zhì)母細胞進行測序．新發(fā)現(xiàn)大部分年輕膠質(zhì)瘤病人和復(fù)發(fā)膠質(zhì)瘤病人在IDH1位點上均頻發(fā)突變。

Lin等用大規(guī)模平行測序法檢測多形性膠質(zhì)母細胞瘤和正常腦組織的基因，在多形性膠質(zhì)母細胞瘤中篩選出4535個基因表達異常。

Lee等利用新一代基因測序技術(shù)對原發(fā)性肺癌和和相鄰正常組織的完整序列進行比較．發(fā)現(xiàn)超過5萬個“點突變”，其中530個得到確認：進一步觀察發(fā)現(xiàn)激酶基因發(fā)生氨基酸突變的概率較高。第30頁/共37頁全基因組小分子RNA(miRNA)的分析

傳統(tǒng)的芯片技術(shù)在檢測miRNA時面臨序列短、高度同源等難題，而新一代基因測序技術(shù)利用miRNA序列短及其本身高通量的優(yōu)勢，能發(fā)現(xiàn)更多的miRNA。

Schulte等利用SOLID新一代基因測序技術(shù)對良性和惡性的神經(jīng)母細胞瘤中miRNA的表達進行測序，通過聚類分析提示：兩者miRNA表達差異顯著，兩者miRNA的轉(zhuǎn)錄組也有顯著差異。第31頁/共37頁腫瘤全轉(zhuǎn)錄組分析

轉(zhuǎn)錄水平是調(diào)控腫瘤細胞增殖的重要方法。在腫瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用。而利用新一代測序技術(shù)能高通量地鑒定腫瘤細胞中轉(zhuǎn)錄組的變化，為腫瘤研究提供重要信息。An等利用SOLID新一代基因測序技術(shù)對正常眼葡萄膜黑色素細胞和眼葡萄膜黑色素瘤細胞中的全轉(zhuǎn)錄組進行檢測，通過選擇性對5155個已注釋的參與細胞通路、周期、凋亡和細胞黏附連接的基因進行詳細分析．鑒定出21個基因在正常眼葡萄膜黑色素細胞和眼葡萄膜黑色素瘤細胞中表達有差異．這21個基因可能參與眼葡萄膜黑色素瘤的發(fā)生。第32頁/共37頁基因的甲基化檢測

基因的甲基化已經(jīng)成為腫瘤分子生物學研究的熱點之一，利用改良的甲基化特異數(shù)字化核型分析法能敏感測出全基因組的DNA甲基化位點，且具有高通量、低成本的優(yōu)勢。第33頁/共37頁新一代基因測序技術(shù)在腫瘤研究中的發(fā)展前景

新一代基因測序技術(shù)在腫瘤研究中處于起始階段，基本上局限于腫瘤的分子生物學方面的研究，通過高通量大規(guī)模的檢測腫瘤