新技術(shù)在醫(yī)學(xué)實驗中的應(yīng)用內(nèi)容提綱一實驗方法介紹檢測蛋白表達水平方法：Westernblot,2D-gel,免疫共沉淀，Shotgun，免疫組化，流式細胞測定，激光掃描共聚焦顯微，綠熒光蛋白標(biāo)記法，螢光素酶標(biāo)記法，ELISA.檢測DNA/RNA表達水平方法：Southernblot,Northernblot,原位雜交,PCR.基因操作方法:基因敲除，基因沉默.2新技術(shù)在醫(yī)學(xué)實驗中的應(yīng)用內(nèi)容提綱二實用技術(shù)介紹細胞活性檢測：MTT,MTS，CCK-8,Calcein-AM.細胞凋亡檢測：Westernblot,流式，TUNEL,Hoechst33258，DNAladder.活性氧自由基（ROS）檢測：DCF,SOD,GSH,ESR.3新技術(shù)在醫(yī)學(xué)實驗中的應(yīng)用Westernblot原理：Westernblot利用了蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)。在一定pH的緩沖液中，特定的蛋白質(zhì)具有固定的電荷數(shù)。在電場的作用下，蛋白質(zhì)將按電荷數(shù)及蛋白質(zhì)分子量大小在凝膠中分布。SDS法的Westernblot進一步簡化，SDS的應(yīng)用使得所有的蛋白都帶均勻的負電荷，此時蛋白電泳的距離只與蛋白分子量大小有關(guān)。

4新技術(shù)在醫(yī)學(xué)實驗中的應(yīng)用Westernblot原理：凝膠是由聚丙烯酰胺組成，聚丙烯酰胺的濃度決定了膠中孔徑的大小，孔徑越大，蛋白運動越容易，越快，對大分子量的蛋白的分離效果好。反之亦然。測定大分子量蛋白（>１００ＫＤ）時宜用低濃度膠，測定小分子量蛋白（<３０ＫＤ）時宜用高濃度膠。另有梯度膠（例如４－１５％），可以保證在一定范圍內(nèi)的蛋白都相對均勻分離。5新技術(shù)在醫(yī)學(xué)實驗中的應(yīng)用轉(zhuǎn)膜方法主要分為濕轉(zhuǎn)(Wettransfer)和半干轉(zhuǎn)（Semi-drytransfer）。濕轉(zhuǎn)速度較慢，操作難度較大，易出現(xiàn)氣泡，但轉(zhuǎn)膜效率高，特別對大分子量蛋白效果好。半干轉(zhuǎn)的特點與濕轉(zhuǎn)正好相反，對大分子量蛋白容易轉(zhuǎn)不上。根據(jù)實際情況選擇。6新技術(shù)在醫(yī)學(xué)實驗中的應(yīng)用7新技術(shù)在醫(yī)學(xué)實驗中的應(yīng)用Westernblot電泳完成后，蛋白質(zhì)被轉(zhuǎn)移到固相載體（NC膜或者PVDF膜）上，固相載體以非共價鍵形式吸附蛋白質(zhì)，且能保持電泳分離的多肽類型及其生物學(xué)活性不變。膜上的非特異性結(jié)合位點需使用脫脂牛奶等封閉，以固相載體上的蛋白質(zhì)或多肽作為抗原，與對應(yīng)的抗體起免疫反應(yīng)，再與酶,同位素或者熒光標(biāo)記的第二抗體起反應(yīng)，經(jīng)過底物顯色,放射自顯影或熒光成像以檢測電泳分離的特異性目的基因表達的蛋白成分。8新技術(shù)在醫(yī)學(xué)實驗中的應(yīng)用示例實驗步驟：①蛋白質(zhì)抽提

②蛋白濃度測定：按試劑盒說明書，用BCA法測定蛋白濃度。③變性聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS)：玻璃板夾槽中依次加入分離膠和濃縮膠，待其凝固；根據(jù)濃度取適量待測蛋白與5x上樣緩沖液混勻后,95度變性10分鐘,加入上樣孔中，浸于電泳緩沖液，以75V（濃縮膠）及120V（分離膠）恒壓電泳。④轉(zhuǎn)膜：裁切與凝膠同樣大小的NC膜和濾紙，NC膜置于轉(zhuǎn)膜緩沖液中浸泡30min以上。按順序依次放置濾紙、凝膠、NC膜、濾紙，半干法以40mA恒流轉(zhuǎn)膜2h。9新技術(shù)在醫(yī)學(xué)實驗中的應(yīng)用⑤抗原抗體反應(yīng):蛋白質(zhì)以脫脂牛奶封閉1h后，與一抗4℃孵育過夜，與二抗室溫孵育1h，TBST洗滌4次，每次5min。⑥顯色:加入DAB顯色5min，蒸餾水洗終止顯色。凝膠分析軟件Quantityone測灰度值。

顯色系統(tǒng)多種多樣。傳統(tǒng)的二抗通常是與辣根過氧化酶結(jié)合的抗體，遇DAB顯色或者與專用試劑盒試劑反應(yīng)使膠片曝光。新型二抗與熒光物質(zhì)結(jié)合，在專用的熒光成像儀下讀取熒光印跡，可以方便地進行多通道westernblot(multiplexwesternblotting),免去切膜或者抗體清除的步驟.10新技術(shù)在醫(yī)學(xué)實驗中的應(yīng)用2D-Gel11新技術(shù)在醫(yī)學(xué)實驗中的應(yīng)用免疫共沉淀是一種著重檢測蛋白-蛋白或蛋白-核酸間聯(lián)系的方法?；驹硎抢每乖贵w結(jié)合,以及與抗體相連的小珠（Beads）,以物理方式將目標(biāo)蛋白連同與其相結(jié)合的物質(zhì)分離出來單獨分析。分離后，解離蛋白，以Westernblot的方式檢測潛在目標(biāo)的水平，即可得知目標(biāo)間在細胞中是否有緊密聯(lián)系。12新技術(shù)在醫(yī)學(xué)實驗中的應(yīng)用免疫共沉淀13新技術(shù)在醫(yī)學(xué)實驗中的應(yīng)用Chromatinimmunoprecipitation（CHIP）染色質(zhì)免疫沉淀，與蛋白的共沉淀相似，不同之處是利用甲醛等產(chǎn)生DNA與其上蛋白質(zhì)的交聯(lián)，從而用帶小珠的抗體將蛋白質(zhì)與DNA一起“拉下”，用PCR檢測拉下的DNA.14新技術(shù)在醫(yī)學(xué)實驗中的應(yīng)用“獵槍”法（Shotgunproteomic）15新技術(shù)在醫(yī)學(xué)實驗中的應(yīng)用免疫組化

Immunohistochemistry原理類似Westernblot，但直接在組織切片（或在滿足一定條件的情況下，整個組織）上進行，保留了原始組織結(jié)構(gòu)，能提供更多的信息。缺點：費時，目標(biāo)蛋白表達不高時不易檢測到，量化統(tǒng)計不易。16新技術(shù)在醫(yī)學(xué)實驗中的應(yīng)用17新技術(shù)在醫(yī)學(xué)實驗中的應(yīng)用18新技術(shù)在醫(yī)學(xué)實驗中的應(yīng)用免疫組化樣本制備通常來講，免疫組化用的樣本為組織切片（幾微米厚）.足夠小且能被完全通透化（Permeabilize)的組織可以直接做在位免疫組化，但應(yīng)用不如原位雜交來得廣泛。冷凍切片信號較好，但受時間，地點，存放條件等限制。石蠟切片具有儲存，使用方便等優(yōu)點，但需要抗原修復(fù)方可進行免疫組化染色，且效果一般差于冷凍切片。19新技術(shù)在醫(yī)學(xué)實驗中的應(yīng)用免疫組化的抗體使用免疫組化中使用的一抗通常與Westernblot中用的相同。二抗被設(shè)計成與一抗的宿主結(jié)合的抗體，一般結(jié)合有探測用分子，免疫組化中常用的是生物素（biotin）。一抗宿主一般不能與實驗所用組織同種，但必要時也有專用試劑可以允許這種應(yīng)用例子：MOM（MouseonMouse)Kit。20新技術(shù)在醫(yī)學(xué)實驗中的應(yīng)用不同的探測方法直接探測法：直接標(biāo)記一抗，不需使用二抗來探測目標(biāo)蛋白表達水平，最簡單但敏感度最差，基本已不用。間接探測法：一抗沒有標(biāo)記，然后用抗一抗的二抗來間接探測目標(biāo)蛋白表達水平。有信號放大作用，敏感度好，節(jié)省試劑。21新技術(shù)在醫(yī)學(xué)實驗中的應(yīng)用間接探測法介紹：PAP法PAP:peroxidaseanti-peroxidasemethod

PAP法使用未標(biāo)記的一抗和二抗，之后加入第三層的探針：peroxidase及其抗體，且抗體的抗原性與一抗相同，都與二抗相結(jié)合。如此以二抗為中心形成“三明治”結(jié)構(gòu)。

22新技術(shù)在醫(yī)學(xué)實驗中的應(yīng)用Avidin-BiotinComplex(ABC)法免疫組化最常用方法之一。也是形成“三明治”樣結(jié)構(gòu)，使用未標(biāo)記的一抗，生物素（biotin）標(biāo)記的二抗，生物素標(biāo)記的peroxidase以及生物素結(jié)合蛋白（Avidin）。需要封閉內(nèi)源性的

peroxidase。必要時，封閉內(nèi)源性的biotin。23新技術(shù)在醫(yī)學(xué)實驗中的應(yīng)用LabeledStreptavidinBiotin(LSAB)法

與ABC法相似，但使用Strptavidin替換一般的生物素結(jié)合蛋白，其與組織的非特異性結(jié)合較少，因此可以降低背景。24新技術(shù)在醫(yī)學(xué)實驗中的應(yīng)用25新技術(shù)在醫(yī)學(xué)實驗中的應(yīng)用免疫組化中的注意要點樣本的準(zhǔn)備封閉（非特異性蛋白質(zhì)結(jié)合位點，內(nèi)源性的peroxidase，內(nèi)源性的biotin）抗體濃度培養(yǎng)溫度顯色時間26新技術(shù)在醫(yī)學(xué)實驗中的應(yīng)用流式細胞儀1實驗原理:

流式細胞儀(FlowCytometer)是采用流式細胞技術(shù)對細胞或顆粒懸液進行快速分析的自動化分析儀器。流式細胞術(shù)（FlowCytometry)是上世紀(jì)70年代發(fā)展起來的一項新技術(shù)。它通過對流動液體中排成單列的細胞或顆粒進行逐個分析、測定細胞或顆粒的光散射和熒光情況，以獲得其大小、內(nèi)部結(jié)構(gòu)、DNA、RNA、蛋白質(zhì)、抗原等物理或化學(xué)特征。要求細胞懸浮在培養(yǎng)基中。對于貼壁細胞，需要先將其游離出來，有一定損傷。

27新技術(shù)在醫(yī)學(xué)實驗中的應(yīng)用流式細胞儀應(yīng)用舉例細胞凋亡、死亡的檢測-AnnexinV/PI雙染色法1原理細胞凋亡的早期生化特征之一是氨基磷脂轉(zhuǎn)移酶活性的降低使磷脂酰絲氨酸(Phosphatdylserine)“翻到”細胞膜的外層。熒光標(biāo)記AnnexinV-FITC(AV)和碘化丙啶(propidumiodide,PI)雙染可區(qū)分細胞凋亡和壞死,對AV和PI均不染色的是正常細胞,對AV染色對PI不染色的為早期凋亡細胞,對AV和PI均染色的為晚期凋亡細胞或壞死細胞。2結(jié)果判斷凋亡細胞對所有用于細胞活性鑒定的染料如PI有抗染性，壞死細胞則不能。細胞膜有損傷的細胞的DNA可被PI著染產(chǎn)生紅色熒光，而細胞膜保持完好的細胞則不會有紅色熒光產(chǎn)生。因此，在細胞凋亡的早期PI不會著染而沒有紅色熒光信號。正?；罴毎c此相似。在雙變量流式細胞儀的散點圖上，左下象限顯示活細胞，為（FITC-/PI-）；右上象限是非活細胞，即壞死細胞，為（FITC+/PI+）；而右下象限為凋亡細胞，顯現(xiàn)（FITC+/PI-）。28新技術(shù)在醫(yī)學(xué)實驗中的應(yīng)用29新技術(shù)在醫(yī)學(xué)實驗中的應(yīng)用

[Ca2+]i的檢測－Fluo-3-AM熒光染色原理用熒光探針Fluo-3-AM進入細胞后經(jīng)非特異性酯酶水解為Fluo-3,后者是鈣離子螯合劑,與鈣離子形成的復(fù)合物經(jīng)紫外激發(fā)可產(chǎn)生熒光,流式細胞儀通過檢測其熒光強度而間接反映胞內(nèi)游離鈣水平。人參皂苷(saponin)降低缺氧的心肌細胞中的鈣超載。Lietal.Thesaponinofredginsengprotectsthecardiacmyocytesagainstischemicinjuryinvitroandinvivo,Phytomedicine,19(6)477-48330新技術(shù)在醫(yī)學(xué)實驗中的應(yīng)用線粒體膜電位（ΔψМ）的測定－rhodanmine123熒光染色原理氧化刺激誘導(dǎo)細胞凋亡可致線粒體兩種功能改變:一是線粒體膜電位降低和線粒體通透性孔開放,二是線粒體產(chǎn)生活性氧。線粒體對rhodanmine123的攝取依賴其膜電位,分析rhodanmine123的熒光強度可反映線粒體的膜電位。

Black:control,Purple:UVBmodel,Yellow:UVB+0.25%PCF,Red:UVB+0.5%PCF,Blue:UVB+1%PCF,Green:UVB+0.1%VitC.31新技術(shù)在醫(yī)學(xué)實驗中的應(yīng)用激光掃描共聚焦顯微(ConfocalLaserScanningMicroscopy，CLSM）1基本原理激光共聚焦顯微鏡是近年來發(fā)展起來的一種結(jié)合激光掃描、計算機自動分析與顯微鏡技術(shù)的新技術(shù)，新儀器。它采用計算機自動定量分析被激光掃描的物體所激發(fā)出的熒光數(shù)量的變化，具有圖像清晰、特異性高、敏感性強、可精確定量等優(yōu)點。2優(yōu)點①激光共聚焦顯微鏡做間接免疫熒光組化染色并做定量分析，利用激光聚焦／熒光標(biāo)記和系統(tǒng)軟件分析對組織進行深層與斷層掃描，不破壞組織細胞的結(jié)構(gòu)，可準(zhǔn)確深層次定位和精確定量，是轉(zhuǎn)化了的精確定量分析。32新技術(shù)在醫(yī)學(xué)實驗中的應(yīng)用②激光共聚焦顯微鏡一般都有2個以上不同波長的激光管，因此只要將標(biāo)本標(biāo)記上不同波長的熒光，就可以在同一張切片上同時分析2種或更多不同指標(biāo)的變化，并比較它們之間的比值變化，方便而精確。③激光共聚焦顯微鏡可以根據(jù)科研需要，提供純熒光、白光、以及熒光與白光合成的圖像等多種圖像。④以往免疫熒光染色多要求冰凍新鮮組織標(biāo)本，如用石蠟切片做免疫熒光染色，在普通熒光顯微鏡下觀察，常因背景非特異性熒光過強而影響觀察結(jié)果。但如用激光共聚焦顯微鏡掃描石蠟切片的熒光染色，可獲得清晰的圖像。33新技術(shù)在醫(yī)學(xué)實驗中的應(yīng)用3應(yīng)用㈠定性定量定位熒光分析:CLSM可對單、雙或三色標(biāo)記的細胞及組織標(biāo)本的熒光進行定性定量定位分析，還可測定膜電位和配體結(jié)合等生化反應(yīng)程度。㈡Ca2和pH等細胞內(nèi)離子的實時定量測定:利用Fluo-3、Fura2等熒光探針，CLSM可以測定Ca2在活細胞內(nèi)的濃度變化。CLSM可測定單個或一群細胞內(nèi)的ca2濃度，并提供細胞內(nèi)Ca2分布的二維及至三維圖像。另外，如果對細胞施加外部的刺激，CLSM就能觀察到細胞內(nèi)各點的Ca2

濃度在外部刺激下隨時間而產(chǎn)生的變化。這對于研究Ca2

等離子細胞內(nèi)動力學(xué)有意義。利用SNAFL類探針可對單個或一群細胞內(nèi)的pH及細胞內(nèi)pH的變化進行測定。使用雙熒光探針Fluo一3和CNARF可進行Ca2

和pH同時測定。㈢細胞的物理化學(xué)動態(tài)監(jiān)測：CLSM可對細胞形狀、周長、面積、平均熒光強度及細胞內(nèi)顆粒數(shù)等參數(shù)進行自動測定，能對細胞的溶酶體、線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、細胞骨架、結(jié)構(gòu)性蛋白質(zhì)、DNA、RNA、酶和受體分子等細胞內(nèi)特異結(jié)構(gòu)的含量、組分及分布進行定量、定性、定時及定位測定。34新技術(shù)在醫(yī)學(xué)實驗中的應(yīng)用㈣藥理研究中的應(yīng)用：CLSM可直接觀察藥物在細胞內(nèi)亞細胞水平的分布，并可了解藥物對細胞內(nèi)結(jié)構(gòu)的特殊親和力及其藥物作用，從而推斷細胞內(nèi)藥物定位及細胞耐藥的相關(guān)機制，還可了解其在細胞內(nèi)代謝的過程。例CLSM可直接觀察扇貝多肽（PCF）在細胞的定位。異硫氰酸熒光素（FITC）標(biāo)記PCF，顯微鏡下確定PCF作用位點在細胞膜上。圖3PCF保護HaCaT細胞的最初作用靶點35新技術(shù)在醫(yī)學(xué)實驗中的應(yīng)用㈤激光顯微細胞外科技術(shù)：CLSM可將激光作為“光子刀”使用，完成諸如細胞膜瞬間穿孔，線粒體、溶酶體等細胞器燒灼，染色體精確切割和神經(jīng)元突起切除等一系列細胞外科術(shù)。㈥在亞細胞定位研究中的應(yīng)用：經(jīng)熒光探針標(biāo)記細胞器，CLSM可探測光敏劑和探針熒光圖像，實現(xiàn)對光敏劑在細胞內(nèi)的亞細胞定位，并進行定性和定量分析。㈦在藥物抗腫瘤活性研究中的應(yīng)用：利用CLSM觀察細胞形態(tài)，記錄細胞的熒光程度，以細胞的熒光程度反映DNA的含量，從而判斷藥物的抗癌活性。㈧在釋藥過程研究中的應(yīng)用：由于CLSM的實時觀測能力，可對控釋藥物的釋藥過程中藥物損耗變化進行觀察。4缺點：①不能觀察到大部分的膜結(jié)構(gòu)特征，尤其是ultrafiltration膜結(jié)構(gòu)。②成像質(zhì)量與掃描速度始終是一對矛盾。③掃描過程耗時較長，且只能掃描不動的微生物，許多活動的大型微生物因運動比較劇烈而對成像造成一定影響。④某些熒光染料可能會對某些活體細胞的活性造成一定的負面影響，因此宜選擇合適的熒光染料，同時適當(dāng)?shù)卣{(diào)整激光的光強，宜用最弱的光對標(biāo)本進行照射掃描。36新技術(shù)在醫(yī)學(xué)實驗中的應(yīng)用ReporterAssay為檢測特定基因能否在目標(biāo)生物體內(nèi)表達及表達水平，Reporterassay常被使用。PromoterTargetGeneReporterGenePromoterTargetGeneProductsReporterProductsEasyDetection37新技術(shù)在醫(yī)學(xué)實驗中的應(yīng)用綠熒光蛋白標(biāo)記OsamuShimomura,MartinChalfie及RogerTsien

于2008年因綠熒光蛋白的發(fā)現(xiàn)，獲諾貝爾化學(xué)獎。

38新技術(shù)在醫(yī)學(xué)實驗中的應(yīng)用熒光素酶標(biāo)記39新技術(shù)在醫(yī)學(xué)實驗中的應(yīng)用直接ELISA:

直接使用酶標(biāo)記的一抗探測固定的抗原。最為簡單，避免二抗可能的交叉反應(yīng)，但敏感性較差，需要大量昂貴的標(biāo)記抗體。間接ELISA:不直接標(biāo)記一抗，而是標(biāo)記抗一抗的二抗。信號可以被有效放大，且一抗免疫活性不會受標(biāo)記的影響。但二抗可能發(fā)生交叉反應(yīng)?！叭髦巍?/p>

ELISA:

先在盤中固定一層捕獲抗體（Captureantibody），以之將目標(biāo)抗原捕獲，之后再使用一層標(biāo)記的探測抗體。兩種抗體必須小心選擇以避免相互之間的反應(yīng)。此法不需純化抗原，同時具有極高的敏感性和特異性。但對抗原有要求：至少有兩個結(jié)合位點。競爭性ELISA:

樣本和純化并事先固定的目標(biāo)抗原對標(biāo)記的抗體進行競爭，如果樣本中存在目標(biāo)抗原，最終得到的信號就會下降。此法可用于不純的樣本，重復(fù)性可靠，但敏感性和特異性都較低。ELISA

（Enzyme-LinkedImmunoSorbentAssay,

酶聯(lián)免疫吸附試驗）40新技術(shù)在醫(yī)學(xué)實驗中的應(yīng)用ELISA

（Enzyme-LinkedImmunoSorbentAssay,

酶聯(lián)免疫吸附試驗）41新技術(shù)在醫(yī)學(xué)實驗中的應(yīng)用酶標(biāo)儀1原理

酶標(biāo)儀（MicroplateReader）是對用專用反應(yīng)盤進行的，建立在吸光度改變基礎(chǔ)上的各種實驗進行讀取的設(shè)備，因其主要用途之一是讀取酶聯(lián)免疫吸附試驗結(jié)果而得名。但其也可讀取其他實驗結(jié)果，如蛋白定量，各種酶活性檢測，MTT等。新式酶標(biāo)儀除讀取一般吸光度外，還可以讀取熒光數(shù)據(jù)：實驗者指定激發(fā)光波長及放射光波長，帶熒光讀取功能的酶標(biāo)儀即可讀取該數(shù)據(jù)。同時還有的酶標(biāo)儀帶加溫，振蕩，定時重復(fù)讀取等等功能，極大地方便了實驗。42新技術(shù)在醫(yī)學(xué)實驗中的應(yīng)用SouthernBlotting43新技術(shù)在醫(yī)學(xué)實驗中的應(yīng)用EdwinSouthern,SouthernBlotting的發(fā)明者。左圖為他在Nature上關(guān)于SouthernBlotting的文章中的例圖。44新技術(shù)在醫(yī)學(xué)實驗中的應(yīng)用NorthernBlotting45新技術(shù)在醫(yī)學(xué)實驗中的應(yīng)用Insituhybridization(原位雜交技術(shù))1原理原位雜交的本質(zhì)就是在一定的溫度和離子濃度下，使具有特異序列的單鏈探針通過堿基互補規(guī)則與組織細胞內(nèi)待測的核酸復(fù)性結(jié)合而使得組織細胞中的特異性核酸得到定位，并通過探針上所標(biāo)記的檢測系統(tǒng)將其在核酸的原有位置上顯示出來。

46新技術(shù)在醫(yī)學(xué)實驗中的應(yīng)用47新技術(shù)在醫(yī)學(xué)實驗中的應(yīng)用舉例：原位雜交檢測p21mRNA將用DEPC處理后的無菌蓋玻片（細胞飛片）置入6孔培養(yǎng)板中，接種細胞于孔內(nèi)，37℃、5%CO2培養(yǎng)至細胞80％融合，處理同1.2細胞培養(yǎng)。將細胞飛片用中性樹膠粘于載玻片上，4％多聚甲醛固定20min，PBS洗5min×2次，系列酒精脫水。蛋白酶K消化細胞，經(jīng)PBS清洗，多聚甲醛固定及酒精系列脫水后于37℃用不含探針的雜交液預(yù)雜交45min。加入含探針90g·L-1的雜交液，置于密閉濕盒中，60℃過夜。雜交結(jié)束后，NBT顯色，中性樹膠封片。48新技術(shù)在醫(yī)學(xué)實驗中的應(yīng)用49新技術(shù)在醫(yī)學(xué)實驗中的應(yīng)用PCR(PolymeraseChainReaction)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，是研究工作中最常用到的技術(shù)之一。50新技術(shù)在醫(yī)學(xué)實驗中的應(yīng)用TaqDNA聚合酶在黃石國家公園沸泉的耐熱細菌中發(fā)現(xiàn)并分離，在72攝氏度下可正常反應(yīng)，高達95攝氏度的情況下仍不變性，是PCR反應(yīng)得以進行的基礎(chǔ)?，F(xiàn)代技術(shù)已經(jīng)在此基礎(chǔ)上發(fā)展出多種改良型的耐高溫DNA聚合酶，使反應(yīng)效率提升，反應(yīng)條件要求降低。51新技術(shù)在醫(yī)學(xué)實驗中的應(yīng)用PCR條件DNA聚合酶。反應(yīng)所需模板（Template），DNA分子。反應(yīng)所需引物（Primer），兩個方向。反應(yīng)所需原料（dNTPs）。適宜的緩沖液。適宜的反應(yīng)溫度。Real-timePCR還需要熒光染料。目前很多試劑廠商以“MasterMix”的形式提供PCR試劑，極大地方便了實驗。52新技術(shù)在醫(yī)學(xué)實驗中的應(yīng)用PCR的分類以DNA為起始點的PCR（目的為大量復(fù)制擴增目標(biāo)基因）。以RNA為起始點的PCR（RT-PCR，目的為檢測目標(biāo)基因表達強度），其又可分為一般的RT-PCR和Real-timeRT-PCR。53新技術(shù)在醫(yī)學(xué)實驗中的應(yīng)用RT-PCR的一般步驟1.RNA的抽提經(jīng)典的方法是利用RNA在酒精中溶解度低使之析出。較新的RNA抽提試劑盒在此基礎(chǔ)上利用了能特異性與RNA結(jié)合的微型分離柱，大大提高RNA產(chǎn)率和純度。2.檢測RNA質(zhì)量和濃度比色法檢測OD260/280和OD260/230，前者在DNA應(yīng)該為1.8而RNA應(yīng)該為2左右，后者應(yīng)該在2.0-2.2左右.

Nanodrop儀器可用極小量樣本作快捷而相對準(zhǔn)確的檢測。54新技術(shù)在醫(yī)學(xué)實驗中的應(yīng)用RT-PCR的一般步驟3.逆轉(zhuǎn)錄。一般應(yīng)用試劑盒進行，將逆轉(zhuǎn)錄酶，mRNA逆轉(zhuǎn)錄引物及相應(yīng)的原料，緩沖液等與抽提到的RNA混合，在適宜溫度下，從RNA逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA。4.PCR反應(yīng)。將PCR各原料，引物及模板混合后，在PCR儀上進行反應(yīng)。如為一般RT-PCR，反應(yīng)結(jié)束后取產(chǎn)物電泳，EB染色后凝膠成像分析，如為Real-timePCR，反應(yīng)結(jié)束后直接取數(shù)據(jù)分析即可。55新技術(shù)在醫(yī)學(xué)實驗中的應(yīng)用半定量RT-PCR直接完成指定周期數(shù)的PCR反應(yīng)后，以電泳及EB染色法確定終產(chǎn)物的量。優(yōu)點：不需特別試劑和儀器，成本低廉。缺點：檢測的敏感度較差，實驗步驟較繁瑣，且涉及有毒試劑EB的使用。56新技術(shù)在醫(yī)學(xué)實驗中的應(yīng)用Real-TimePCR借助與雙鏈DNA特異性結(jié)合發(fā)出熒光的特殊染料（如SYBRGreen），在每一個PCR周期完成后都讀取一次產(chǎn)物的量，可以得到實時的PCR產(chǎn)物擴增的數(shù)量并較精確地定量分析。優(yōu)點：反應(yīng)敏感度好，CT(Cyclethreshold)值的測定避免了非線性擴增對結(jié)果的干擾。缺點：需要專用PCR儀器，器材及試劑價格較昂貴。57新技術(shù)在醫(yī)學(xué)實驗中的應(yīng)用Real-TimePCR示例注意在使用SYBRGreen為基礎(chǔ)的Real-timePCR時要檢測熔化曲線以確定得到的是單一產(chǎn)物。58新技術(shù)在醫(yī)學(xué)實驗中的應(yīng)用PCR易出現(xiàn)的問題產(chǎn)物錯誤：引物設(shè)計不佳/結(jié)合溫度有誤/存在污染/鎂離子濃度不當(dāng)。無產(chǎn)物：引物設(shè)計不當(dāng)或引物數(shù)量不足/存在干擾反應(yīng)物質(zhì)/污染/實驗方法或設(shè)備問題。多重產(chǎn)物：結(jié)合溫度設(shè)置太低/鎂離子濃度不當(dāng)/引物過多或生成引物二聚體/外來DNA污染。59新技術(shù)在醫(yī)學(xué)實驗中的應(yīng)用多重產(chǎn)物及解決實例左上為多重產(chǎn)物實例?？梢钥吹诫m然只加入一種引物，此反應(yīng)卻生成了兩種產(chǎn)物。調(diào)整實驗條件（主要是結(jié)合溫度）后，同一反應(yīng)得到均一產(chǎn)物。60新技術(shù)在醫(yī)學(xué)實驗中的應(yīng)用Microarray61新技術(shù)在醫(yī)學(xué)實驗中的應(yīng)用基因敲除經(jīng)典的基因敲除法（Knockout），將目標(biāo)基因替換為一個外源性的基因（常用耐新霉素基因以方便篩選細胞），從而敲除目標(biāo)基因。相對來講，經(jīng)典基因敲除法較為簡單。但有一些不足之處，如有的基因敲除就無法讓動物生存，有的會被代償?shù)取?2新技術(shù)在醫(yī)學(xué)實驗中的應(yīng)用條件敲除（ConditionalKnockout）一般是靠Cre-LoxP/FLP-Frt重組系統(tǒng)來完成，目標(biāo)基因上被加入LoxP或Frt元素，帶有LoxP的小鼠與在某些組織上特異性表達Cre（或者Flp）的小鼠交配，后代的特定器官上的該基因即被敲除。易導(dǎo)致錯位翻譯。63新技術(shù)在醫(yī)學(xué)實驗中的應(yīng)用四環(huán)素控制的條件基因表達/沉默：轉(zhuǎn)錄的激活子（Transactivator）rTA，在無四環(huán)素存在的前提下，能與一個特別定制的操縱子tet-O結(jié)合，激活下游目標(biāo)基因的表達，而四環(huán)素（如多西環(huán)素）的應(yīng)用將使此激活子與四環(huán)素結(jié)合，迅速中止目標(biāo)基因的表達。64新技術(shù)在醫(yī)學(xué)實驗中的應(yīng)用RNA干擾1原理：

近年來的研究表明，將與mRNA對應(yīng)的正義RNA和反義RNA組成的雙鏈RNA(dsRNA)導(dǎo)入細胞，可以使mRNA發(fā)生特異性的降解，導(dǎo)致其相應(yīng)的基因沉默。這種轉(zhuǎn)錄后基因沉默機制(post-transcriptionalgenesilencing,PTGS)被稱為RNA干擾（RNAi）。2小的干涉RNA（siRNA）：

是在RNA干涉過程中人工體外合成的小片段RNA，由19-21個堿基對的核心部分和每條鏈上2個懸掛的核苷酸組成。3應(yīng)用：

①研究信號傳導(dǎo)通路和基因功能

RNAi能夠在哺乳動物中降低特異性基因的表達，制作多種表型，而且抑制基因表達的時間，控制基因表達的部位。

②開展基因治療的新途徑

一基因家族的多個基因具有一段同源性很高的保守序列這一特性，設(shè)計針對這一區(qū)段序列的dsRNA分子，只注射一種dsRNA即可以產(chǎn)生多個基因表達同時降低的表現(xiàn)，也可同時注射多種dsRNA而將多個序列不相關(guān)的基因同時剔除。為治療多基因調(diào)控的腫瘤疾病，帶來新的治療策略。

65新技術(shù)在醫(yī)學(xué)實驗中的應(yīng)用66新技術(shù)在醫(yī)學(xué)實驗中的應(yīng)用Fas干擾實驗設(shè)計空白對照組、UVB模型組、UVB＋試劑對照組

(不加siRNA,僅加入轉(zhuǎn)染試劑)、UVB＋siRNA組接種細胞至6孔板讓其在有血清無抗生素的培養(yǎng)基中生長，使得轉(zhuǎn)染時細胞融合度達60%～80%

轉(zhuǎn)染siRNA組每孔加入800μL轉(zhuǎn)染復(fù)合物[8μLsiRNA溶于100μL轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基＋8μLsiRNA轉(zhuǎn)染試劑溶于100μL轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基]67新技術(shù)在醫(yī)學(xué)實驗中的應(yīng)用37℃、5%CO2孵育5－7h去除轉(zhuǎn)染復(fù)合物，更換含10%小牛血清的正常培養(yǎng)基37℃、5%CO2細胞培養(yǎng)箱中孵育18－24h轉(zhuǎn)染48h后進行UVB照射30min干擾效率的檢測

RT-PCR干擾后FasmRNA的表達檢測水平

Westernblot檢測干擾后Fas蛋白的表達水平68新技術(shù)在醫(yī)學(xué)實驗中的應(yīng)用常用實驗技術(shù)介紹69新技術(shù)在醫(yī)學(xué)實驗中的應(yīng)用細胞活性（CellViability）檢測檢測樣本中活細胞的相對數(shù)量。最為常用的實驗手段之一，在抑瘤，毒理，細胞保護等實驗中都必不可少。MTTMTSCCK8Calcein-AM染色PI染色TrypanBlue染色70新技術(shù)在醫(yī)學(xué)實驗中的應(yīng)用MTT法MTT，化學(xué)名3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴鹽，商品名是噻唑鹽?；罴毎貏e是增殖的細胞中能量代謝旺盛，其中線粒體能量代謝過程中產(chǎn)生的琥珀酸脫氫酶可將淡黃色的MTT還原為藍色的結(jié)晶formazan沉積在細胞內(nèi)和細胞周圍，形成的結(jié)晶與增殖的細胞數(shù)成正比。二甲基亞砜（DMSO）可溶解formazan，用酶聯(lián)免疫檢測儀在490nm波長處測定其光吸收值，可間接反映細胞數(shù)量。經(jīng)典方法，缺點是較麻煩，誤差相對也較大。71新技術(shù)在醫(yī)學(xué)實驗中的應(yīng)用

MTT的改進型：MTSMTS是在MTT的基礎(chǔ)上加以改進的一種四唑鹽，Promega公司將其與電子偶聯(lián)劑PES穩(wěn)定混合，形成單一溶液形式，易用而穩(wěn)定的細胞活力檢測試劑。72新技術(shù)在醫(yī)學(xué)實驗中的應(yīng)用CCK-8法CCK-8（CellCountingKit-8），是碧云天公司推出的另一種MTT改進型，基于MTT的另一個衍生物WST-8，與MTS法相似，只需將單一溶液加入即可測定活細胞相對數(shù)量。73新技術(shù)在醫(yī)學(xué)實驗中的應(yīng)用Calcein-AM染色

Calcein-AM是一種熒光染料Calcein的前體，能穿透細胞膜，在活細胞中被轉(zhuǎn)化為Calcein，熒光強度與活細胞數(shù)量成正比?？捎糜跓晒怙@微鏡下標(biāo)記細胞。74新技術(shù)在醫(yī)學(xué)實驗中的應(yīng)用PI染色法PropidiumIodide(PI)為DNA的嵌入劑（Intercalator），同時為一熒光染料。PI的特性是無法穿過活細胞膜，因此其能被用來確定死細胞。前面流式細胞術(shù)已經(jīng)介紹過通過PI染色確定細胞是否死亡的方法。75新技術(shù)在醫(yī)學(xué)實驗中的應(yīng)用TrypanBlue染色法TrypanBlue(臺盼藍）也是一種只能染色死細胞的染料，與PI的不同之處是其染色肉眼可見，可給出直觀的細胞生存與否的表述。76新技術(shù)在醫(yī)學(xué)實驗中的應(yīng)用細胞凋亡檢測Westernblot流式細胞術(shù)TUNELHoechst33258染色DNAladder77新技術(shù)在醫(yī)學(xué)實驗中的應(yīng)用細胞凋亡的信號通路78新技術(shù)在醫(yī)學(xué)實驗中的應(yīng)用Westernblot檢測細胞凋亡需要同時檢測兩個目標(biāo)：Caspase-3及PARP（PolyADP-RibosePolymerase）Caspase-3在正常細胞中以前體酶（Procaspase-3）的形式存在，約為32KD。凋亡發(fā)生時，前體酶被剪切為具有活性的Caspase-3，兩個亞基分別約為17KD和

12KD（分子量隨不同物種有少量波動）79新技術(shù)在醫(yī)學(xué)實驗中的應(yīng)用流式細胞術(shù)法檢測凋亡在流式細胞術(shù)一節(jié)已經(jīng)講到，以AnnexinV/PI雙染色法結(jié)合流式細胞儀即可分辨正?；罴毎?，早期凋亡細胞及晚期凋亡/壞死細胞。81新技術(shù)在醫(yī)學(xué)實驗中的應(yīng)用TUNELTerminaldeoxynucleotidyltransferasedUTPnickendlabeling。末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶脫氧尿苷三磷酸切口末端標(biāo)記?；赥erminaldeoxynucleotidyltransferase(TdT)的應(yīng)用。凋亡發(fā)生時，DNA被切斷，暴露的殘端可以被TdT識別，進而將dNTP聯(lián)接到DNA殘端上。通過標(biāo)記dNTP，凋亡的細胞可以被在位標(biāo)記出來。82新技術(shù)在醫(yī)學(xué)實驗中的應(yīng)用TdT只識別凋亡時產(chǎn)生的DNA斷裂，而不會識別其他原因如輻射導(dǎo)致的DNA斷裂，故可特異性顯示凋亡細胞。常用Biotin-Streptavidin-HRP系統(tǒng)（與免疫組化相仿）顯色。注意需要阻斷內(nèi)源性的過氧化酶，biotin高表達的組織還需要阻斷內(nèi)源性的biotin。83新技術(shù)在醫(yī)學(xué)實驗中的應(yīng)用Kumar

etal.

CardiovascularDiabetology

2007

6:3484新技術(shù)在醫(yī)學(xué)實驗中的應(yīng)用Hoechst33258熒光染色1原理：細胞凋亡的形態(tài)學(xué)表現(xiàn)為染色質(zhì)固縮。Hoechst33258染色后，在熒光顯微鏡下觀察，正常細胞的細胞核呈正常的藍色，而凋亡細胞的細胞核會呈致密濃染或呈碎塊致密濃染，顏色有些發(fā)白。2步驟：

①細胞種入放潔凈蓋玻片的六孔板內(nèi)，待細胞融合至80~90%。

②外界刺激細胞發(fā)生凋亡（紫外線照射）

③Hoechst332