神經(jīng)干細(xì)胞研究進(jìn)展

報告內(nèi)容提要國內(nèi)外研究現(xiàn)狀骨髓源神經(jīng)干細(xì)胞的橫向分化骨髓源神經(jīng)干細(xì)胞致瘤性研究骨髓源神經(jīng)干細(xì)胞的活體示蹤一、國內(nèi)外研究現(xiàn)狀神經(jīng)干細(xì)胞的概念神經(jīng)干細(xì)胞是指來源于神經(jīng)組織及神經(jīng)組織的發(fā)源地、終生保持自我更新能力，并能分化為各種神經(jīng)組織細(xì)胞的一類細(xì)胞稱為神經(jīng)干細(xì)胞。神經(jīng)干細(xì)胞的研究概述1989，Tamir等由造血干細(xì)胞引申出神經(jīng)干細(xì)胞的概念

ReynoldsBA（1992Science）正式提出神經(jīng)干細(xì)胞的概念

90年代以后，國內(nèi)外興起了神經(jīng)干細(xì)胞的研究熱潮神經(jīng)干細(xì)胞的來源

胚胎源性神經(jīng)干細(xì)胞（早期胚胎胚胎神經(jīng)組織）成體源性神經(jīng)干細(xì)胞神經(jīng)組織非神經(jīng)組織（骨髓、脂肪、皮膚等）神經(jīng)干細(xì)胞種子細(xì)胞來源妊娠3個月1.胚胎終止妊娠，取胎腦分離獲取神經(jīng)干細(xì)胞孵化培養(yǎng)移植存在的問題①倫理②免疫排斥③細(xì)胞數(shù)量少2.克隆卵細(xì)胞卵細(xì)胞吸除核+精細(xì)胞DNA電或化學(xué)刺激形成胚胎妊娠3個月終止妊娠取胎腦獲取干細(xì)胞移植存在問題存在的問題①倫理問題②基因缺失或突變3.自身成體干細(xì)胞骨髓（室管膜、脂肪）誘導(dǎo)分化傳代增殖神經(jīng)干細(xì)胞移植

優(yōu)點①骨髓來源豐富、獲取容易②不存在倫理問題③不存在免疫排斥問題

困難定向誘導(dǎo)分化難度大4.髓鞘移植獲取胚胎嗅鞘細(xì)胞培養(yǎng)傳代增殖髓鞘細(xì)胞

移植存在問題①僅適用脫髓鞘疾?、趥惱韱栴}③免疫排斥④細(xì)胞數(shù)量少二、骨髓源神經(jīng)干細(xì)胞的橫向分化雌性SD大鼠

陰道脫落細(xì)胞涂片排卵期合籠三種實驗材料

0.5天胚鼠（精子+）10.5-14.5日胚鼠（作對照）大鼠、貓、家犬骨髓雄性大鼠

骨髓穿刺

恒河猴/成人骨髓（1）（2）（3）主要移植過程動物神經(jīng)干細(xì)胞BrdU或GPF標(biāo)記）動物/人神經(jīng)干細(xì)胞離心，細(xì)胞懸浮于0.85%生理鹽水中經(jīng)立體定向或靜脈或腦室注射，移植到模型動物或病員體內(nèi)觀察動物切片人PET等aba原代培養(yǎng)24h。Nestin陽性的細(xì)胞克隆形成（箭頭）b傳代培養(yǎng)48h。

細(xì)胞再次形成克?。^）aba形成的神經(jīng)干細(xì)胞克隆球b有神經(jīng)元/神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞樣長突起細(xì)胞分化圖1.在蘇木素預(yù)染背景下由神經(jīng)球傳代培養(yǎng)后的Nestin陽性細(xì)胞（↑）。而已分化的細(xì)胞則呈Nestin陽性（▲）(400X)圖2.在有血清條件下傳代培養(yǎng)3周的NSE陽性細(xì)胞(400X)圖3.在有血清條件下傳代培養(yǎng)3周的GFAP陽性細(xì)胞(400X)圖4.在無血清傳代培養(yǎng)中的Nestin陽性神經(jīng)球(400X)NESTIN免疫磁珠法分離大鼠神經(jīng)干細(xì)胞（箭頭）丫啶橙熒光染色鑒定大鼠神經(jīng)干細(xì)胞及分化細(xì)胞活力情況（a,b）.NESTIN免疫磁珠標(biāo)記的大鼠神經(jīng)干細(xì)胞（c）。abcNSCs提純后流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果。a同型對照；b陽性Resultofflowcytometryatpost-purification.aImmunomagneticbeads-free;bWithimmunomagneticbeads

大鼠NSCs提純后檢測神經(jīng)干細(xì)胞BF-1(腦因子)、部分分化早期細(xì)胞

GABA（氨基丁酸）和TH（酪氨酸羥化酶）總RNA表達(dá)765M4321880bp600bp460bp350bp100bpTHGABABF-1

大鼠NSCs提純后RT-PCR法鑒定神經(jīng)干細(xì)胞不同蛋白表達(dá)。

1:BF-1；2:TH；3:GABA；M：分子量標(biāo)記；Control:PBS對照765M4321M12Control100bp350bp460bp520bp600bp880bp3abcd大鼠骨髓基質(zhì)細(xì)胞。0h（a）；13h（b）；39.5h（c）.培養(yǎng)70h（d），將細(xì)胞球分離成單細(xì)胞再種植于滋養(yǎng)細(xì)胞層（空箭頭），有典型的神經(jīng)元樣長突起細(xì)胞形成（黑箭頭）。

大鼠骨髓基質(zhì)細(xì)胞。

a

細(xì)胞增殖情況(48h,100×)b細(xì)胞分化情況（17d,200×）

c分化細(xì)胞形態(tài)（24d,400×）abc貓骨髓基質(zhì)細(xì)胞。9天（a，×400）；18天（b，×400

）;1周（c，×400

）；4周(d，×100)源于骨髓的神經(jīng)干細(xì)胞發(fā)育成大圓細(xì)胞，并可見到處于分裂中及分化后的細(xì)胞。abcd

家犬骨髓源性神經(jīng)干細(xì)胞分化而來典型的神經(jīng)元樣細(xì)胞。（×400）

家犬骨髓源性神經(jīng)干細(xì)胞。擴(kuò)增72h，克隆形成（

×

200）恒河猴的捕捉、麻醉、骨髓獲取。恒河猴骨髓源性NSCs。

a純化后MSCs光鏡下形態(tài)（1d,200×）b增殖后形成的島嶼狀細(xì)胞團(tuán)（7d,200×）c分化后細(xì)胞光鏡下的形態(tài)（24d，100×）

abcabcd恒河猴骨髓源性神經(jīng)干細(xì)胞分化為典型的神經(jīng)元樣細(xì)胞恒河猴骨髓源性NSCs。

a

Nestin染色（10天，DAB顯色，200×）

b分化后表達(dá)NSE抗原陽性的細(xì)胞（20天，

DAB顯色，200×）

c分化后表達(dá)GFAP抗原陽性的細(xì)胞（18天，DAB顯色，200×）abca手術(shù)切口

bMPTP緩慢注入頸內(nèi)動脈ab

模型制作后５w,PET（放射顯影劑為1-[18F]氟代-2-脫氧葡萄糖,2-[18F]FDG）檢查結(jié)果.上圖為軸位，下圖為冠狀位，每圖左側(cè)為模型側(cè)，右側(cè)為對照側(cè)，可見模型側(cè)基底節(jié)區(qū)放射性濃聚明顯少于對照側(cè)模型動物代謝改變（PET檢查）PET檢查模型動物代謝改變（a,b冠狀切；c,d水平切）a造模后10w,對模型動物進(jìn)行灌注．bcd：恒河猴大腦．e：恒河猴腦干abcde

再固定后冰凍切片

雙側(cè)黑質(zhì)中線兩側(cè)DAB染色對比.左圖為正常側(cè)，右圖為模型側(cè)（造模后10w,40×)對照側(cè)模型側(cè)中腦切片DAB染色顯示雙側(cè)紅核（造模后10w,40×）a恒河猴中腦切片對照側(cè)黑質(zhì)TH染色,改良SABC法（造模后10w,200×,）b恒河猴PD模型側(cè)TH染色，改良SABC法（造模后10w,200×）ab

T7

PCMVCMV

BGHPAITR

Ampr

polyA

CoiE1

SV40

ITR

SV40AP

NeomycinSP6

EcoRIEcoRI

CMV

ITR

polyA

Ampr

ITRConstructionofpWAV2-TH

pcDNA3-THpWAV2KpnIEcoRISmaISalIBglIIHindIIIKpnIBamHIBstXITHEcoRIEcoRVBstXINotIXhoIXbaIApaIf1oripWAV2-THKpnITH

EcoRISmaISalIBglII

AmprTH基因載體構(gòu)建BHK-thBHK-thBHKBHKAnti-TH（NoTH-gene）Anti-TH(WithTH-gene)Control（NoTH-gene）Control(WithTH-gene)

轉(zhuǎn)TH基因免疫細(xì)胞化學(xué)檢測（為NSC轉(zhuǎn)基因移植治療奠定基礎(chǔ)）體外Brdu標(biāo)記陽性的恒河猴骨髓源性神經(jīng)干細(xì)胞(10d,200×)源于人骨髓基質(zhì)細(xì)胞的神經(jīng)干細(xì)胞，移植前以rAAV-GFP標(biāo)記的細(xì)胞狀態(tài)abcdef假傷組14×24h腦片(未見BrdU+細(xì)胞,×400)

模型常規(guī)治療組14×24h腦片(偶見BrdU+細(xì)胞,×400)關(guān)于移植后NSC出現(xiàn)時間的初步探索（家犬）干細(xì)胞經(jīng)腦室治療組：傷后第14×24h傷區(qū)BrdU+細(xì)胞，×400干細(xì)胞經(jīng)血管內(nèi)治療組：傷后第14×24h中腦傷區(qū)BrdU+細(xì)胞,×400

家犬骨髓源性神經(jīng)干細(xì)胞經(jīng)BrdU+標(biāo)記后移植至損傷腦內(nèi)（×400）關(guān)于NSC移植途徑的初步探索（家犬）

人骨髓源性神經(jīng)干細(xì)胞。陳某，男，38歲.

神經(jīng)干細(xì)胞克隆球形成，并有長突起細(xì)胞分化。a:0hb:7dc:10dd:12dabcd人骨髓源性神經(jīng)干細(xì)胞增殖分裂情況（１）人骨髓源性神經(jīng)干細(xì)胞增殖分裂情況（２）abcd人骨髓源性神經(jīng)干細(xì)胞。李某，男，45歲.由源于骨髓基質(zhì)細(xì)胞的神經(jīng)干細(xì)胞球分化出神經(jīng)元樣長突起細(xì)胞。14d（a、b），17d（c、d）.ab人骨髓源性神經(jīng)干細(xì)胞。何某，女性，22歲.源于骨髓基質(zhì)細(xì)胞的神經(jīng)干細(xì)胞克隆球及其分化的神經(jīng)元樣長突起細(xì)胞。原代培養(yǎng)12d（a），18d（b）。

人骨髓源性神經(jīng)干細(xì)胞。張某，女，42歲d.骨髓基質(zhì)細(xì)胞原代培養(yǎng)8天（a,b），細(xì)胞發(fā)育更大、更圓，顆粒明顯。培養(yǎng)10天d(c,d)，具有長突起的神經(jīng)元樣細(xì)胞分化形成，突起間有連接。abcdabc人骨髓源性神經(jīng)干細(xì)胞。朱某，男，27歲。分化前的干細(xì)胞階段（a,12天）及分化后形成典型的神經(jīng)元樣長突起細(xì)胞(b，20-30天)。ab源于人骨髓神經(jīng)干細(xì)胞的長突起細(xì)胞免疫細(xì)胞化學(xué)方法鑒定。aNSE陽性.雙極神經(jīng)元.bGFAP-陽性，神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞。.氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品混合液4.183:天冬氨酸；7.947:谷氨酸；11.661:甘氨酸RA因子培養(yǎng)10天純骨髓源性神經(jīng)干細(xì)胞

天冬氨酸氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品混合液4.183:天冬氨酸；7.947:谷氨酸；11.661:甘氨酸Lif因子培養(yǎng)10天純骨髓源性神經(jīng)干細(xì)胞

谷氨酸純培養(yǎng)基空白對照肝臟細(xì)胞陰性對照

源于人骨髓基質(zhì)細(xì)胞的神經(jīng)干細(xì)胞，移植前狀態(tài)。abcd20%30%40%10%骨髓源性神經(jīng)干細(xì)胞移植手術(shù)中。(神經(jīng)干細(xì)胞準(zhǔn)備)手術(shù)顯微鏡檢測下進(jìn)行神經(jīng)干細(xì)胞移植。傷后３個月運(yùn)動性失語神經(jīng)干細(xì)胞移植術(shù)術(shù)前術(shù)后（6個月）術(shù)前術(shù)后（4個月）C3-6損傷3個月病員，神經(jīng)干細(xì)胞移植術(shù)三、骨髓源神經(jīng)干細(xì)胞致瘤性研究U251細(xì)胞豆球蛋白A（ConA）凝集試驗（ConA:100μg/ml），顯示U251腫瘤細(xì)胞有明顯的凝集反應(yīng)，細(xì)胞表面結(jié)構(gòu)發(fā)生改變。光鏡100×骨髓源性NSC豆球蛋白A（ConA）凝集試驗（ConA:100μg/ml），顯示骨髓源性NSC無明顯的凝集反應(yīng)。光鏡200×神經(jīng)干細(xì)胞的致瘤性研究體外培養(yǎng)10天的骨髓源性NSC的染色體Ｇ帶核型分析，顯示為正常核型（46，XY），未見染色體數(shù)目異常和畸變。表明經(jīng)體外培養(yǎng)的骨髓源性NSC保持了正常的遺傳學(xué)特性。U251細(xì)胞在軟瓊脂中培養(yǎng)18天，可見明顯的細(xì)胞克隆形成，表明其不具有停泊依賴性，呈現(xiàn)惡性細(xì)胞的表現(xiàn)。光鏡200×體外培養(yǎng)的骨髓源性NSCs在軟瓊脂中培養(yǎng)18天，未見細(xì)胞克隆形成，表明其