SDS是陰離子去污劑，能斷裂分子內和分子間的氫鍵，破壞蛋白分子的二、三級結構。作用有四：去蛋白質電荷、解離蛋白質之間的氫鍵、取消蛋白分子內的疏水作用、去多肽折疊。而強還原劑如疏基乙醇，二硫蘇糖醇能使絆胱氨酸殘基間的二硫鍵斷裂。在樣品和凝膠中加入還原劑和SDS后，分子被解聚成多肽鏈，解聚后的氨基酸側鏈和SDS結合成蛋白-SDS膠束，所帶的負電荷大大超過了蛋白原有的電荷量，這樣就消除了不同分子間的電荷差異和結構差異。SDS一般采用的是不連續(xù)緩沖系統(tǒng)，濃縮膠是由AP催化聚合而成的大孔膠，凝膠緩沖液為pH6.7的Tris-HC1。分離膠是由AP催化聚合而成的小孔膠，凝膠緩沖液為pH8.9Tris-HC1。電極緩沖液是pH8.3Tris-甘氨酸緩沖液。2種孔徑的凝膠、2種緩沖體系、3種pH值使不連續(xù)體系形成了凝膠孔徑、pH值、緩沖液離子成分的不連續(xù)性，這是樣品濃縮的主要因素。當樣品液和濃縮膠選TRIS/HCL緩沖液，電極液選TRIS/甘氨酸。電泳開始后，HCL解離成氯離子，甘氨酸解離出少量的甘氨酸根離子。蛋白質帶負電荷，因此一起向正極移動，其中氯離子最快，甘氨酸根離子最慢，蛋白居中。電泳開始時氯離子泳動率最大，超過蛋白，因此在后面形成低電導區(qū)，而電場強度與低電導區(qū)成反比，因而產生較高的電場強度，使蛋白和甘氨酸根離子迅速移動，形成以穩(wěn)定的界面，使蛋白聚集在移動界面附近，濃縮成一中間層。過硫酸鉉（AP）為催化劑，四甲基乙二胺（TEMED）為加速劑。在聚合過程中，TEMED催化過硫酸鉉產生自由基，后者引發(fā)丙烯酰胺單體聚合，同時甲叉雙丙烯酰胺與丙烯酰胺鏈間產生甲叉鍵交聯(lián)，從而形成三維網狀結構。當分子量在15KD到200KD之間時，蛋白質的遷移率和分子量的對數呈線性關系，符合下式：logMW=K-bX，式中：MW為分子量，X為遷移率，k、b均為常數，若將已知分子量的標準蛋白質的遷移率對分子量對數作圖，可獲得一條標準曲線，未知蛋白質在相同條件下進行電泳，根據它的電泳遷移率即可在標準曲線上求得分子量。SDS—聚丙烯酰胺凝膠電泳經常應用于提純過程中純度的檢測，純化的蛋白質通常在SDS電泳上應只有一條帶，但如果蛋白質是由不同的亞基組成的，它在電泳中可能會形成分別對應于各個亞基的幾條帶。SDS一聚丙烯酰胺凝膠電泳具有較高的靈敏度，一般只需要不到微克量級的蛋白質，而且通過電泳還可以同時得到關于分子量的情況，這些信息對于了解未知蛋白及設計提純過程都是非常重要的。Acr:丙烯酰胺Bis：甲叉雙丙烯酰胺AP：過硫酸鉉——化學催化劑TEMED:四甲基乙二胺——加速劑實驗材料1、30%丙烯酰胺混合液（Acr:Bis為29:1）：將60ml水預熱至37攝氏度，加入丙烯酰胺（Acr）29g及甲叉丙烯酰胺（Bis），溶解并補水至100ml。用0.45微米孔徑濾紙過濾，查證溶液pH值不超過7.0。貯棕色瓶中于4°C保存，可用一個月。（Acr）29.2g及（Bis）g丙烯酰胺（Acr）及甲叉丙烯酰胺（Bis）有很強的神經毒性并容易吸附于皮膚，其作用具有累積效應。稱量時應戴手套和口罩。2、1.5mol/LpH8.8Tris-HCl緩沖液取1mol/LHCL溶液48ml、三羥甲基甲烷（Tris），加雙蒸餾水至80ml使其溶解，調pH至8.8,然后用雙蒸餾水稀釋至100ml，置棕色瓶中，4C貯存。3、1.0mol/LpH6.8Tris-HCl緩沖液取1mol/LHCL溶液48ml，Tris，加雙蒸餾水至80ml，調pH6.8，用雙蒸餾水稀釋至100ml，置棕色瓶中，4°C貯存。100ml分離膠1.5mol/LpH8.8Tris-HCl緩沖液：將Trisg完全溶于50ml去離子水中，加加HCL調pH至8.8,加水定容至100ml。室溫保存。100ml積層膠:將Trisg完全溶于50ml去離子水中，加HCL調pH至6.8,加水定容至100ml。室溫保存。4、Tris-甘氨酸電泳緩沖液94g甘氨酸，加入50ml10%（w/v）SDS（電泳級）存儲液（），用去離子水補至1000ml。pH8.3。5、10%過硫酸銨（AP）：過硫酸銨于1.5ml進口EP管中，用時加1ml去離子水溶解。2周內使用。6、10%SDS（十二烷基磺酸鈉）：在900ml水預熱至68攝氏度，加入100g電泳級SDS溶解，補水至1000ml。SDS顆粒易擴散，稱量時戴面罩。10%SDS無需滅菌。室溫保存。7、四甲基乙二胺（TEMED）：10%TEMED0.1mlTEMED,加0.9ml蒸餾水。8、上樣緩沖液取1.0mol/LpH6.8Tris-HCl緩沖液6.25ml，蔗糖10g，SDS，1g/L漠酚藍10ml，加蒸餾水溶解，混合至100ml。樣品緩沖液：5ml1mol/l的Tris-HCl（pH6.7），2.5gSDS,1ml巰基乙醇，漠酚蘭，10g蔗糖，加水定容至100ml。2X樣品緩沖液（10ml）：甘油2ml，漠酚藍，1MTris?Cl（）1ml巰基乙醇，10%SDS4ml。2X上樣緩沖液（10ml）：0.6ml1mol/LTris-HCL（pH6.8）4ml50%的甘油，2ml10%SDS，2ml1mol/L二硫蘇糖醇（DTT），1ml1%漠酚藍，0.9ml蒸餾水，可在4C存放數周，或在-20C保存數月。2X上樣緩沖液（10ml）：1ml1mol/LTris-HCL（pH6.8）2ml100%的甘油，4ml10%SDS，2ml1mol/L二硫蘇糖醇（DTT），2g溴酚藍，1ml去離子水，在-20C保存數月。9、考馬斯亮藍R250染色液：45ml去離子水，45ml甲醇，10ml冰乙酸混合液，溶解考馬斯亮藍R-250，加入的先后順序為：考馬斯亮藍R250，甲醇或者乙醇，蒸餾水，乙酸。用Whatman1號濾紙過濾染液去除顆粒物質。不可隔夜以免影響染色效果。10、脫色液：45ml去離子水，45ml甲醇，10ml冰乙酸混合液。取冰醋酸7.5ml、甲醇5ml，加蒸餾水至100ml?？捡R斯亮藍脫色液：10ml甲醇，10ml冰醋酸，80ml蒸餾水。11、蛋白質分子量標志物：市售中分子量蛋白質分子量標志物。也可選擇5種以上的已知分子量蛋白質自行配制，注意其分子量分布要能滿足需要，各種蛋白質的濃度基本相等。配制Tris-甘氨酸SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分離膠溶液溶液成分總體積5ml總體積10ml總體積15ml總體積20ml總體積25ml總體積30ml6%水

30%丙烯酰胺Tris(pH8.8)10%SDS10%過硫酸胺TEMED8%水30%丙烯酰胺Tris(pH8.8)10%SDS10%過硫酸胺TEMED10%水30%丙烯酰胺Tris(pH8.8)10%SDS10%過硫酸胺TEMED12%水30%丙烯酰胺Tris(pH8.8)10%SDS10%過硫酸胺TEMED15%水30%丙烯酰胺Tris(pH8.8)10%SDS10%過硫酸胺TEMED配制Tris-甘氨酸SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳5%濃縮膠溶液溶液成分總體積3ml總體積4ml總體積5ml總體積6ml總體積8ml水30%丙烯酰胺1MTris(pH6.8)10%SDS10%過硫酸胺TEMED四、實驗方法1、用1%瓊脂將長玻璃板下端封住，冷凝30分，灌12%分離膠（15ml）,凝膠液加至約距前玻璃板頂端（距梳子齒約），接著在分離膠溶液上輕輕覆蓋約1cm高的蒸餾水以封膠。約30min后，若在分離膠與水層之間可見一個清晰的界面，表明凝膠已聚合。將水倒出，吸干，灌滿5%濃縮膠（8ml，4ml用于Mini-ProteinIII型電泳槽）后立即插入梳子，冷凝30分后取出梳子。2、預電泳：將1X電泳緩沖液加入內外電泳槽，使凝膠的上下端均能浸泡在電泳緩沖液內；接通電源，上槽為負極，下槽為正極，80V預電泳3?5min。3、取20-30四1蛋白提取液與20-30四1樣品緩沖液混合，于100°C水浴加熱3-5min使蛋白變性（離心5?10s），用微量進樣器以50/的量注入點樣孔，不加樣槽注入樣品緩沖液。取20ul收集液，加入5乂樣品緩沖液5ul，在80C水浴鍋中煮5min。取血清0.1ml、上樣緩沖液0.9ml，混勻，在沸水中煮沸min。4、打開電源將電壓調到80v，待樣品跑過壓縮膠后將電壓調到120-150V至電泳到膠底部為止。5、將凝膠小心取下放入容器中，加入染色液，用搖床搖2-3h（染色時間需根據凝膠厚度適當調整）；待條帶清晰后倒出染色液，凝膠脫色至大致看清條帶約需1h，完全脫色則需更換脫色液2?3次，震蕩達24h以上。將電泳后的凝膠取出，置于培養(yǎng)皿中，用蒸餾水沖去殘留緩沖液加入染色液將凝膠完全浸泡其中，放入微波爐內，高火檔照射0秒，停留1min，再照射10秒，反復幾次至凝膠上色后倒出染色液，用蒸餾水沖去殘留染色液，加入脫色液，高火檔蛔，倒出脫色液，再加入新鮮脫色液照射20秒，重復5—6次，直至背景清晰透明于凝膠分析儀上成像分析?！咀⒁馐马棥磕z不聚合的可能原因（1）試劑質量差，應使用電泳級別的試劑。（2）過硫酸銨和TEMED的量不夠或失活，可增加劑量或重配新鮮的儲存液。（3）凝膠聚合時溫度太低，應以室溫為宜。上樣時，樣品不能沉到加樣孔底部，可能是上樣緩沖液中甘油含量不足；或是加樣孔底部留有聚合的丙烯酰胺。經過煮沸的樣品雖然可以在-20C保存數周，但若反復凍融會導致蛋白質的降解。從-20C取出的樣本，上樣前應先升至室溫，確保SDS沉淀溶解。注意避免電泳條帶彎曲畸變：①“微笑”現象，可能是因為凝膠中間部分溫度過高，降低電壓便可得到改善.②“皺眉”現象，常常是因為凝膠底部有氣泡或聚合不均勻。③“拖尾”、“紋理”現象，則多為樣品溶解不佳，增加蛋白樣品的溶解度并離心除去不溶性顆粒即可克服。（主要是樣品融解效果不佳或分離膠濃度過大引起的。處理辦法：加樣前離心；選擇適當的樣品緩沖液，加適量樣品促溶劑；電泳緩沖液時間過長，重新配制；降低凝膠濃度。）④“暈輪”效應（holoeffect）多為加樣過量所致。非特異性的染色主要是由于未溶解的染料的沉積而成，應將染料溶液過濾后再用。如果電泳后將對蛋白質進行定量檢測，須特別注意：1）已知和未知樣品必須使用相同的溶劑系統(tǒng)、相同的濃度、相同的加樣量，并在同一塊凝膠上電泳和染色。樣品如何處理？根據樣品分離目的不同，主要有三種處理方法：還原SDS處理、非還原SDS處理、帶有烷基化作用的還原SDS處理。1）還原SDS處理：在上樣buffer中加入SDS和DTT（或Beta巰基乙醇）后，蛋白質構象被解離，電荷被中和，形成SDS與蛋白相結合的分子，在電泳中，只根據分子量來分離。一般電泳均按這種方式處理，樣品稀釋適當濃度，加入上樣Buffer，離心，沸水煮5min，再離心加樣。2）帶有烷基化作用的還原SDS處理：碘乙酸胺的烷基化作用可以很好的并經久牢固的保護SH基團，得到較窄的譜帶；另碘乙酸胺可捕集過量的DTT，而防止銀染時的紋理現象°100ul樣品緩沖液中10ul20%的碘乙酸胺，并在室溫保溫30min。3）非還原SDS處理：生理體液、血清、尿素等樣品，一般只用1%SDS沸水中煮3min，未加還原劑，因而蛋白折疊未被破壞，不可作為測定分子量來使用。4.提高SDS電泳分辨率的途徑？聚丙烯酰胺的充分聚合，可提高凝膠的分辨率。建議做法：待凝膠在室溫凝固后，可在室溫下放置一段時間使用。忌即配即用或4度冰箱放置，前者易導致凝固不充分，后者可導致SDS結晶。一般凝膠可在室溫下保存4天，SDS可水解聚丙烯酰胺。9.什么是“鬼帶”，如何處理？“鬼帶”就是在跑大分子構象復雜的蛋白質分子時，常會出現在泳道頂端（有時在濃縮膠中）的一些大分子未知條帶或加樣孔底部有沉淀，主要由于還原劑在加熱的過程中被氧化而失去活性，致使原來被解離的蛋白質分子重新折疊結合和亞基重新締合，聚合成大分子，其分子量要比目標條帶大，有時不能進入分離膠。但它卻于目標條帶有相同的免疫學活性，在WB反應中可見其能與目標條帶對應的抗體作用。處理辦法：在加熱煮沸后，再添加適量的DTT或Beta巰基乙醇，以補充不足的還原劑；或可加適量EDTA來阻止還原劑的氧化。為什么電泳的條帶很粗？電泳中條帶很粗是常見的事，主要是未濃縮好的原因。處理辦法：適當增加濃縮膠的長度；保證濃縮膠貯液的pH正確（6.7）；適當降低電壓；為什么電泳電壓很高而電流卻很低呢？這種現象一般初學者易出現。比如電壓50v以上，可電流卻在5mA以下。主要是由于電泳槽沒