第1頁，共129頁，2023年，2月20日，星期三生物體內(nèi)酶合成的過程稱為酶的生物合成。利用微生物代謝活動生產(chǎn)所需酶的過程，稱為酶的發(fā)酵生產(chǎn)。第2頁，共129頁，2023年，2月20日，星期三微生物酶的開發(fā)應(yīng)用：(1)微生物生長繁殖快，生活周期短。因此，用微生物來生產(chǎn)酶產(chǎn)品，生產(chǎn)能力（發(fā)酵）幾乎可以不受限制地擴(kuò)大，能夠滿足迅速擴(kuò)張的市場需求。(2)微生物種類繁多，它們散布于整個地球的各個角落，而且在不同的環(huán)境下生存的微生物都有其完全不同的代謝方式，能分解利用不同的底物。(3)這一特征就為微生物酶品種的多樣性提供了物質(zhì)基礎(chǔ)。(4)特別是當(dāng)基因工程介入時，動植物細(xì)胞中存在的酶，幾乎都能夠利用微生物細(xì)胞獲得。

因此，有計劃和仔細(xì)地篩選微生物菌種，通?？梢垣@得能夠生產(chǎn)幾乎任何一種酶的適當(dāng)細(xì)胞。第3頁，共129頁，2023年，2月20日，星期三第一節(jié)酶發(fā)酵生產(chǎn)用微生物菌種微生物菌種是發(fā)酵生產(chǎn)酶的首要條件。目前投入工業(yè)發(fā)酵生產(chǎn)酶的菌種包括細(xì)菌、放線菌、酵母菌、霉菌等。第4頁，共129頁，2023年，2月20日，星期三第5頁，共129頁，2023年，2月20日，星期三一、酶發(fā)酵生產(chǎn)用菌種的要求產(chǎn)酶量高，具有生產(chǎn)應(yīng)用價值；易培養(yǎng)，即能適應(yīng)大生產(chǎn)粗放的營養(yǎng)和培養(yǎng)條件，包括廉價原料，對工藝條件要求不苛刻；代謝速率高，發(fā)酵周期短；產(chǎn)酶穩(wěn)定性好，菌種的生產(chǎn)性能不易退化，不易感染噬菌體；安全可靠，要求菌種不是致病菌，其代謝安全無毒，在系統(tǒng)發(fā)育樹上最好與病原體無關(guān)；選用產(chǎn)胞外酶的菌種，有利于酶的分離提取。第6頁，共129頁，2023年，2月20日，星期三二、微生物產(chǎn)酶菌株的獲得從土壤以及發(fā)酵生產(chǎn)材料中分離；菌種保存中心。第7頁，共129頁，2023年，2月20日，星期三1、含菌樣品的采集

采樣的目的、采樣地點、采樣方法及采樣的數(shù)量。若預(yù)先不了解某種產(chǎn)酶微生物的具體來源，一般可從土壤分離。產(chǎn)纖維素產(chǎn)脂肪酶產(chǎn)果膠酶產(chǎn)糖化酶第8頁，共129頁，2023年，2月20日，星期三2、菌種的分離純化劃線分離法稀釋分離法第9頁，共129頁，2023年，2月20日，星期三3.菌種的初篩第10頁，共129頁，2023年，2月20日，星期三4.菌種的復(fù)篩5.產(chǎn)酶最佳條件的確定第11頁，共129頁，2023年，2月20日，星期三6.微生物產(chǎn)酶性能的進(jìn)一步提高經(jīng)誘變獲得高產(chǎn)菌種突變體利用代謝工程和代謝調(diào)節(jié)機(jī)理來提高微生物的酶產(chǎn)量。運用遺傳工程、基因工程的手段將原有菌株中的目的基因轉(zhuǎn)移到另外一些對生產(chǎn)環(huán)境適應(yīng)性更強(qiáng)的微生物細(xì)胞內(nèi)，使其高效表達(dá)。第12頁，共129頁，2023年，2月20日，星期三7.微生物產(chǎn)酶菌種的保藏斜面保藏沙土管保藏冷凍保藏第13頁，共129頁，2023年，2月20日，星期三第二節(jié)發(fā)酵工藝條件及控制一、培養(yǎng)基的營養(yǎng)成分培養(yǎng)基是指人工配制的用于細(xì)胞培養(yǎng)和發(fā)酵的各種營養(yǎng)物質(zhì)的混合物。在設(shè)計和配制培養(yǎng)基時，應(yīng)特別注意各種組分的種類和含量，以滿足細(xì)胞生長、繁殖和新陳代謝的需要，并要調(diào)節(jié)至適宜的pH。還必須注意到，有些細(xì)胞生長、繁殖階段和發(fā)酵階段所要求的培養(yǎng)基有所不同，在此情況下，要根據(jù)需要配制不同的生長培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基。第14頁，共129頁，2023年，2月20日，星期三1．碳源碳源是指能夠向細(xì)胞提供碳素化合物的營養(yǎng)物質(zhì)。通常碳源同時也是提供能量的能源。碳是構(gòu)成細(xì)胞成分的主要元素之一，也是各種酶的重要組成元素。所以，碳源是酶發(fā)酵生產(chǎn)乃至其他產(chǎn)物的發(fā)酵生產(chǎn)的必不可少的營養(yǎng)物質(zhì)。目前，在酶發(fā)酵生產(chǎn)中最常用的碳源是淀粉及其水解物，如糊精、麥芽糖、葡萄糖等。第15頁，共129頁，2023年，2月20日，星期三不同的細(xì)胞對各種碳源的利用情況大不相同，所以在配制培養(yǎng)基時應(yīng)根據(jù)不同細(xì)胞的不同要求而選擇適宜的碳源。在酶的發(fā)酵生產(chǎn)中，除了要從營養(yǎng)的角度考慮碳源的選擇以外，還要考慮到碳源對酶生物合成的調(diào)節(jié)作用，主要要考慮酶生物合成的誘導(dǎo)作用以及是否存在分解代謝物作用。在選擇碳源時應(yīng)盡量選用對所需的酶有誘導(dǎo)作用的碳源，而不使用或少使用有分解代謝物阻遏作用的碳源。例如，α-淀粉酶的發(fā)酵生產(chǎn)中，應(yīng)選用對該酶有誘導(dǎo)作用的淀粉作為碳源，而不用對該酶的生物合成有分解代謝物阻遏作用的果糖作為碳源。β-半乳糖苷酶發(fā)酵應(yīng)選用乳糖為碳源，而不用或少用葡萄糖為碳源等等。在選擇碳源時，必需考慮原料的供求和價格問題。第16頁，共129頁，2023年，2月20日，星期三2．氮源氮是組成細(xì)胞蛋白質(zhì)和核酸的重要元素之一，也是酶分子的主要組成元素。凡能夠向細(xì)胞提供氮源素的營養(yǎng)物質(zhì)稱為氮源。氮源可分為有機(jī)氮源和無機(jī)氮源兩種。有機(jī)氮源主要是各種蛋白質(zhì)及其水解產(chǎn)物。如：酪蛋白、豆餅粉、花生餅粉、蛋白胨、酵母膏、牛肉膏、多肽、氨基酸等。無機(jī)氮源是含氮的各種無機(jī)化合物，如硫酸銨、磷酸銨、硝酸銨、硝酸鉀、硝酸鈉等各種銨鹽和硝酸鹽等。第17頁，共129頁，2023年，2月20日，星期三不同的細(xì)胞對各種氮源的要求各不相同，應(yīng)根據(jù)要求進(jìn)行選擇和配制。一般說來，動物細(xì)胞要求有機(jī)氮，植物細(xì)胞主要要求無機(jī)氮，微生物細(xì)胞中，異養(yǎng)型微生物用有機(jī)氮，自養(yǎng)型微生物用無機(jī)氮。碳和氮兩者的比例對酶的產(chǎn)量有顯著的影響。所謂碳氮比（C/N）一般是指培養(yǎng)基中碳元素（C）的總量與氮元素（N）總量之比。可通過測定或計算培養(yǎng)基中碳和氮的含量而求出。有的氮源及其濃度如氨基酸的變化對酶發(fā)酵有代謝調(diào)節(jié)作用。第18頁，共129頁，2023年，2月20日，星期三3．無機(jī)鹽無機(jī)鹽的主要作用是提供細(xì)胞生命活動不可缺少的無機(jī)元素，并對培養(yǎng)基的PH、氧化還原電位和滲透壓起調(diào)節(jié)作用。根據(jù)細(xì)胞對無機(jī)元素需要量的大小，可分為主要元素（大量元素）和微量元素兩大類。主要元素有：磷、硫、鉀、鈉、鎂、鈣等。微量元素有：銅、錳、鋅、鉬、鈷、碘等。微量元素是細(xì)胞生命活動不可缺少的，但需要量很少，過量反而會引起不良效果，必須嚴(yán)加控制。

第19頁，共129頁，2023年，2月20日，星期三各種無機(jī)元素的功用各不相同，有些是細(xì)胞的主要組分，如：磷、硫等；有些是酶的組分，如：磷、硫、鋅、鈣等；有些是酶的激活劑或抑制劑，如：鉀、鎂、鐵、鋅、銅、錳、鈣、鉬、鈷、氯、溴、碘等；有些則是對pH、滲透壓、氧化還原電位起調(diào)節(jié)作用的，如：鈉、鉀、鈣、氯、磷等。其中磷是特別重要的元素，它是構(gòu)成核酸和磷脂的成分。微量元素有的是某些酶的組成成分，有的是酶的激活劑，也有的是輔酶的必需成分。第20頁，共129頁，2023年，2月20日，星期三4．生長因子生長因素是指細(xì)胞生長繁殖所必不可缺的微量有機(jī)化合物主要包括各種氨基酸、嘌呤、嘧啶、維生素，以及動植物生長激素等。在酶的發(fā)酵生產(chǎn)中，通常在培養(yǎng)基中加進(jìn)玉米漿、酵母膏等天然原料。其中玉米漿最常用。第21頁，共129頁，2023年，2月20日，星期三5、產(chǎn)酶促進(jìn)劑

在培養(yǎng)基中添加某種少量物質(zhì)，能顯著提高酶的產(chǎn)率，這類物質(zhì)稱為產(chǎn)酶促進(jìn)劑。誘導(dǎo)物表面活性劑

表面活性劑能夠增加細(xì)胞透性，其處在氣-液界面改善了氧的傳遞速度，還可以保護(hù)酶的活性，另外還可消泡提高氧傳遞系數(shù)。第22頁，共129頁，2023年，2月20日，星期三二、發(fā)酵條件的控制及對產(chǎn)酶的影響1、溫度枯草桿菌的最適生長溫度為34～37℃黑曲霉的最適生長溫度為28～32℃通常在生物學(xué)范圍內(nèi)每升高10℃，生長速度就加快一倍，所以溫度直接影響酶反應(yīng)，對于微生物來說，溫度直接影響其生長和合成酶。第23頁，共129頁，2023年，2月20日，星期三有些細(xì)胞發(fā)酵產(chǎn)酶的最適溫度與細(xì)胞生長最適溫度有所不同，而且往往低于生長最適溫度。這是由于在較低的溫度條件下，可以提高酶所對應(yīng)的mRNA的穩(wěn)定性，增加酶生物合成的延續(xù)時間，從而提高酶的產(chǎn)量。有些酶的發(fā)酵生產(chǎn)，要在不同階段控制不同的溫度條件。在生長繁殖階段控制在細(xì)胞生長最適溫度范圍內(nèi)，以利于細(xì)胞生長繁殖，而在產(chǎn)酶階段，則需控制在產(chǎn)酶的最適溫度。第24頁，共129頁，2023年，2月20日，星期三在細(xì)胞生長和發(fā)酵產(chǎn)酶過程中，由于細(xì)胞的新陳代謝作用，不斷放出熱量，會使培養(yǎng)基的溫度升高，同時，熱量不斷擴(kuò)散和散失，又會使培養(yǎng)基溫度降低，兩者綜合，決定了培養(yǎng)基的溫度。由于在發(fā)酵的不同階段，細(xì)胞新陳代謝放出的熱量差別很大，擴(kuò)散和散失的熱量受到環(huán)境溫度等因素的影響，使培養(yǎng)基的溫度變化明顯。為此必須經(jīng)常及時地進(jìn)行調(diào)節(jié)控制，使培養(yǎng)基的溫度經(jīng)常維持在適宜的范圍內(nèi)。溫度控制的方法一般采用熱水升溫，冷水降溫，故此在發(fā)酵罐中，均設(shè)計有足夠傳熱面積的熱交換裝置，如排管、蛇管、夾套、噴淋管等。第25頁，共129頁，2023年，2月20日，星期三2、pH值pH影響微生物體內(nèi)各種酶的活性，從而導(dǎo)致微生物的代謝途徑發(fā)生改變。影響微生物形態(tài)和細(xì)胞膜的透性，從而影響微生物對培養(yǎng)基中營養(yǎng)成分的吸收和代謝產(chǎn)物的分泌。影響培養(yǎng)基中某些營養(yǎng)物質(zhì)的分解或中間代謝產(chǎn)物的解離，從而影響微生物對這些物質(zhì)的利用。第26頁，共129頁，2023年，2月20日，星期三不同細(xì)胞生長繁殖的最適pH有所不同。一般細(xì)胞和放線菌的生長最適pH為中性或微堿性（pH6.5～8.0）；霉菌和酵母的生長最適pH為偏酸性（PH4.0～6.0）；植物細(xì)胞生長的最適pH為5～6。有些細(xì)胞可以同時產(chǎn)生多種酶，通過控制培養(yǎng)基的PH，往往可以改變各種酶之間的產(chǎn)量比例。例如：黑曲霉可生產(chǎn)α—淀粉酶，又可生產(chǎn)糖化酶。當(dāng)培養(yǎng)基的PH偏向中性時，可使α—淀粉酶產(chǎn)量增加而糖化酶減少，反之，當(dāng)培養(yǎng)基的PH偏向酸性時，則糖化酶產(chǎn)量提高而α—淀粉酶的量降低。再如用米曲霉生產(chǎn)蛋白酶，當(dāng)培養(yǎng)基的PH為堿性時，主要生產(chǎn)堿性蛋白酶，降低培養(yǎng)基的PH，則主要生產(chǎn)中性或酸性蛋白酶。第27頁，共129頁，2023年，2月20日，星期三

培養(yǎng)基的pH在細(xì)胞生長繁殖和代謝物產(chǎn)生的過程中往往會發(fā)生變化。這種變化與細(xì)胞特性有關(guān)，也與培養(yǎng)基的組分密切相關(guān)。含糖量高的培養(yǎng)基，由于糖代謝產(chǎn)生有機(jī)酸，會使培養(yǎng)基的pH向酸性方向移動；含蛋白質(zhì)、氨基酸較多的培養(yǎng)基，經(jīng)代謝產(chǎn)生較多的胺類物質(zhì)，使pH向堿性方向移動；以硫酸銨為氮源時，隨著銨離子被細(xì)胞利用，使培養(yǎng)基pH下降；以尿素為氮源時，先隨著尿素被脲酶水解生成氨，使培養(yǎng)基pH上升，然后又隨著氨被細(xì)胞同化而使PH下降；磷酸鹽的存在，對培養(yǎng)基的pH起一定的緩沖作用。所以在細(xì)胞培養(yǎng)和發(fā)酵過程中，必須對培養(yǎng)基的pH進(jìn)行適當(dāng)?shù)目刂坪驼{(diào)節(jié)。PH的調(diào)節(jié)可以通過改變培養(yǎng)基的組分或其比例來實現(xiàn)。必要時可使用緩沖溶液，或流加適宜的酸、堿溶液，以調(diào)節(jié)控制培養(yǎng)基中pH變化。第28頁，共129頁，2023年，2月20日，星期三生產(chǎn)上對pH的控制和調(diào)節(jié)的方法：調(diào)節(jié)培養(yǎng)基初始pH值，控制合適的C/N，調(diào)整生理酸性物質(zhì)與生理堿性物質(zhì)之間的比例。補(bǔ)料調(diào)節(jié)，即通過發(fā)酵過程中流加碳源、氮源來調(diào)節(jié)pH值添加緩沖液，維持一定的pH值如pH值變化較大，可直接加酸或堿進(jìn)行調(diào)節(jié)。通過對溶解氧的調(diào)節(jié)，來控制中間代謝產(chǎn)物的氧化程度。第29頁，共129頁，2023年，2月20日，星期三3、溶解氧的控制培養(yǎng)液中溶解氧的量，決定于在一定條件下氧氣的溶解速度。溶氧速率與通氣量、氧氣分壓、氣液接觸時間、氣液接觸面積以及培養(yǎng)液的性質(zhì)等有密切關(guān)系。一般說來，通氣量越大、氧氣分壓越高、氣液接觸時間越長、氣液接觸面積越大，則溶氧速率越大。培養(yǎng)液的性質(zhì)，主要是黏度、氣泡、以及溫度等對于溶氧速率有明顯影響。調(diào)節(jié)通氣量調(diào)節(jié)氧的分壓調(diào)節(jié)氣液接觸時間調(diào)節(jié)氣液接觸面積改變培養(yǎng)液的性質(zhì)

控制溶解氧方法第30頁，共129頁，2023年，2月20日，星期三三、固定化微生物細(xì)胞發(fā)酵產(chǎn)酶的工藝條件及其控制固定化細(xì)胞又稱固定化活細(xì)胞或固定化增殖細(xì)胞，是指用各種方法固定在載體上又能進(jìn)行生長、繁殖和新陳代謝的細(xì)胞。1、固定化細(xì)胞的預(yù)培養(yǎng)固定化細(xì)胞制備好以后，一般要進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)，以使固定在載體上的細(xì)胞生長繁殖。待長好后，才用于發(fā)酵產(chǎn)酶。為了使固定化細(xì)胞生長良好，預(yù)培養(yǎng)應(yīng)采用利于生長的生長培養(yǎng)基和工藝條件。然后改換成有利于產(chǎn)酶的發(fā)酵培養(yǎng)基和最佳發(fā)酵工藝條件。有時也可采用相同的培養(yǎng)基和工藝條件進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)和發(fā)酵。第31頁，共129頁，2023年，2月20日，星期三2、溶解氧的供給固定化細(xì)胞在進(jìn)行培養(yǎng)和發(fā)酵過程中，由于受到載體的影響，氧的溶解和傳遞受到一定的阻礙作用。特別是采用包埋法制備的固定化細(xì)胞，氧要通過凝膠層擴(kuò)散到凝膠粒內(nèi)部，才能供細(xì)胞應(yīng)用，使氧的供給成為主要的限制性因素。為此，必須增加溶解氧的量，才能滿足細(xì)胞生長和產(chǎn)酶的需要。由于固定化細(xì)胞反映器均不能采用強(qiáng)烈的攪拌，以免破壞固定化細(xì)胞，所以，增加溶解氧的主要方法是加大通氣量。例如，游離的枯草桿菌細(xì)胞發(fā)酵生產(chǎn)α-淀粉酶，通氣量一般控制在0.5∽1m3/(m3.min),而采用固定化細(xì)胞發(fā)酵，其通氣量要1∽2m3/(m3.min),或者更多。第32頁，共129頁，2023年，2月20日，星期三

此外，可通過改變固定化載體，固定化技術(shù)或改變培養(yǎng)基組分等方法，以改善供氧。例如，瓊脂對氧的擴(kuò)散不利，應(yīng)盡量少用作固定化載體；在凝膠中加進(jìn)某些物質(zhì)，使其有利于氧的傳遞；采用過氧化氫酶與細(xì)胞共固定化，再在培養(yǎng)液中添加適量的過氧化氫，通過酶的作用，產(chǎn)生氧氣，共細(xì)胞使用；降低培養(yǎng)基的濃度，盡量降低培養(yǎng)基的粘度等。溶解氧的供給，是固定化細(xì)胞好氣性發(fā)酵的關(guān)鍵限制性因素之一。有待進(jìn)一步研究解決。第33頁，共129頁，2023年，2月20日，星期三3.溫度的控制

固定化細(xì)胞對溫度的適應(yīng)范圍較廣，在分批發(fā)酵和半連續(xù)發(fā)酵中，溫度不難控制。但在連續(xù)發(fā)酵過程中，由于稀釋率較高，反應(yīng)器內(nèi)溫度變化較大。若只是在反應(yīng)器內(nèi)調(diào)節(jié)溫度，則在流加的培養(yǎng)液溫度差別較大時，難以達(dá)到要求。一般在培養(yǎng)液進(jìn)入反應(yīng)器之前，必須預(yù)先調(diào)節(jié)到適宜溫度。第34頁，共129頁，2023年，2月20日，星期三4．培養(yǎng)基成分的控制培養(yǎng)基的濃度不宜過高，并可以通過改變培養(yǎng)基組分來降低培養(yǎng)基的黏度，有利于氧的溶解和擴(kuò)散，從而克服固定化細(xì)胞好氧發(fā)酵過程中氧溶解和傳遞的限制。培養(yǎng)基的組分不能影響固定化細(xì)胞的穩(wěn)定性，或影響很小。第35頁，共129頁，2023年，2月20日，星期三四、固定化微生物原生質(zhì)體發(fā)酵產(chǎn)酶的工藝條件及其控制1、培養(yǎng)基滲透壓的控制2、控制培養(yǎng)基組分、防止細(xì)胞壁再生3、維持較高的原生質(zhì)體濃度第36頁，共129頁，2023年，2月20日，星期三第三節(jié)提高酶產(chǎn)量的方法一、酶生物合成的調(diào)控機(jī)制Reversetranscription第37頁，共129頁，2023年，2月20日，星期三操縱子（operon）：是一組功能上相關(guān)，受同一調(diào)控區(qū)控制的基因組成的一個遺傳單位。第38頁，共129頁，2023年，2月20日，星期三根據(jù)基因調(diào)節(jié)控制理論，在DNA分子中，與酶生物合成有密切關(guān)系的基因有4種。它們是調(diào)節(jié)基因(Regulatorgene)、啟動基因(Promotergene)、操縱基因(Operatorgene)和結(jié)構(gòu)基因(Struturalgene)。第39頁，共129頁，2023年，2月20日，星期三結(jié)構(gòu)基因是編碼蛋白的基因，它與多肽鏈有對應(yīng)關(guān)系。操縱基因在操縱子中起“開關(guān)”作用，它可以與調(diào)節(jié)基因產(chǎn)生的別構(gòu)蛋白（阻遏蛋白）中的一種結(jié)構(gòu)結(jié)合，從而操縱酶生物合成的時機(jī)和合成速度。啟動基因有兩個位點組成，一個是RNA聚合酶的結(jié)合位點，另一個是環(huán)腺苷酸（cAMP）與環(huán)腺苷酸接受蛋白（CRP）的復(fù)合物（cAMP-CRP）的結(jié)合位點。只有在cAMP-CRP復(fù)合物結(jié)合到啟動基因的位點上時，RNA聚合酶才能結(jié)合到其在啟動基因的位點上，這樣，酶的合成才有可能開始，否則酶就無法開始合成。調(diào)節(jié)基因編碼調(diào)節(jié)蛋白。第40頁，共129頁，2023年，2月20日，星期三操縱子的類型誘導(dǎo)型操縱子（inducibleoperon)：在無誘導(dǎo)物的情況下，其基因不表達(dá)或表達(dá)的水平很低，只有當(dāng)誘導(dǎo)物存在時，才能進(jìn)行轉(zhuǎn)錄生成mRNA，進(jìn)而經(jīng)翻譯合成酶。乳糖操縱子阻遏型操縱子（repressibleoperon）：在無阻遏物情況下，基因正常表達(dá)，當(dāng)有阻遏物存在時，轉(zhuǎn)錄則受阻遏，酶不能合成。色氨酸操縱子此外，啟動基因位點上的cAMP-CAP復(fù)合物的結(jié)合與否，也對酶的生物合成起調(diào)節(jié)作用。第41頁，共129頁，2023年，2月20日，星期三基因?qū)γ干锖铣傻恼{(diào)節(jié)控制有3種模式分解代謝物阻遏作用酶合成的誘導(dǎo)作用酶合成的反饋阻遏作用。第42頁，共129頁，2023年，2月20日，星期三1、酶生物合成的誘導(dǎo)作用加進(jìn)某種物質(zhì),使酶的生物合成開始或加速進(jìn)行的過程,稱為酶生物合成的誘導(dǎo)作用。簡稱為誘導(dǎo)作用。起誘導(dǎo)作用的物質(zhì)，稱為誘導(dǎo)劑。第43頁，共129頁，2023年，2月20日，星期三酶生物合成的誘導(dǎo)作用（A）-無誘導(dǎo)物時（B）-添加誘導(dǎo)物時第44頁，共129頁，2023年，2月20日，星期三2、酶生物合成的反饋阻遏作用1.大腸桿菌生長在無機(jī)鹽和葡萄糖的培養(yǎng)基上時，檢測到細(xì)胞內(nèi)有色氨酸合成酶的存在；

2.在上述培養(yǎng)基中加入色氨酸，檢測發(fā)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)色氨酸合成酶的活性降低，直至消失。

3.表明色氨酸的存在阻止了色氨酸合成酶的合成，體現(xiàn)了菌生長的經(jīng)濟(jì)原則：不需要就不合成。第45頁，共129頁，2023年，2月20日，星期三某些代謝物可以阻止某些酶的合成，是通過阻止為該酶編碼的基因的表達(dá)而進(jìn)行的，這種現(xiàn)象叫做酶合成的阻遏。能阻遏酶合成的物質(zhì)叫輔阻遏物。被輔阻遏物作用而停止合成的酶叫阻遏酶。第46頁，共129頁，2023年，2月20日，星期三調(diào)節(jié)基因操縱基因結(jié)構(gòu)基因mRNA酶蛋白阻遏蛋白不能與操縱基因結(jié)合，結(jié)構(gòu)基因表達(dá)調(diào)節(jié)基因操縱基因結(jié)構(gòu)基因輔阻遏物trp代謝產(chǎn)物與阻遏蛋白結(jié)合，使之構(gòu)象發(fā)生變化與操縱基因結(jié)合，結(jié)構(gòu)基因不能表達(dá)色氨酸操縱子（酶的阻遏）

----------阻遏物和操縱基因的調(diào)節(jié)第47頁，共129頁，2023年，2月20日，星期三3、分解代謝阻遏某些物質(zhì)（主要是葡萄糖和其他容易利用的碳源等）分解代謝的產(chǎn)物阻遏某些酶（特別是參與分解代謝的酶）生物合成的現(xiàn)象稱為分解代謝阻遏作用，也稱為葡萄糖效應(yīng)。分解代謝阻遏作用之所以產(chǎn)生，一是由于葡萄糖的分解代謝引起ATP濃度的上升，消耗胞內(nèi)的環(huán)腺苷酸（cAMP）;二是當(dāng)葡萄糖等作為唯一碳源時，葡萄糖的降解物對腺苷酸環(huán)化酶活性有抑制作用，降低cAMP的生成。第48頁，共129頁，2023年，2月20日，星期三細(xì)菌乳糖操縱子的作用機(jī)制(降解物阻遏)調(diào)節(jié)基因啟動子操縱基因lacZlacYlacACAPcAMPCAP-cAMP復(fù)合物mRNA當(dāng)葡萄糖作唯一碳源時，葡萄糖的降解物對腺苷酸環(huán)化酶有抑制作用，則cAMP的濃度降低，CAP-cAMP復(fù)合物減少，不能與啟動子結(jié)合，故轉(zhuǎn)錄不得進(jìn)行。+-半乳糖苷酶-半乳糖苷透過酶-半乳糖苷乙?；D(zhuǎn)移酶酶過去稱葡萄糖效應(yīng)本節(jié)目錄第49頁，共129頁，2023年，2月20日，星期三++++轉(zhuǎn)錄無葡萄糖，cAMP濃度高時促進(jìn)轉(zhuǎn)錄有葡萄糖，cAMP濃度低時不促進(jìn)轉(zhuǎn)錄ZYAOPDNACAPCAPCAPCAPCAPCAPCAP的正調(diào)控第50頁，共129頁，2023年，2月20日，星期三乳糖操縱子的啟動基因內(nèi)，除RNA聚合酶結(jié)合位點外，還有一個稱為cAMP-CAP復(fù)合物的結(jié)合位點。cAMP是環(huán)腺苷酸，CAP是降解物基因活化蛋白（又稱cAMP受體蛋白，CRP）當(dāng)CAP與cAMP結(jié)合后，就會被活化。cAMP-CAP復(fù)合物又會激活啟動基因，使RNA聚合酶與啟動基因結(jié)合。乳糖和葡萄糖同時存在時，因為分解葡萄糖的酶類屬于組成酶，能迅速地將葡萄糖降解成某種中間產(chǎn)物，既會阻止ATP環(huán)化形成cAMP，同時，又會促進(jìn)cAMP分解AMP，從而降低cAMP的濃度，繼而阻遏了乳糖降解有關(guān)的誘導(dǎo)酶合成。第51頁，共129頁，2023年，2月20日，星期三二、打破酶合成調(diào)節(jié)機(jī)制限制及提高酶產(chǎn)量的方法1、通過條件控制提高酶產(chǎn)量（1）添加誘導(dǎo)物誘導(dǎo)物包括：酶的作用底物一些難以代謝的底物類似物酶催化的產(chǎn)物誘導(dǎo)物的前體物質(zhì)同一種酶有多種誘導(dǎo)物誘導(dǎo)和阻遏之間沒有絕對的界限，其關(guān)鍵在于濃度第52頁，共129頁，2023年，2月20日，星期三（2）降低阻遏物的濃度產(chǎn)物阻遏作用：由酶催化作用的產(chǎn)物或代謝途徑的末端產(chǎn)物引起的阻遏作用。分解代謝阻遏作用：有葡萄糖和其他容易利用的碳源等物質(zhì)經(jīng)過分解代謝而產(chǎn)生的物質(zhì)引起的阻遏作用。第53頁，共129頁，2023年，2月20日，星期三為了減少或者解除分解代謝阻遏作用，應(yīng)當(dāng)控制培養(yǎng)基中葡萄糖等容易利用的碳源濃度。常采取的措施如下：盡量不用葡萄糖等容易被利用的碳源，而采用其他較難利用的碳源。采取補(bǔ)料流加以及分次流加碳源的方法，將碳源的濃度控制在較低的水平。添加一定的cAMP第54頁，共129頁，2023年，2月20日，星期三對于受產(chǎn)物阻遏作用的酶（酶合成的反饋阻遏作用），可以通過以下措施降低尾產(chǎn)物積累，解除阻遏，從而提高酶合成的產(chǎn)量。在培養(yǎng)基中添加尾產(chǎn)物類似物，避免尾產(chǎn)物大量生成。采用尾產(chǎn)物的營養(yǎng)缺陷型菌株發(fā)酵生產(chǎn)酶。通過外加該營養(yǎng)物質(zhì)，人為控制其營養(yǎng)物質(zhì)處于亞適量狀態(tài)，避免它對酶合成造成阻遏。直接去尾產(chǎn)物法。在培養(yǎng)基中添加阻止尾產(chǎn)物形成的抑制劑，以減少阻遏物的積累。第55頁，共129頁，2023年，2月20日，星期三2、通過基因突變和基因重組提高酶產(chǎn)量通過基因工程提高酶產(chǎn)量的途徑：使誘導(dǎo)型菌株變成組成型菌株使阻遏型菌株變?yōu)槿プ瓒粜途辏棺瓒粜途辏?。通過基因工程的手段增加細(xì)胞內(nèi)的基因拷貝數(shù)。第56頁，共129頁，2023年，2月20日，星期三誘變的方法：物理化學(xué)物理和化學(xué)的結(jié)合第57頁，共129頁，2023年，2月20日，星期三菌株篩檢（1）組成型突變株篩選將誘變后的產(chǎn)酶菌株在低誘導(dǎo)力的誘導(dǎo)物為主要碳源或氮源的培養(yǎng)基上培養(yǎng)，并同時限制誘導(dǎo)物濃度在一定水平，或同時加入誘導(dǎo)抑制劑，在此條件下增值的為組成型突變株。另外，將誘變后的產(chǎn)酶菌株在含誘導(dǎo)物和不含誘導(dǎo)物的培養(yǎng)基上交替培養(yǎng)，重復(fù)交替培養(yǎng)可獲得突變株。第58頁，共129頁，2023年，2月20日，星期三（2）抗分解代謝產(chǎn)物阻遏型突變株篩檢以被阻遏物的酶的底物為唯一氮源，如產(chǎn)氣氣桿菌誘變后在含有葡萄糖和以組氨酸為唯一氮源的培養(yǎng)基上培養(yǎng)，連續(xù)轉(zhuǎn)移多代，便得到產(chǎn)組氨酸酶的抗葡萄糖效應(yīng)的變異株。變異后的產(chǎn)酶菌在含有葡萄糖和不含葡萄糖的培養(yǎng)基上交替培養(yǎng)。（3）抗尾產(chǎn)物阻遏變異株篩檢可在誘變后的菌株培養(yǎng)基上加入結(jié)構(gòu)上與尾產(chǎn)物類似的毒性抗代謝劑。第59頁，共129頁，2023年，2月20日，星期三3、其他提高酶產(chǎn)量的方法（1）添加表面活性劑表面活性劑可以與細(xì)胞膜相互作用，增加細(xì)胞的透過性，有利于胞外酶的分泌，從而提高酶的產(chǎn)量。將適量的非離子型表面活性劑，如吐溫（Tween）、特里頓(Triton)等添加到培養(yǎng)基中，可以加速胞外酶的分泌，而使酶的產(chǎn)量增加。由于離子型表面活性劑對細(xì)胞有毒害作用，尤其是季胺型表面活性劑（如‘新潔而滅’等）是消毒劑，對細(xì)胞的毒性較大，不能在酶的發(fā)酵生產(chǎn)中添加到培養(yǎng)基中。第60頁，共129頁，2023年，2月20日，星期三（2）添加產(chǎn)酶促進(jìn)劑產(chǎn)酶促進(jìn)劑是指可以促進(jìn)產(chǎn)酶、但是作用機(jī)理未闡明清楚的物質(zhì)。例如，添加一定量的植酸鈣鎂，可使霉菌蛋白酶或者桔青霉磷酸二酯酶的產(chǎn)量提高1～20倍；添加聚乙烯醇（Polyvinylalcohol）可以提高糖化酶的產(chǎn)量。產(chǎn)酶促進(jìn)劑對不同細(xì)胞、不同酶的作用效果各不相同，現(xiàn)在還沒有規(guī)律可循，要通過試驗確定所添加的產(chǎn)酶促進(jìn)劑的種類和濃度。第61頁，共129頁，2023年，2月20日，星期三第四節(jié)酶發(fā)酵動力學(xué)一、酶生物合成的模式細(xì)胞在一定條件下培養(yǎng)生長，其生長過程一般經(jīng)歷調(diào)整期、生長期、平衡期和衰退期等4個階段第62頁，共129頁，2023年，2月20日，星期三第63頁，共129頁，2023年，2月20日，星期三通過分析比較細(xì)胞生長與酶產(chǎn)生的關(guān)系,可以把酶生物合成的模式分為4種類型：同步合成型延續(xù)合成型中期合成型滯后合成型第64頁，共129頁，2023年，2月20日，星期三1、同步合成型

同步合成型：酶的生物合成與細(xì)胞生長同步進(jìn)行的一種酶生物合成模式。該類型酶的生物合成速度與細(xì)胞生長速度緊密聯(lián)系，又稱為生長偶聯(lián)型。屬于該合成型的酶，其生物合成伴隨著細(xì)胞的生長而開始；在細(xì)胞進(jìn)入旺盛生長期時，酶大量生成；當(dāng)細(xì)胞生長進(jìn)入平衡期后，酶的合成隨著停止。第65頁，共129頁，2023年，2月20日，星期三細(xì)胞濃度mg/ml酶濃度U/ml總細(xì)胞濃度活細(xì)胞濃度胞外酶濃度胞內(nèi)酶濃度第66頁，共129頁，2023年，2月20日，星期三大部分組成酶的生物合成屬于同步合成型，有部分誘導(dǎo)酶也按照此種模式進(jìn)行生物合成。例如米曲霉在含有單寧或者沒食子酸的培養(yǎng)基中生長，在單寧或沒食子酸的誘導(dǎo)作用下，合成單寧酶。同步合成酶生物合成調(diào)節(jié)的特點：酶的生物合成可以誘導(dǎo)，但是不受分解代謝物的阻遏作用和產(chǎn)物的反饋阻遏作用。該類型酶對應(yīng)的mRNA很不穩(wěn)定，其壽命一般只有幾十分鐘，在細(xì)胞進(jìn)入生長平衡期后，新的ｍRNA不再生成,在原有的mRNA很快被降解后，酶的生物合成隨即停止。第67頁，共129頁，2023年，2月20日，星期三2、延續(xù)合成型酶的生物合成在細(xì)胞的生長階段開始，在細(xì)胞生長進(jìn)入平衡期后，酶還可以延續(xù)合成一段較長時間。屬于該類型的酶可以是組成酶，也可以是誘導(dǎo)酶。例如：在黑曲霉在以半乳糖醛酸或果膠為單一碳源的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，可以誘導(dǎo)聚半乳糖醛酸酶的生物合成。

第68頁，共129頁，2023年，2月20日，星期三細(xì)胞濃度mg/ml酶濃度U/ml細(xì)胞濃度mg/ml酶濃度U/ml以半乳糖醛酸為誘導(dǎo)物以含有葡萄糖的果膠為誘導(dǎo)物第69頁，共129頁，2023年，2月20日，星期三該類酶在細(xì)胞生長達(dá)到平衡期以后，新的mRNA不再生成，但仍可以延續(xù)合成，說明這些酶所對應(yīng)的mRNA相當(dāng)穩(wěn)定，在平衡器以后相當(dāng)長的一段時間內(nèi)仍然可以通過翻譯合成其所對應(yīng)的酶。當(dāng)延續(xù)合成型酶的生物合成可以受到分解代謝物阻遏時，在培養(yǎng)基中若沒有阻遏物，則呈現(xiàn)延續(xù)合成型，而在培養(yǎng)基中存在阻遏物時，便成為滯后合成型。第70頁，共129頁，2023年，2月20日，星期三3、中期合成型

中期合成型是同步合成類型中的一種特殊形式。合成特點：該類型的酶在細(xì)胞生長一段時間以后才開始，而在細(xì)胞生長進(jìn)入平衡期以后，酶的生物合成也隨著停止。代謝調(diào)節(jié)特點：酶的生物合成受到產(chǎn)物的反饋阻遏作用或分解代謝物阻遏作用。第71頁，共129頁，2023年，2月20日，星期三

枯草桿菌堿性磷酸酶的生物合成模式屬于中期合成型。這是由于該酶的合成受到其反應(yīng)產(chǎn)物無機(jī)磷酸的反饋阻遏，而磷又是細(xì)胞生長所必不可缺的營養(yǎng)物質(zhì)，培養(yǎng)基中必須有磷的存在。這樣，在細(xì)胞生長的開始階段,培養(yǎng)基中的磷阻遏堿性磷酸酶的合成，只有當(dāng)細(xì)胞生長一段時間，培養(yǎng)基中的磷幾乎被細(xì)胞用完（低于0.01mmol/L）以后，該酶才開始大量生成。又由于堿性磷酸酶所對應(yīng)的mRNA不穩(wěn)定，其壽命只有30min左右，所以當(dāng)細(xì)胞進(jìn)入平衡期后，酶的生物合成隨著停止。細(xì)胞濃度mg/ml酶濃度U/ml第72頁，共129頁，2023年，2月20日，星期三4、滯后合成型

此類型酶是在細(xì)胞生長一段時間或者進(jìn)入平衡期以后才開始其生物合成并大量積累。又稱為非生長偶聯(lián)型。許多水解酶的生物合成都屬于這一類型。屬于滯后合成型的酶，之所以要在細(xì)胞生長一段時間甚至進(jìn)入平衡期以后才開始合成，主要原因是由于受到培養(yǎng)基中存在的阻遏物的阻遏作用。只有隨著細(xì)胞的生長，阻遏物幾乎被細(xì)胞用完而使阻遏解除后，酶才開始大量合成。若培養(yǎng)基中不存在阻遏物，該酶的合成可以轉(zhuǎn)為延續(xù)合成型。第73頁，共129頁，2023年，2月20日，星期三細(xì)胞濃度mg/ml酶濃度U/ml在酶的發(fā)酵生產(chǎn)中，為了提高產(chǎn)酶率和縮短發(fā)酵周期，最理想的合成模式應(yīng)是延續(xù)合成型。因為屬于延續(xù)合成型的酶，在發(fā)酵過程中沒有生長期和產(chǎn)酶期的明顯差別。細(xì)胞一開始生長就有酶產(chǎn)生，直至細(xì)胞生長進(jìn)入平衡期以后，酶還可以繼續(xù)合成一段較長的時間。第74頁，共129頁，2023年，2月20日，星期三該類型酶所對應(yīng)的mRNA穩(wěn)定性很好，可以在細(xì)胞生長進(jìn)入平衡期后的相當(dāng)長的一段時間內(nèi)，繼續(xù)進(jìn)行酶的生物合成。第75頁，共129頁，2023年，2月20日，星期三酶所對應(yīng)的mRNA的穩(wěn)定性以及培養(yǎng)基中阻遏物的存在是影響酶生物合成模式的主要因素。其中，mRNA穩(wěn)定性好的，可以在細(xì)胞生長進(jìn)入平衡期以后，繼續(xù)合成其所對應(yīng)的酶；mRNA穩(wěn)定性差的，就隨著細(xì)胞生長進(jìn)入平衡期而停止酶的生物合成；不受培養(yǎng)基中存在的某些物質(zhì)阻遏的，可以伴隨著細(xì)胞生長而開始酶的合成；受到培養(yǎng)基中某些物質(zhì)阻遏的，則要在細(xì)胞生長一段時間甚至在平衡期后，酶才開始合成并大量積累。第76頁，共129頁，2023年，2月20日，星期三對于其他合成模式的酶，可通過下列措施來改變其合成模型，使其接近延續(xù)合成型：菌種選育工藝參數(shù)的優(yōu)化控制發(fā)酵代謝調(diào)節(jié)第77頁，共129頁，2023年，2月20日，星期三其中對于同步合成型的酶，要盡量提高其對應(yīng)的mRNA的穩(wěn)定性，為此適當(dāng)降低發(fā)酵溫度是可取的措施；對于滯后合成型的酶，要設(shè)法降低培養(yǎng)基中阻遏物的濃度，盡量減少甚至解除產(chǎn)物阻遏或分解代謝物阻遏作用，使酶的生物合成提早開始；而對于中期合成型的酶，則要在提高mRNA的穩(wěn)定性以及解除阻遏兩方面下功夫，使其生物合成的開始時間提前，并盡量延遲其生物合成停止的時間。第78頁，共129頁，2023年，2月20日，星期三二、酶生產(chǎn)過程中細(xì)胞生長動力學(xué)細(xì)胞生長動力學(xué)主要研究細(xì)胞生長速度以及外界環(huán)境因素對細(xì)胞生長速度影響的規(guī)律。1950年，法國的莫諾德(Monod)首先提出了表述微生物細(xì)胞生長的動力學(xué)方程：rx=rx為細(xì)胞生長速率，X為細(xì)胞濃度，μ為生長速率假設(shè)培養(yǎng)基中只有一種限制性基質(zhì)，而不存在其他生長限制因素時，μ為這種限制性基質(zhì)濃度的函數(shù)。μm是指限制性底物濃度過量時的比生長速率，即當(dāng)S＞＞Ks時，μ=

μm；KS

為莫諾德常數(shù)，是指比生長速率達(dá)到最大比生長速率一半時的限制性基質(zhì)濃度。第79頁，共129頁，2023年，2月20日，星期三對于游離細(xì)胞連續(xù)全混流生物培養(yǎng)的生長動力學(xué)方程為：

D為稀釋倍數(shù)，指單位時間內(nèi)劉家的培養(yǎng)液與發(fā)酵容器中培養(yǎng)液體積之比，一般以h-1，稀釋D的大小在0與μm之間。第80頁，共129頁，2023年，2月20日，星期三當(dāng)稀釋率小于比生長速率，即D<μ時，細(xì)胞生長速率為正值，表明發(fā)酵罐中細(xì)胞濃度不斷增加，隨著細(xì)胞濃度增加，限制性基質(zhì)的濃度相對降低，從而使細(xì)胞生長速率μ減少，在比生長速率降低到與稀釋率相等的時候，重新達(dá)到穩(wěn)態(tài)。當(dāng)稀釋率等于比生長速率，即D=μ，細(xì)胞生長速率為0，即在一定體積的培養(yǎng)液中，單位時間內(nèi)流出的細(xì)胞與新增值的細(xì)胞數(shù)相同，培養(yǎng)液中細(xì)胞濃度保持恒定不變，此時的培養(yǎng)達(dá)到穩(wěn)態(tài)。第81頁，共129頁，2023年，2月20日，星期三③當(dāng)稀釋率等于比生長速率，即D>μ，細(xì)胞生長速率為負(fù)值，在一定體積的培養(yǎng)液中的濃度不斷被稀釋而逐漸降低，隨著細(xì)胞濃度降低，限制性基質(zhì)的相對濃度相對升高，使比生長速率μ增大，在比生長速率升到與稀釋率相同時，重新建立新的平衡，達(dá)到穩(wěn)態(tài)。④而當(dāng)稀釋率大于最大比生長速率，及D>μm，細(xì)胞濃度趨向于0，無法建立穩(wěn)態(tài)。第82頁，共129頁，2023年，2月20日，星期三三、產(chǎn)酶動力學(xué)產(chǎn)酶動力學(xué)主要研究細(xì)胞產(chǎn)酶速率以及各種環(huán)境因素對產(chǎn)酶速率的影響規(guī)律。產(chǎn)酶動力學(xué)的研究可以從整個發(fā)酵系統(tǒng)著眼，研究群體細(xì)胞的產(chǎn)酶速率及其影響因素，這稱為宏觀產(chǎn)酶動力學(xué)或這稱為非結(jié)構(gòu)動力學(xué)。也可以從細(xì)胞內(nèi)部著眼，研究細(xì)胞中酶合成速率及其影響因素，這謂之微觀產(chǎn)酶動力學(xué)或稱為結(jié)構(gòu)動力學(xué)。第83頁，共129頁，2023年，2月20日，星期三宏觀產(chǎn)酶動力學(xué)的研究表明，產(chǎn)酶速率與細(xì)胞比生長速率、細(xì)胞濃度及細(xì)胞產(chǎn)酶模式有關(guān)。產(chǎn)酶動力學(xué)模型或產(chǎn)酶動力學(xué)方程可以表示為：α是與生長偶聯(lián)的比產(chǎn)酶系數(shù)，以每克干細(xì)胞產(chǎn)酶的單位數(shù)表示，U/g；β為非生長偶聯(lián)的產(chǎn)酶速率，以小時每克干細(xì)胞產(chǎn)酶的單位數(shù)來表示，U/（h.g)；E為酶濃度，以每升發(fā)酵液中所含的酶單位數(shù)表示，U/L；t為時間，h第84頁，共129頁，2023年，2月20日，星期三對于同步生長型，其產(chǎn)酶速率與生長直接相關(guān)，其非生長偶聯(lián)的比產(chǎn)酶速率β=0，產(chǎn)酶動力學(xué)方程為：生產(chǎn)上可通過獲得高的比生長速率來提高產(chǎn)物合成速度。第85頁，共129頁，2023年，2月20日，星期三中期合成期的酶，其合成模式是一種特殊的生長偶聯(lián)型，當(dāng)培養(yǎng)液中有阻遏物存在時，生長偶聯(lián)的比產(chǎn)酶系數(shù)α=0，即無酶產(chǎn)生，在細(xì)胞生長，阻遏物被細(xì)胞利用完后阻遏作用解除，酶才開始合成，此階段，產(chǎn)酶動力學(xué)方程與同步合成型相同。細(xì)胞濃度mg/ml酶濃度U/ml第86頁，共129頁，2023年，2月20日，星期三滯后合成型為非生長偶聯(lián)型，生長偶聯(lián)的比產(chǎn)酶系數(shù)α=0，產(chǎn)酶動力學(xué)方程為：對于這類非生長偶聯(lián)型產(chǎn)酶來說，應(yīng)當(dāng)充分注意菌體在生長期和產(chǎn)酶期的營養(yǎng)要求的差別，可適當(dāng)配用快速利用和緩慢利用的營養(yǎng)物的比例，分別滿足不同時期菌體細(xì)胞的需要。第87頁，共129頁，2023年，2月20日，星期三延續(xù)合成型酶，在生長期和平衡期都可以產(chǎn)酶，其產(chǎn)酶動力學(xué)方程為：第88頁，共129頁，2023年，2月20日，星期三四、固定化細(xì)胞生長和產(chǎn)酶動力學(xué)1、固定化細(xì)胞生長動力學(xué)

在適宜的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件下培養(yǎng)，固定在載體上的細(xì)胞能以一定的速度生長。隨著細(xì)胞的生長和繁殖，有一些細(xì)胞脫落到培養(yǎng)液中，而成為游離細(xì)胞，它們也在培養(yǎng)液中生長。固定化細(xì)胞的培養(yǎng)系統(tǒng)中，包括兩部分細(xì)胞：固定在載體上的細(xì)胞、游離細(xì)胞。第89頁，共129頁，2023年，2月20日，星期三第90頁，共129頁，2023年，2月20日，星期三細(xì)胞生長速率與細(xì)胞濃度（X）和比生長速率（μ）成正比，即：根據(jù)莫諾德方程，，固定化細(xì)胞生長動力學(xué)方程可以表示為：μmg、μmf分別代表固定在載體上的細(xì)胞和游離細(xì)胞的最大生長速率Kmg、Kmf分別代表固定在載體上的細(xì)胞和游離細(xì)胞的莫諾德常數(shù)。第91頁，共129頁，2023年，2月20日，星期三2、固定化細(xì)胞產(chǎn)酶動力學(xué)固定化細(xì)胞產(chǎn)酶速率由固定化細(xì)胞產(chǎn)酶速率和游離細(xì)胞產(chǎn)酶速率組成，即：延續(xù)合成型固定化細(xì)胞產(chǎn)酶動力學(xué)方程：

αμ+β為游離細(xì)胞比產(chǎn)酶速率；γ為固定在載體上細(xì)胞的產(chǎn)酶速率第92頁，共129頁，2023年，2月20日，星期三同步合成型固定化細(xì)胞產(chǎn)酶動力學(xué)方程為：中期合成型固定化細(xì)胞產(chǎn)酶動力學(xué)方程為：當(dāng)有阻遏物時，dE/dt=0當(dāng)培養(yǎng)基中阻遏物被消耗完后，第93頁，共129頁，2023年，2月20日，星期三滯后合成型固定化細(xì)胞產(chǎn)酶動力學(xué)方程：第94頁，共129頁，2023年，2月20日，星期三3、固定化細(xì)胞連續(xù)產(chǎn)酶動力學(xué)第95頁，共129頁，2023年，2月20日，星期三第五節(jié)動植物細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)酶

細(xì)胞種類植物細(xì)胞微生物細(xì)胞動物細(xì)胞細(xì)胞大小/um20-3001-1010-100倍增時間/h>120.3-6>15營養(yǎng)要求復(fù)雜簡單復(fù)雜光照要求大多數(shù)要光照不要求不要求對剪切力敏感大多數(shù)不敏感敏感主要產(chǎn)物色素、藥物、香精、酶等醇、有機(jī)酸、氨基酸、抗生素、核苷酸、酶疫苗、激素、抗體、酶第96頁，共129頁，2023年，2月20日，星期三從表中可見其差異，主要有幾點：動植物細(xì)胞比微生物細(xì)胞大得多。動植物細(xì)胞對剪切力敏感，其中動物細(xì)胞沒有細(xì)胞壁，更為敏感。動植物細(xì)胞生長速率與代謝速率低、生長倍增時間和發(fā)酵周期均長。動物細(xì)胞營養(yǎng)要求比微生物細(xì)胞和植物細(xì)胞復(fù)雜，往往要求有血清或其他代用品。生產(chǎn)的主要產(chǎn)物各不相同。第97頁，共129頁，2023年，2月20日，星期三動植物細(xì)胞培養(yǎng)有其缺點：動植物細(xì)對剪切力敏感，要求特殊生物反應(yīng)器和培養(yǎng)方法。動植物細(xì)胞對防止雜菌污染的技術(shù)要求高；動物細(xì)胞營養(yǎng)要求苛刻。第98頁，共129頁，2023年，2月20日，星期三二、動物細(xì)胞的培養(yǎng)產(chǎn)酶1、植物細(xì)胞培養(yǎng)的特點從天然植物中提取的方式的缺點：天然植物的產(chǎn)量低許多野生植物趨于瀕?；驕缃^引種馴化困難受自然環(huán)境和耕地的影響，栽培中產(chǎn)量和質(zhì)量難以控制第99頁，共129頁，2023年，2月20日，星期三植物細(xì)胞培養(yǎng)的優(yōu)點：產(chǎn)率高產(chǎn)品質(zhì)量高生產(chǎn)周期短可實現(xiàn)自動化可以進(jìn)行特定的生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)和探索新的合成路徑，以獲得新的有用物質(zhì)第100頁，共129頁，2023年，2月20日，星期三植物細(xì)胞培養(yǎng)的特性：細(xì)胞個大，抗剪切力低生長速度慢，為防止培養(yǎng)過程中染菌，需加抗生素細(xì)胞易聚集成團(tuán)產(chǎn)物在細(xì)胞內(nèi)且產(chǎn)量低細(xì)胞培養(yǎng)需氧，而培養(yǎng)液黏度大，且不能強(qiáng)力通風(fēng)攪拌第101頁，共129頁，2023年，2月20日，星期三產(chǎn)酶植物細(xì)胞酶種類胡蘿卜細(xì)胞糖苷酶紫苜蓿細(xì)胞β-半乳糖苷酶假挪威槭細(xì)胞漆酶甜菜細(xì)胞、大豆細(xì)胞過氧化物酶利馬豆細(xì)胞β-葡萄糖苷酶甜菜細(xì)胞酸性轉(zhuǎn)化酶甜菜細(xì)胞堿性轉(zhuǎn)化酶甜菜細(xì)胞糖化酶花生細(xì)胞、大豆細(xì)胞苯丙氨酸裂合酶番木瓜細(xì)胞木瓜蛋白酶大蒜細(xì)胞超氧化物歧化酶菠蘿細(xì)胞菠蘿蛋白酶劍麻細(xì)胞劍麻蛋白酶番木瓜細(xì)胞木瓜凝乳蛋白酶第102頁，共129頁，2023年，2月20日，星期三第103頁，共129頁，2023年，2月20日，星期三第104頁，共129頁，2023年，2月20日，星期三第105頁，共129頁，2023年，2月20日，星期三2、植物細(xì)胞培養(yǎng)的工藝過程細(xì)胞培養(yǎng)的一般工藝：材料的選擇和消毒細(xì)胞的獲得細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)物分離純化產(chǎn)品第106頁，共129頁，2023年，2月20日，星期三（1）材料的選擇與消毒無病蟲害，生長力旺盛，生長有規(guī)則的植株，從產(chǎn)生次級代謝物的組織部位中切取部分組織。取0.5-1cm的片段或小塊消毒、漂洗。消毒劑：70-75%酒精、5%次氯酸鈉、10%的漂白粉、0.1%升汞等。第107頁，共129頁，2023年，2月20日，星期三（2）植物細(xì)胞的獲取

①直接分離法：機(jī)械法：將外植體材料輕輕搗碎或用勻漿器破碎，然后用紗布或金屬濾網(wǎng)過濾，并離心分離細(xì)胞。酶解法：用果膠酶、纖維素酶等處理外殖體后分離有代謝活性的細(xì)胞。（須用甘露醇等進(jìn)行滲透壓保護(hù)）第108頁，共129頁，2023年，2月20日，星期三②愈傷組織誘導(dǎo)法愈傷組織能迅速增殖的無特定結(jié)構(gòu)和功能的簿壁細(xì)胞團(tuán)。可由外殖體培養(yǎng)1-3周而形成。過程：含一定量的生長素和分裂素的液體培養(yǎng)基中加入0.7—0.8的瓊脂，制成半固體誘導(dǎo)培養(yǎng)基、滅菌、外植體植入、25C培養(yǎng)、長出愈傷組織后分散繼代培養(yǎng)。分散細(xì)胞可用小細(xì)胞團(tuán)移入液體培養(yǎng)液中，加玻璃珠，振蕩培養(yǎng)，然后用適當(dāng)孔徑的不誘鋼篩網(wǎng)過濾。第109頁，共129頁，2023年，2月20日，星期三③原生質(zhì)體再生法：原生質(zhì)體可用植物單細(xì)胞、愈傷組織和植物的組織器官制備。常用的有纖維素酶和果膠酶的混合物。滲透壓穩(wěn)定劑：甘露醇、蔗糖、葡萄糖、鹽類、山梨醇原生質(zhì)體分離后，在一定條件下培養(yǎng)，再生細(xì)胞壁成單細(xì)胞懸浮液。單細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞團(tuán)細(xì)胞系第110頁，共129頁，2023年，2月20日，星期三第111頁，共129頁，2023年，2月20日，星期三第112頁，共129頁，2023年，2月20日，星期三（3）植物細(xì)胞懸浮培養(yǎng)懸浮培養(yǎng)的優(yōu)點：能提供大量均勻的細(xì)胞團(tuán)細(xì)胞增殖的速度比愈傷組織快，適合大規(guī)模培養(yǎng)培養(yǎng)方式：分批培養(yǎng)法半連續(xù)培養(yǎng)