基因表達譜研究技術發(fā)展與其在農業(yè)科學中應用第一頁，共48頁。目錄1mRNA差異顯示技術2抑制消減雜交技術3cDNA-AFLP技術4基因表達系列分析技術5微陣列技術第二頁，共48頁。1mRNA差異顯示技術

一、概述：mRNA差異顯示技術

二、DDRT-PCR的發(fā)明及其基礎

三、mRNA差異顯示技術的原理

四、DDRT-PCR目前的應用領域五、DDRT-PCR一般操作步驟

六、DDRT-PCR的優(yōu)點及缺點第三頁，共48頁。一、mRNA差異顯示技術的概述mRNA差異顯示技術(mRNAdifferentialdisplayPCR,mRNADD-PCR)是由PengLiang等人在1992年建立的篩選基因差異表達的有效方法。它是將mRNA逆轉錄技術和PCR技術相結合的一種RNA指紋圖譜技術。每一種組織細胞(包括同一組織細胞經(jīng)過不同的處理)都有其特異表達的不同于其他組織細胞的基因譜，即特異的RNA指紋圖譜。第四頁，共48頁。二.DDRT-PCR的發(fā)明及其基礎由Liang于1992年創(chuàng)立是分離差異表達基因強有力的工具在隨后幾年里，Liang等在技術方面做了大量改進，使技術更適用、更簡便基于RT-PCR理論，依賴于3種技術1）RT-PCR技術2）以特定引物進行的PCR技術3）DNA電泳技術第五頁，共48頁。三、mRNA差異顯示技術的原理：

mRNA差異顯示技術的主要原理是利用cDNA反轉錄技術,PCR擴增和高分辨率聚丙烯酰胺凝膠電泳技術，來顯示PCR產物的差異。第六頁，共48頁。5’M’N’AAAAAAAAAAAA(A)n3’Poly(A)RNA5’T12MN3’錨定引物逆轉錄5’M’N’AAAAAAAAAAAA(A)n3’3‘MNTTTTTTTTTTTT5’變性5’M’N’AAAAAAAAAAAA(A)n3’3‘MNTTTTTTTTTTTT5’退火5‘T12MN3’錨定引物寡核苷酸隨機引物3‘MNTTTTTTTTTTTT5’延長dNTP、Taq聚合酶3‘MNTTTTTTTTTTTT5’5’M’N’AAAAAAAAAAA3’變性、退火、延伸電泳顯示T12MN(M為A、G、C，N為A、T、G、C)

啟動cDNA第一鏈合成不同長度的PCR產物回收差異條帶，再擴增，克隆測序，同源比對隨機結合到cDNA鏈上第七頁，共48頁。四.DDRT-PCR目前的應用領域基因表達差異基因的鑒定與克隆抗逆性機理的研究探究激素調控機理第八頁，共48頁。五.DDRT-PCR一般操作步驟總RNA的提取與反轉錄RT-PCR聚丙烯酰胺凝膠電泳及差異DNA條帶的回收PCR在擴增及其產物的回收測序和數(shù)據(jù)庫比對分析實時定量PCR第九頁，共48頁。mRNA差異顯示技術簡略流程圖第十頁，共48頁。六.DDRT-PCR的優(yōu)點以RT-PCR和DNA凝膠電泳為基礎靈敏度高，僅需0.2μg的總RNA可以同時比較多個樣品間基因表達的差異可以同時檢測到“上調”及“下調”的基因時間短，實驗過程中可步步驗證比較可進行多基因家族的表達分析第十一頁，共48頁。

七.DDRT-PCR的缺點假陽性高

絕大多數(shù)差異條帶僅含有3’-UTR500bp以內的一短片段的信息，這些區(qū)域的序列結構相對保守，得不到特異的基因對低豐度mRNA檢出率低第十二頁，共48頁。2抑制消減雜交技術一、概述：抑制消減雜交技術二、SSH的發(fā)明及其基礎三、抑制消減雜交技術的原理四、SSH目前的應用領域五、SSH一般操作步驟六、SSH的優(yōu)點及缺點第十三頁，共48頁。一、抑制消減雜交技術的概述

抑制消減雜交技術（suppressionsubtractivehybridization,SSH）技術是由Diatchenko等于1996年以mRNA差異顯示技術為基礎建立的篩選未知差異表達基因的新技術。它主要基于最近出現(xiàn)的抑制PCR，并結合標準化（normalization或equalization）和消減雜交。第十四頁，共48頁。二.SSH的發(fā)明及其基礎由Diatchenko于1996年創(chuàng)立是鑒定、分離組織細胞中選擇性表達基因的技術基于RT-PCR理論，依賴于3種技術1）RT-PCR技術2）以特定引物進行的PCR技術3）酶切技術

第十五頁，共48頁。三、抑制消減雜交技術的原理：

抑制消減雜交技術原理是以抑制性多聚酶鏈反應（PCR）反應為基礎的cDNA消減雜交技術。通過合成兩個不同的接頭,連接于測試cDNA片段的5’末端,達到選擇性擴增差異性表達的cDNA片段,抑制非目的cDNA的擴增的目的。第十六頁，共48頁。四.SSH目前的應用領域主要用于疾病研究及動物發(fā)育中的應用植物基因的分離微生物技術的應用第十七頁，共48頁。五.SSH一般操作步驟由RNA合成cDNARsaI限制性內切酶酶切cDNA末端接頭連接第一、二次消減雜交末端補齊第一、二次PCR擴增富集差異表達基因第十八頁，共48頁。第十九頁，共48頁。六.SSH的優(yōu)點該方法的最大優(yōu)點是降低了假陽性率SSH方法具有高度敏感性降低了起始樣品的使用量具有較高的檢測效率和克隆效率

具有背景低、重復性強等優(yōu)點程序相對簡單，操作簡便易行第二十頁，共48頁。

七.SSH的缺點SSH技術需要較多的起始材料且更多地依賴于PCR技術消減庫中的cDNA經(jīng)過Rsal等限制酶消化后，不再是全長cDNA不能同時對數(shù)個材料之間進行比較,材料之間存在過多的差異及小片段缺失也不能有效被檢測完全無酶切位點的片段或酶切位點較少的基因組無法用SSH技術篩選第二十一頁，共48頁。3cDNA-AFLP技術

一、概述：cDNA-AFLP技術

二、cDNA-AFLP的發(fā)明及其基礎

三、cDNA-AFLP的原理

四、cDNA-AFLP目前的應用領域

五、cDNA-AFLP一般操作步驟

六、cDNA-AFLP的優(yōu)點及缺點第二十二頁，共48頁。一、cDNA-AFLP技術的概述cDNA-AFLP是Vos于1995年從基因組AFLP方法發(fā)展來的一種RNA指紋技術。第二十三頁，共48頁。二.cDNA-AFLP的發(fā)明及其基礎由Vos于1995年創(chuàng)立是用于RNA指紋分析的方法?；赗T-PCR理論，依賴于3種技術1）RT-PCR技術2）AFLP技術3）電泳技術第二十四頁，共48頁。三、cDNA-AFLP的原理：

以純化的mRNA為模板，反轉錄合成cDNA。用識別序列分別為6-bp和4-bp的兩種限制性內切酶酶切雙鏈cDNA，酶切片段與人工接頭連接后，利用與接頭序列互補的引物進行預擴增和選擇性擴增，擴增產物通過聚丙烯酰胺凝膠電泳顯示．第二十五頁，共48頁。四.cDNA-AFLP目前的應用領域主要用于RNA指紋分析等領域鑒定未知基因分離特異表達基因基因表達特征的研究第二十六頁，共48頁。五.cDNA-AFLP一般操作步驟模板的制備和cDNA的合成雙鏈cDNA片段的酶切和人工接頭的連接酶切片段的預擴增和選擇性擴增凝膠電泳分析第二十七頁，共48頁。第二十八頁，共48頁。六.cDNA-AFLP的優(yōu)點及缺點反應條件嚴謹,可靠性高,重復性好不需要預先知道序列信息所需儀器設備簡單優(yōu)點

cDNA-AFLP技術優(yōu)點眾多較為完善，但仍應注意的是內切酶（罕見切割酶，常見切割酶）和實驗數(shù)據(jù)的分析。缺點第二十九頁，共48頁。4基因表達系列分析技術一、概述：SAGE技術二、SAGE的發(fā)明及其基礎三、SAGE的原理四、SAGE目前的應用領域五、SAGE一般操作步驟六、SAGE的優(yōu)點及缺點第三十頁，共48頁。

一、基因表達系列分析技術的概述

基因表達系列分析技術（serialanalysisofgeneexpression,SAGE）是1995年由Veleulescu等建立的一種新的基因表達模式研究技術，它可以在整體水平上對細胞或組織中的大量轉錄本同時進行定量分析，而無論其是否為已知基因。第三十一頁，共48頁。二.SAGE的發(fā)明及其基礎由Veleulescu于1995年創(chuàng)立SAGE是一種快速分析基因表達信息的技術?；赗T-PCR理論，依賴于3種技術1）RT-PCR技術2）DNA測序技術3）酶切技術第三十二頁，共48頁。三、SAGE的原理：

9—10bp短標簽(tag)是從一個轉錄本內分離得到，充分含有識別轉錄本的信息，因為10bp(410)從理論上說已足夠代表任何一個物種的轉錄產物，但其前提是假設生物體內的堿基序列是隨機分布的；連接多個短標簽，就能把多個tag集中到一個克隆中進行測序。第三十三頁，共48頁。四.SAGE目前的應用領域快速分析基因表達信息轉錄圖譜的構建發(fā)現(xiàn)新基因和基因的新功能第三十四頁，共48頁。五.SAGE一般操作步驟生物體特定階段組織或細胞中全部mRNA的制備雙鏈cDNA片段的酶切和人工接頭的連接cDNA的雙鏈的合成

錨定酶酶切cDNA片段與接頭（Linker）的連接標簽酶酶切釋放標簽序列連接形成雙標簽（Ditages）第三十五頁，共48頁。第三十六頁，共48頁。六.SAGE的優(yōu)點及缺點任何具備PCR和手動測序器具的實驗室都能使用這項技術結合自動測序技術能夠在3個小時內完成1000個轉錄物的分析可以使用不同的錨定酶，更具靈活性優(yōu)點缺點

SAGE需要進行大量測序反應，費用昂貴。第三十七頁，共48頁。5微陣列技術一、概述：微陣列技術二、微陣列的發(fā)明及其基礎三、微陣列的原理四、微陣列目前的應用領域五、微陣列一般操作步驟六、微陣列的優(yōu)點及缺點第三十八頁，共48頁。一、微陣列技術的概述

微陣列(Microarray)技術主要是指由成千上萬個DNA樣品或寡核昔酸,密集排列于硅片玻片塑料等固相支持物上,再與模板在嚴格條件下進行雜交,最后由激光共聚焦顯微鏡等設備獲取圖象信息,通過計算機分析處理獲得信息的技術集合。第三十九頁，共48頁。二.微陣列的發(fā)明及其基礎由Fodor等人于1991年首先提出DNA芯片的概念是人類基因組計劃（HumanGeneomeProject，HGP）的逐步實施和分子生物學的迅猛發(fā)展及運用的產物?；诙喾N技術1）Southern雜交技術2）斑點雜交技術3）融微電子學、生命科學、計算機科學和光電化學為一體第四十頁，共48頁。三、微陣列的原理：

微陣列是指在大規(guī)模集成電路所控制的機器人在尼龍膜或硅片固相支持物表面，有規(guī)律地合成成千上萬個代表不同基因的寡核苷酸“探針”。這些“探針”可與用放射標記物如32P或熒光物如熒光素、麗絲胺等標記的目的材料中的DNA或cDNA互補核酸序列相結合，通過放射自顯影或激光共聚焦顯微鏡掃描后，對雜交結果進行計算機軟件處理分析，獲得雜交信號的強度及分布模式圖，以此反映目的材料中有關基因表達強弱的表達譜.第四十一頁，共48頁。四.微陣列目前的應用領域檢測基因表達水平及識別基因序列檢測表達狀況，發(fā)現(xiàn)新基因檢測突變和多態(tài)性進行遺傳作圖DNA序列分析藥物研發(fā)第四十二頁，共48頁。五.微陣列