電鏡技術(shù)及其在中醫(yī)藥技術(shù)中的應(yīng)用第1頁/共33頁第六章第三節(jié)電鏡技術(shù)及其在中醫(yī)研究中的應(yīng)用

第2頁/共33頁作者和所在科室介紹。本節(jié)教材編寫的特點是廣泛收集了有關(guān)電鏡技術(shù)在中醫(yī)藥研究中應(yīng)用的報道，對我國中醫(yī)藥當(dāng)代研究狀況有了比較全面地反映。請仔細閱讀。電鏡技術(shù)（又稱電子顯微術(shù)）是一門技術(shù)性很強的綜合性學(xué)科。就電鏡技術(shù)而言，屬現(xiàn)代物理學(xué)范疇；就組織和細胞的超微結(jié)構(gòu)（含超微病理）而言，屬現(xiàn)代分子細胞生物學(xué)及形態(tài)學(xué)范疇?，F(xiàn)在一般綜合歸屬于醫(yī)用生物物理學(xué)學(xué)科。第3頁/共33頁電子顯微鏡的發(fā)展史MaxKnoll(1897-1969)ErnstRuska(1906-1988)

電子顯微鏡的分辨率可以達到納米級(10-9nm)?？梢杂脕碛^察很多在可見光下看不見的物體,例如病毒。1938年，德國工程師MaxKnoll和ErnstRuska制造出了世界上第一臺透射電子顯微鏡(TEM)。第4頁/共33頁電子顯微鏡下的蚊子CharlesOatley1952年，英國工程師CharlesOatley制造出了第一臺掃描電子顯微鏡(SEM)。第5頁/共33頁一、電子顯微鏡及電子顯微術(shù)概況（一）電子顯微鏡近年來，電鏡的研究和制造有了很大的發(fā)展。一方面，電鏡的分辨率不斷提高，透射電鏡的點分辨率達到了0.2-0.3nm，晶格分辨率已經(jīng)達到0.1nm左右，通過電鏡，人們已經(jīng)能直接觀察到原子像；另一方面，除透射電鏡外，還發(fā)展了多種電鏡，如掃描電鏡、分析電鏡等。第6頁/共33頁1．透射電鏡（TEM）透射電鏡即透射電子顯微鏡（TransmissionElectronMicroscope，簡稱TEM），通常稱作電子顯微鏡或電鏡（EM），是使用最為廣泛的一類電鏡。第7頁/共33頁工作原理：利用電子射線（或稱電子束也稱電子波）穿透樣品，而后經(jīng)多級電子放大后成像于熒光屏。主要優(yōu)點：分辨率高，可用來觀察組織和細胞內(nèi)部的超微結(jié)構(gòu)以及微生物和生物大分子的全貌。第8頁/共33頁根據(jù)加速電壓的大小分為以下3種：（1）一般TEM。最常用的是100KV電鏡。這種電鏡分辨率高（點0.3nm，晶格0.14nm），但穿透本領(lǐng)小，觀察樣品必須很薄，約為30～100nm，如細胞和組織的超薄切片、復(fù)型膜和負染樣品等。相當(dāng)普及。我校有這樣的設(shè)備。（2）高壓TEM。目前常用的是200KV電鏡。這種電鏡對樣品的穿透本領(lǐng)約為100KV電鏡的1.6倍，可以在觀察較厚樣品時獲得很好的分辨本領(lǐng)，從而可以對細胞結(jié)構(gòu)進行三維觀察。（3）超高壓TEM。目前已有500KV、1000KV和3000KV的超高壓TEM。這類電鏡具有穿透本領(lǐng)強、輻射損傷小、可以配備環(huán)境樣品室及進行各種動態(tài)觀察等優(yōu)點，分辨率也已達到或超過100KV電鏡的水平。在超高壓電鏡上附加充氣樣品室，使人們可以觀察活細胞內(nèi)的超微結(jié)構(gòu)動態(tài)變化。第9頁/共33頁2．掃描電鏡（SEM）掃描電鏡即掃描電子顯微鏡（ScanningElectronMicroscope，簡稱SEM）。主要用于觀察樣品的表面形貌、割裂面結(jié)構(gòu)、管腔內(nèi)表面的結(jié)構(gòu)等。第10頁/共33頁掃描電鏡原理第11頁/共33頁工作原理：利用電子射線轟擊樣品表面，引起二次電子等信號的發(fā)射，經(jīng)檢測裝置接收后成像的一類電鏡。主要優(yōu)點：景深長，所獲得的圖像立體感強，可用來觀察生物樣品的各種形貌特征。第12頁/共33頁一些電鏡圖片染色體染色體被精子包圍的卵子骨髓細胞SARSAIDS第13頁/共33頁依據(jù)性能不同主要分為：（1）一般SEM。目前一般掃描電鏡采用熱發(fā)射電子槍，分辨率為6nm左右，若采用六硼化鑭電子槍，分辨率可提高到4～5nm。我校有這樣的設(shè)備。（2）場發(fā)射電子槍SEM。由于場發(fā)射電子槍具有亮度高、能量分散少，陰極源尺寸小等優(yōu)點，這種電鏡的分辨率已達到3nm。場發(fā)射電子槍SEM的另一個優(yōu)點是可以在低加速電壓下進行高分辨率觀察，因此可以直接觀察絕緣體而不發(fā)生充、放電現(xiàn)象。（3）生物用SEM。這種SEM備有冰凍冷熱樣品臺，可把含水生物樣品迅速冷凍并對冰凍樣品進行觀察，可以減少化學(xué)處理引起的人為變化，使觀察樣品更接近于自然狀態(tài)。如要觀察內(nèi)部結(jié)構(gòu)，還可用冷刀把樣品進行切開，加溫使冰升華，并在其上噴鍍一層金屬再進行觀察，所有這些過程都在SEM中不破壞真空的狀態(tài)下進行。第14頁/共33頁3．電子探針電子探針主要用于探測微小區(qū)域的元素成分。其原義僅是一個物理學(xué)名詞，意指聚焦了的電子束。當(dāng)電子束照射樣品表面時，可激發(fā)X射線，X射線光量子的能量及波長與元素的原子序數(shù)有關(guān)，稱為特征X射線。采用晶體分光光譜法測定X射線的波長和強度來分析樣品成分的儀器，稱為X射線分光光譜儀或電子探針；用鋰漂移硅探頭測定X射線能量和強度的儀器稱為X射線能譜儀。第15頁/共33頁掃描隧道顯微鏡及原理第16頁/共33頁掃描隧道顯微鏡圖片硅表面納米算盤由單個原子構(gòu)成的“IBM”第17頁/共33頁4．分析電鏡分析電鏡是利用電子射線轟擊樣品所產(chǎn)生的X射線或俄歇電子對樣品元素進行分析的一類電鏡。其特點是能在觀察超微結(jié)構(gòu)的同時，對樣品中一個極微小的區(qū)域進行化學(xué)分析，從而在超微結(jié)構(gòu)水平上測定各種細胞結(jié)構(gòu)的化學(xué)成分及其變化規(guī)律。（1）分析TEM。在TEM上配備X射線能譜儀后即成為分析TEM，目前很多100KV和200KVTEM都可以裝上X射線檢測附件，進行樣品的元素分析。（2）分析SEM。在SEM上配備X射線能譜儀后，便可兼有電子探針分析樣品化學(xué)成分的功能。（3）掃描俄歇電鏡。把SEM與俄歇電子能量分析儀相結(jié)合，即成為掃描俄歇電鏡，它能對樣品表面進行微區(qū)元素分析，是一種表面微觀分析電鏡。第18頁/共33頁5．掃描透射電鏡SEM中電子射線作用于樣品后，其中一部分電子可透過樣品成為透射電子，將透過樣品的透射電子和散射電子用檢測器接收成像，即成為掃描透射電鏡。這種電鏡一般用場發(fā)射電子槍，兼有TEM、SEM和分析電鏡的特點，能觀察較厚的樣品，分辨本領(lǐng)和成像質(zhì)量都很好，是近年來電鏡技術(shù)的最大改進之一。第19頁/共33頁（二）電子顯微術(shù)電鏡具有很高的分辨本領(lǐng)，能觀察極微小的結(jié)構(gòu)。但是電鏡不能直接觀察天然狀態(tài)下的生物標(biāo)本，必須通過各種技術(shù)將生物標(biāo)本制成特殊的電鏡生物樣品，才能放入電鏡進行觀察，這些電鏡樣品制備技術(shù)稱為電子顯微術(shù)。電子顯微術(shù)：將生物標(biāo)本制成特殊的電鏡觀察用生物樣品的制備技術(shù)。第20頁/共33頁1．與TEM有關(guān)的電子顯微術(shù)（1）超薄切片技術(shù)。超薄切片技術(shù)就是通過固定、脫水、包埋、切片和染色等步驟，將生物標(biāo)本切成薄于0.1μm的超薄切片的樣品制備技術(shù)，用于生物組織的內(nèi)部超微結(jié)構(gòu)研究。第21頁/共33頁上圖超薄切片機局部下圖玻璃刀制作儀第22頁/共33頁（2）負染色技術(shù)。利用電子密度比標(biāo)本高的重金屬鹽（如磷鎢酸鈉、醋酸鈾等）將生物標(biāo)本包圍起來，增強背景散射電子的能力以提高反差，在黑暗的背景下顯示標(biāo)本的形態(tài)結(jié)構(gòu)，稱負染色技術(shù)。這一技術(shù)操作簡便，主要用于顆粒狀標(biāo)本（如細菌、病毒、分離細胞器等）的研究。（3）冷凍蝕刻技術(shù)。在快速冷凍下對生物樣品進行斷裂、蝕刻和復(fù)型，制備生物樣品復(fù)型膜的技術(shù)稱冷凍蝕刻技術(shù)。在電鏡下觀察復(fù)型膜可獲得立體感強的超微結(jié)構(gòu)圖像，主要用于生物膜結(jié)構(gòu)的研究。第23頁/共33頁（4）電鏡細胞化學(xué)技術(shù)。在超微結(jié)構(gòu)水平上，通過電鏡細胞化學(xué)反應(yīng)來研究細胞成分的分布和變化的方法稱電鏡細胞化學(xué)技術(shù)。這一技術(shù)把細胞超微結(jié)構(gòu)與其化學(xué)組成有機地結(jié)合起來，目前主要用于研究細胞內(nèi)各種大分子物質(zhì)和酶的定位等。（5）免疫電鏡技術(shù)。這是一種使抗原在超微結(jié)構(gòu)水平上定位的技術(shù)，應(yīng)用與抗原相應(yīng)的標(biāo)記抗體，在電鏡下觀察標(biāo)記物的位置，從而定位相應(yīng)抗原。這一技術(shù)具有靈敏度高、特異性強的特點。（6）電鏡放射自顯影技術(shù)。這是電鏡技術(shù)與放射自顯影技術(shù)相結(jié)合，觀察放射性物質(zhì)在超微結(jié)構(gòu)水平上的定位和變化，從而了解細胞的各種代謝活動。這一技術(shù)使結(jié)構(gòu)與功能的研究結(jié)合起來，是一種動態(tài)的研究方法。第24頁/共33頁2．與SEM有關(guān)的電子顯微術(shù)（1）SEM常規(guī)制樣技術(shù)。SEM適合于研究生物樣品的表面特征，樣品制備包括樣品觀察面的暴露、固定、干燥和導(dǎo)電等步驟，使表面特征充分暴露而不變形。這一技術(shù)是SEM樣品制備的常規(guī)技術(shù)，主要用于組織、細胞、寄生蟲等表面形貌的研究。下圖為SEM標(biāo)本處理設(shè)備。第25頁/共33頁（2）生物標(biāo)本割裂技術(shù)。將生物標(biāo)本放在特殊包埋劑中經(jīng)冷凍或其他方法固化，然后把固化的標(biāo)本割裂，暴露組織和細胞的內(nèi)部結(jié)構(gòu)，再經(jīng)干燥和導(dǎo)電后在SEM下觀察。這一技術(shù)使SEM能觀察生物標(biāo)本的內(nèi)部結(jié)構(gòu)，目前最常用的是冷凍割裂技術(shù)。（3）鑄型技術(shù)。用鑄型技術(shù)（如甲基丙烯酸酯和ABS等）注入生物體的腔性器官，制成鑄型標(biāo)本，可在SEM下觀察管腔內(nèi)表面的結(jié)構(gòu)。目前最常用的是血管鑄型技術(shù)，用以研究微小血管的分布和形貌。二、電子顯微術(shù)在中醫(yī)藥臨床及動物實驗研究中的應(yīng)用第26頁/共33頁大鼠卵巢間質(zhì)細胞左上青年對照左下老年對照右上二仙湯組右中溫腎組右下瀉火組第27頁/共33頁大鼠睪丸精子細胞左上青年對照左下老年對照右上二仙湯組右中溫腎組右下瀉火組第28頁/共33頁大鼠睪丸精子左上青年對照左下老年對照右上二仙湯組右中溫腎組右下瀉火組第29頁/共33頁（一）在中醫(yī)病因病機研究方面的應(yīng)用觀察的組織：人的舌苔；大鼠的關(guān)節(jié)、肺、大小腸、肝。（二）在中醫(yī)證型研究方面的應(yīng)用涉及的動物：驢及大鼠涉及的證候：脾氣虛證、脾陽虛證、肝氣郁結(jié)、血瘀證、肺氣虛證觀察的組織：肝臟、胃腸粘膜、血小板、紅細胞、白細胞、淋巴細胞、心肌細胞、空腸、橫紋肌、腸系膜微血管、腮腺、氣管、支氣管粘膜第30頁/共33頁（三）在中醫(yī)辨證論治研究方面的應(yīng)用涉及的人或動物：人、大鼠涉及的證候：脾氣虛證、皮膚燒傷腎虛證觀察的組織：心、腸、胸腺、睪丸間質(zhì)細胞、精曲細管生精上皮、腺垂體

（四）在中醫(yī)辨病論治研究方面的應(yīng)用1．在中醫(yī)藥防治腦病研究方面2．在中醫(yī)藥防治心血管疾病研究方面3．在中醫(yī)藥防治糖尿病及其并發(fā)癥研究方面4．在中醫(yī)藥防治肝病研究方面5．在中醫(yī)藥防治膽石癥研究方