蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)測(cè)定與沉淀反應(yīng)第1頁(yè)/共17頁(yè)實(shí)驗(yàn)7蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)測(cè)定和沉淀反應(yīng)第2頁(yè)/共17頁(yè)I.蛋白質(zhì)等電點(diǎn)測(cè)定一、目的：了解蛋白質(zhì)的兩性解離性質(zhì)學(xué)習(xí)測(cè)定蛋白質(zhì)等電點(diǎn)的一種方法第3頁(yè)/共17頁(yè)二、原理：蛋白質(zhì)是兩性電解質(zhì)，在溶液中存在如下平衡：pH=pI

凈電荷=0

pH<pI凈電荷為正pH>pI凈電荷為負(fù)PrCOOHNH3++H++

OH-+H++

OH-PrCOO-NH2PrCOO-NH3+第4頁(yè)/共17頁(yè)

蛋白質(zhì)等電點(diǎn)：當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)顆粒上正負(fù)電荷數(shù)目相等時(shí)溶液的pH值。處于等電點(diǎn)時(shí)的蛋白質(zhì)在電場(chǎng)中不發(fā)生移動(dòng)；處于等電點(diǎn)時(shí)的蛋白質(zhì)溶解度最低。用醋酸與醋酸鈉（醋酸鈉混合在酪蛋白溶液中）配制成各種不同pH值的緩沖液。向緩沖液溶液中加入酪蛋白后，沉淀出現(xiàn)最多的緩沖液的pH值即為酪蛋白的等電點(diǎn)。第5頁(yè)/共17頁(yè)三、器材

1.水浴鍋2.溫度計(jì)3.200毫升錐型瓶4.100毫升容量瓶5.吸管6.試管7.試管架8.乳缽第6頁(yè)/共17頁(yè)四.試劑:1.0.4%酪蛋白醋酸鈉溶液200毫升2.1.00mol/L醋酸溶液100毫升3.0.10mol/L醋酸溶液100毫升4.0.01mol/L醋酸溶液50毫升第7頁(yè)/共17頁(yè)五.操作方法

取4支同樣規(guī)格的試管，按下表順序加入各試劑，然后混勻，靜置10分鐘，觀察現(xiàn)象。試管號(hào)蒸餾水(ml)0.01mol/L醋酸(ml)0.1mol/L醋酸(ml)1.0mol/L醋酸(ml)酪蛋白醋酸鈉溶液(ml)產(chǎn)生混濁否?18.40.6－－128.7－0.3－138.0－1.0－147.4－－1.61最渾濁的一管的pH為酪蛋白的等電點(diǎn)。第8頁(yè)/共17頁(yè)六.等電點(diǎn)測(cè)定實(shí)驗(yàn)結(jié)果

幾號(hào)管最混濁,溶液pH為?由于等電點(diǎn)時(shí)蛋白質(zhì)溶解度最小,所以酪蛋白的等電點(diǎn)為?第9頁(yè)/共17頁(yè)Ⅱ．蛋白質(zhì)的沉淀反應(yīng)一、目的：1．加深對(duì)蛋白質(zhì)膠體溶液穩(wěn)定因素的認(rèn)識(shí)。2．了解沉淀蛋白質(zhì)的幾種方法及其實(shí)用意義。3．了解蛋白質(zhì)變性與沉淀的關(guān)系。第10頁(yè)/共17頁(yè)二、原理：蛋白質(zhì)分子表面的水化層和雙電層是蛋白質(zhì)水溶液穩(wěn)定的兩個(gè)重要因素。用一定的理化因素處理可破壞蛋白質(zhì)顆粒表面的水化膜或中和表面電荷而使蛋白質(zhì)沉淀。蛋白質(zhì)的沉淀反應(yīng)可分為兩類。（1）可逆的沉淀的反應(yīng)：蛋白質(zhì)不變性（2）不可逆沉淀反應(yīng)：蛋白質(zhì)變性第11頁(yè)/共17頁(yè)三、器材及試劑：1.蛋白質(zhì)溶液5%卵清蛋白溶液或雞蛋清的水溶液（新鮮雞蛋清∶水=1∶9）2.pH4.7醋酸-醋酸鈉的緩沖溶液 3.3%硝酸銀溶液4.5%三氯乙酸溶液 5.95%乙醇6.飽和硫酸銨溶液 7.硫酸銨結(jié)晶粉末8.0.1mol·L-1鹽酸溶液 9.0.1mol·L-1氫氧化鈉溶液10.0.05mol·L-1碳酸鈉溶液 11.0.1mol·L-1醋酸溶液12.甲基紅溶液 13.2%氯化鋇溶液第12頁(yè)/共17頁(yè)四、操作步驟

1．蛋白質(zhì)的鹽析無(wú)機(jī)鹽（硫酸銨、硫酸鈉、氯化鈉等）的濃溶液能析出蛋白質(zhì)。鹽的濃度不同，析出的蛋白質(zhì)也不同。如球蛋白可在半飽和硫酸銨溶液中析出，而清蛋白則在飽和硫酸銨溶液中才能析出。由鹽析獲得的蛋白質(zhì)沉淀，當(dāng)降低其鹽類濃度時(shí)，又能再溶解，故蛋白質(zhì)的鹽析作用是可逆過(guò)程。加5%卵清蛋白溶液5ml于試管中，再加等量的飽和硫酸銨溶液，混勻后靜置數(shù)分鐘則析出球蛋白的沉淀。倒出少量混濁沉淀，加少量水，觀察是否溶解，為什么？將管中內(nèi)容物過(guò)濾，向?yàn)V液中添加硫酸銨粉末到不再溶解為止，此時(shí)析出的沉淀為清蛋白。取出部分清蛋白，加少量蒸餾水，觀察沉淀的再溶解。第13頁(yè)/共17頁(yè)2．重金屬離子沉淀蛋白質(zhì)重金屬離子與蛋白質(zhì)結(jié)合成不溶于水的復(fù)合物。取1支試管，加入蛋白質(zhì)溶液2ml，再加3%硝酸銀溶液1~2滴，振蕩試管，有沉淀產(chǎn)生。放置片刻，傾去上清液，向沉淀中加入少量的水，沉淀是否溶解？為什么？3．某些有機(jī)酸沉淀蛋白質(zhì)取1支試管，加入蛋白質(zhì)溶液2ml，再加1ml5%三氯乙酸溶液，振蕩試管，觀察沉淀的生成。放置片刻，傾出上清液，向沉淀中加入少量水，觀察沉淀是否溶解。4．有機(jī)溶劑沉淀蛋白質(zhì)取1支試管，加入2ml蛋白質(zhì)溶液，再加入2ml95%乙醇?；靹?，觀察沉淀的生成。第14頁(yè)/共17頁(yè)5.乙醇引起的變性與沉淀取3支試管，編號(hào)。依下表順序加入試劑

試劑（ml）管號(hào)5%卵清蛋白溶液0.1mol·L-1氫氧化鈉溶液0.1mol·L-1鹽酸溶液95%乙醇pH4.7緩沖溶液123111－1－－－11111－－第15頁(yè)/共17頁(yè)

振搖混勻后，觀察各管有何變化。放置片刻，向各管內(nèi)加水8ml，然后在第2、3號(hào)管中各加一滴甲基紅，再分別用0.1mol·L-1