蛋白質(zhì)組學(xué)專(zhuān)業(yè)講座蛋白質(zhì)組學(xué)專(zhuān)業(yè)講座第1頁(yè)背景基因數(shù)量有限性和基因結(jié)構(gòu)相對(duì)穩(wěn)定性VS生命現(xiàn)象復(fù)雜性和多變性從genomic到proteome蛋白質(zhì)組學(xué)專(zhuān)業(yè)講座第2頁(yè)對(duì)蛋白質(zhì)數(shù)量、結(jié)構(gòu)、性質(zhì)、相互關(guān)系和生物學(xué)功效進(jìn)行全方面深入研究已成為生命科學(xué)研究迫切需要和主要任務(wù)。蛋白質(zhì)組學(xué)專(zhuān)業(yè)講座第3頁(yè)Theeraof‘omics’-basedscienceGenomics（基因組學(xué)）Post-genomicscience（后基因組時(shí)代）Functionalgenomics（功效基因組學(xué)）Transcriptomics（轉(zhuǎn)錄組學(xué)）Proteomics（蛋白質(zhì)組學(xué)）Metabolomics（代謝組學(xué)）Structuralgenomics（結(jié)構(gòu)基因組學(xué)）Aim-3Dstructuresofallproteinfolds!蛋白質(zhì)組學(xué)專(zhuān)業(yè)講座第4頁(yè)

第一節(jié)蛋白質(zhì)組學(xué)概念及發(fā)展進(jìn)展第二節(jié)蛋白質(zhì)組表示模式研究方法第三節(jié)蛋白質(zhì)組功效模式研究方法

主要內(nèi)容蛋白質(zhì)組學(xué)專(zhuān)業(yè)講座第5頁(yè)

第一節(jié)蛋白質(zhì)組學(xué)概念及發(fā)展進(jìn)展

蛋白質(zhì)組學(xué)專(zhuān)業(yè)講座第6頁(yè)蛋白質(zhì)組（proteome）：PROTEins+genOME，意思是Proteinsexpressedbyagenome（基因組表示全部蛋白質(zhì)）。1994年由Williams和Wilkins提出，是一個(gè)動(dòng)態(tài)概念，指是不一樣細(xì)胞在不一樣時(shí)相表示不一樣蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)組和蛋白質(zhì)組學(xué)概念蛋白質(zhì)組學(xué)專(zhuān)業(yè)講座第7頁(yè)對(duì)應(yīng)于基因組全部蛋白質(zhì)組成整體，不是局限于一個(gè)或幾個(gè)蛋白質(zhì)。同一基因組在不一樣細(xì)胞、不一樣組織中表示情況各不相同。在空間和時(shí)間上動(dòng)態(tài)改變著整體。蛋白質(zhì)組：蛋白質(zhì)組學(xué)專(zhuān)業(yè)講座第8頁(yè)蛋白質(zhì)組學(xué)(proteomics)

指應(yīng)用各種技術(shù)伎倆來(lái)研究蛋白質(zhì)組一門(mén)新興科學(xué)，其目標(biāo)是從整體角度分析細(xì)胞內(nèi)動(dòng)態(tài)改變蛋白質(zhì)組成成份、表示水平與修飾狀態(tài)，了解蛋白質(zhì)之間相互作用與聯(lián)絡(luò)，揭示蛋白質(zhì)功效與細(xì)胞生命活動(dòng)規(guī)律。

蛋白質(zhì)組學(xué)專(zhuān)業(yè)講座第9頁(yè)主要研究?jī)?nèi)容

了解某種特定細(xì)胞、組織或器官制造蛋白質(zhì)種類(lèi)；

明確各種蛋白質(zhì)分子是怎樣形成類(lèi)似于電路網(wǎng)絡(luò)；

描繪蛋白質(zhì)準(zhǔn)確三維結(jié)構(gòu)，揭示其結(jié)構(gòu)上關(guān)鍵部位，如與藥品結(jié)合而且決定其活性部位。

蛋白質(zhì)組學(xué)專(zhuān)業(yè)講座第10頁(yè)表示蛋白組學(xué)ThestudyofglobalchangesinproteinexpressionProteomics蛋白質(zhì)組功效模式

Thesystematicstudyofprotein-proteininteractionsthroughtheisolationofproteincomplexes蛋白質(zhì)組研究包含兩個(gè)方面：蛋白質(zhì)組學(xué)專(zhuān)業(yè)講座第11頁(yè)蛋白質(zhì)組學(xué)專(zhuān)業(yè)講座第12頁(yè)

基因組轉(zhuǎn)錄組蛋白組ThestudyofproteinsexpressedbygenomesCompletionofthesequencingofthe1stdraftofhumangenomeindicatesthereareapproximately250,000proteinsinthehumangenomeOnly2-5%ofproteinsinhumangenomehavebeenidentified蛋白質(zhì)組學(xué)專(zhuān)業(yè)講座第13頁(yè)蛋白質(zhì)組學(xué)專(zhuān)業(yè)講座第14頁(yè)功效蛋白質(zhì)組學(xué)

(functionalproteomics)提出

功效蛋白質(zhì)組：細(xì)胞在一定階段或與某一生理現(xiàn)象相關(guān)全部蛋白質(zhì)。介于對(duì)個(gè)別蛋白質(zhì)傳統(tǒng)蛋白質(zhì)化學(xué)研究和以全部蛋白質(zhì)為研究對(duì)象蛋白質(zhì)組學(xué)之間。

蛋白質(zhì)組學(xué)專(zhuān)業(yè)講座第15頁(yè)從局部入手研究蛋白質(zhì)組各個(gè)功效亞群體。將多個(gè)亞群體組合起來(lái)，逐步描繪出靠近于生命細(xì)胞“全部蛋白質(zhì)”蛋白質(zhì)組圖譜。蛋白質(zhì)組學(xué)專(zhuān)業(yè)講座第16頁(yè)發(fā)展進(jìn)展各國(guó)政府支持，國(guó)際著名研究和商業(yè)機(jī)構(gòu)加盟：1996年澳大利亞建立了世界上第一個(gè)蛋白質(zhì)組研究中心（AustraliaProteomeAnalysisFacility，APAF）

蛋白質(zhì)組學(xué)專(zhuān)業(yè)講座第17頁(yè)美國(guó)國(guó)立癌癥研究院（NCI）投資1000萬(wàn)美元建立肺、直腸、乳腺、卵巢腫瘤蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)庫(kù)。NCI和FDA共同投資數(shù)百萬(wàn)美元建立癌癥不一樣階段蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)庫(kù)。英國(guó)建立三個(gè)蛋白質(zhì)組研究中心對(duì)已完成或即將完成全基因組測(cè)序生物體進(jìn)行蛋白質(zhì)組研究。蛋白質(zhì)組學(xué)專(zhuān)業(yè)講座第18頁(yè)

Celera企業(yè)投資上億美元獨(dú)自開(kāi)啟了全方面判定和分類(lèi)匯總?cè)祟?lèi)組織、細(xì)胞和體液中蛋白質(zhì)及其異構(gòu)體，構(gòu)建新一代蛋白質(zhì)表示數(shù)據(jù)庫(kù)工作。蛋白質(zhì)組學(xué)專(zhuān)業(yè)講座第19頁(yè)

1997年召開(kāi)了第一次國(guó)際“蛋白質(zhì)組學(xué)”會(huì)議

1998年在美國(guó)舊金山召開(kāi)了第二屆國(guó)際蛋白質(zhì)組學(xué)會(huì)議

1999年1月在英國(guó)倫敦舉行了應(yīng)用蛋白質(zhì)組會(huì)議蛋白質(zhì)組學(xué)專(zhuān)業(yè)講座第20頁(yè)

我國(guó)也于1998年開(kāi)啟了蛋白質(zhì)組學(xué)研究，在中科院上海生物化學(xué)研究所舉行了兩次全國(guó)性蛋白質(zhì)組學(xué)研討會(huì)

蛋白質(zhì)組學(xué)專(zhuān)業(yè)講座第21頁(yè)

成立了中國(guó)人類(lèi)蛋白質(zhì)組組織（CHHUPO），并分別于年9月、年8月以及年8月召開(kāi)了中國(guó)蛋白質(zhì)組學(xué)首屆、第二屆及第三屆學(xué)術(shù)大會(huì)，年10月在中國(guó)北京召開(kāi)了第三屆國(guó)際蛋白質(zhì)組學(xué)會(huì)議。

蛋白質(zhì)組學(xué)專(zhuān)業(yè)講座第22頁(yè)

科技部已將疾病蛋白質(zhì)組研究列入我國(guó)“973”計(jì)劃項(xiàng)目和“863”計(jì)劃項(xiàng)目；國(guó)家自然科學(xué)基金委員會(huì)也將“蛋白質(zhì)組研究”列為重點(diǎn)項(xiàng)目。我國(guó)在鼻咽癌、白血病、肝癌和肺癌蛋白質(zhì)組研究方面取得了較大進(jìn)展。蛋白質(zhì)組學(xué)專(zhuān)業(yè)講座第23頁(yè)第二節(jié)蛋白質(zhì)組表示模式研究方法蛋白質(zhì)組學(xué)專(zhuān)業(yè)講座第24頁(yè)研究蛋白質(zhì)組組成成份、差異和功效主要研究目標(biāo)蛋白質(zhì)組學(xué)專(zhuān)業(yè)講座第25頁(yè)（一）蛋白質(zhì)組研究中樣品制備

通?？刹扇〖?xì)胞或組織中全蛋白質(zhì)組分進(jìn)行蛋白質(zhì)組分析。也能夠進(jìn)行樣品預(yù)分級(jí)，即將細(xì)胞或組織中全體蛋白質(zhì)分成不一樣個(gè)別，分別進(jìn)行研究。蛋白質(zhì)組學(xué)專(zhuān)業(yè)講座第26頁(yè)樣品預(yù)分級(jí)主要方法蛋白質(zhì)溶解性：可溶性蛋白、非溶性蛋白等蛋白質(zhì)定位：膜蛋白、核蛋白等蛋白質(zhì)細(xì)胞器定位：線粒體、高爾基體、葉綠體等

蛋白質(zhì)組學(xué)專(zhuān)業(yè)講座第27頁(yè)

樣品預(yù)分級(jí)主要作用在于提升低豐度蛋白質(zhì)上樣量和檢測(cè)靈敏度。蛋白質(zhì)組學(xué)專(zhuān)業(yè)講座第28頁(yè)組織水平上蛋白質(zhì)組樣品制備

臨床樣本都是各種細(xì)胞或組織混雜，而且狀態(tài)不一，如腫瘤中癌變上皮類(lèi)細(xì)胞總是與血管、基質(zhì)細(xì)胞等混雜。蛋白質(zhì)組學(xué)專(zhuān)業(yè)講座第29頁(yè)激光捕捉顯微切割(lasercapturemicrodissection，LCM)

可直接在顯微鏡下從組織切片中準(zhǔn)確分離特定細(xì)胞或細(xì)胞群。

蛋白質(zhì)組學(xué)專(zhuān)業(yè)講座第30頁(yè)（二）蛋白質(zhì)組研究中樣品分離雙向凝膠電泳two-dimensionalelectrophoresis，2-DE)：利用蛋白質(zhì)等電點(diǎn)和分子量，結(jié)合凝膠化學(xué)特征，分離各種蛋白質(zhì)方法。蛋白質(zhì)組學(xué)專(zhuān)業(yè)講座第31頁(yè)蛋白質(zhì)組學(xué)專(zhuān)業(yè)講座第32頁(yè)蛋白質(zhì)組學(xué)專(zhuān)業(yè)講座第33頁(yè)特點(diǎn)可分離10～100kD分子量蛋白質(zhì)高靈敏度和高分辨率便于計(jì)算機(jī)進(jìn)行圖像分析處理與質(zhì)譜分析匹配蛋白質(zhì)組學(xué)專(zhuān)業(yè)講座第34頁(yè)2-DE技術(shù)缺點(diǎn)

極酸、極堿性蛋白質(zhì)，疏水性蛋白質(zhì)，極大蛋白質(zhì)、極小蛋白質(zhì)以及低豐度蛋白質(zhì)用此種技術(shù)難于有效分離。

膠內(nèi)酶解過(guò)程費(fèi)時(shí)、費(fèi)勁，難于與質(zhì)譜聯(lián)用實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化。蛋白質(zhì)組學(xué)專(zhuān)業(yè)講座第35頁(yè)新型非凝膠技術(shù)

液相色譜法liquidchromatography，LC毛細(xì)管電泳capillaryelectrophoresis，CE蛋白質(zhì)組學(xué)專(zhuān)業(yè)講座第36頁(yè)

（三）常見(jiàn)蛋白質(zhì)顯色技術(shù)

考馬斯亮藍(lán)染色

蛋白質(zhì)組學(xué)專(zhuān)業(yè)講座第37頁(yè)常見(jiàn)顯色方法比較蛋白質(zhì)組學(xué)專(zhuān)業(yè)講座第38頁(yè)考染和銀染比較蛋白質(zhì)組學(xué)專(zhuān)業(yè)講座第39頁(yè)蛋白質(zhì)組學(xué)專(zhuān)業(yè)講座第40頁(yè)蛋白質(zhì)組學(xué)專(zhuān)業(yè)講座第41頁(yè)有機(jī)染料和銀染考染靈敏度為30~100ng，線性范圍是20倍；銀染線性范圍是40倍，靈敏度是考染100倍。膠體考馬斯亮藍(lán)染色技術(shù)可實(shí)現(xiàn)PAGE無(wú)背景染色，其極限靈敏度為8~10ng，但這種染液會(huì)對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行修飾而影響質(zhì)譜分析結(jié)果。胺基黑常見(jiàn)于轉(zhuǎn)印至聚偏二氟乙烯（PVDF）和/或硝酸纖維素膜上蛋白質(zhì)染色。銀染缺點(diǎn)是：對(duì)一些種類(lèi)蛋白質(zhì)染色效果差，對(duì)其后蛋白質(zhì)測(cè)序和質(zhì)譜分析造成影響。這兩種染色技術(shù)都可降低膠內(nèi)蛋白質(zhì)產(chǎn)量。蛋白質(zhì)組學(xué)專(zhuān)業(yè)講座第42頁(yè)負(fù)染能專(zhuān)門(mén)提升PAGE膠上蛋白質(zhì)回收率，但不能用于膜上染色。結(jié)果表現(xiàn)為膠面著色而蛋白質(zhì)點(diǎn)透明。速度快（5~15min），蛋白質(zhì)生物活性能保持：一旦用絡(luò)合劑如EDTA或Tris/甘氨酸轉(zhuǎn)移緩沖液來(lái)絡(luò)合金屬離子就可進(jìn)行提取來(lái)轉(zhuǎn)移蛋白質(zhì)。它主要適合用于蛋白質(zhì)顯色、完整蛋白質(zhì)膠上被動(dòng)提取以及質(zhì)譜分析。該技術(shù)主要包含金屬鹽染料、鋅－咪唑染料等使用。蛋白質(zhì)組學(xué)專(zhuān)業(yè)講座第43頁(yè)膠體擴(kuò)散染料主要用于高靈敏度檢出電轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素和PVDF膜上蛋白質(zhì)，不用于膠內(nèi)染色。最好膠體金染色靈敏度與PAGE膠內(nèi)銀染類(lèi)似。這種技術(shù)主要包含印度墨水染料、膠體金屬染料等。蛋白質(zhì)組學(xué)專(zhuān)業(yè)講座第44頁(yè)有機(jī)熒光團(tuán)染料包含共價(jià)結(jié)合和非共價(jià)結(jié)合熒光團(tuán)染料兩類(lèi)。后者最為常見(jiàn)，其經(jīng)典代表是已經(jīng)商品化SYPRORed、Orange、Ruby等熒光染料。這三種染料可對(duì)SDS膠內(nèi)蛋白質(zhì)進(jìn)行一步染色，約30~60min完成，靈敏度為2~10ng。染色后凝膠用標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)室300nm紫外透射儀進(jìn)行照像保留，其線性范圍為3個(gè)數(shù)量級(jí)。這三種染料電泳染色結(jié)果與在酵母中經(jīng)過(guò)SAGE所取得基因表示水平動(dòng)態(tài)范圍相匹配。在Tris/甘氨酸轉(zhuǎn)印緩沖液中染色后，蛋白質(zhì)可被轉(zhuǎn)印至膜上并進(jìn)行免疫染色或Edman測(cè)序來(lái)判定蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)組學(xué)專(zhuān)業(yè)講座第45頁(yè)金屬螯合染料這是一類(lèi)與當(dāng)代蛋白質(zhì)組學(xué)研究相兼容、相對(duì)較新蛋白質(zhì)顯色試劑，其設(shè)計(jì)專(zhuān)門(mén)與常見(jiàn)微量化學(xué)表征過(guò)程兼容。它們不包含戊二醛、甲醛或Tween-20等，很輕易和集成化蛋白質(zhì)組學(xué)平臺(tái)（包含自動(dòng)化凝膠染色儀、圖像分析工作站、機(jī)器人剪切儀器、蛋白質(zhì)酶解工作站和質(zhì)譜儀等）相結(jié)合。其中SYPRORuby也是一個(gè)基于釕金屬發(fā)光染料。蛋白質(zhì)組學(xué)專(zhuān)業(yè)講座第46頁(yè)（四）凝膠圖像處理分析和膠內(nèi)酶切凝膠圖像掃描：圖像加工：斑點(diǎn)檢測(cè)和定量：凝膠配比：數(shù)據(jù)分析：數(shù)據(jù)呈遞和解釋?zhuān)?-DE數(shù)據(jù)庫(kù)建立：蛋白質(zhì)組學(xué)專(zhuān)業(yè)講座第47頁(yè)蛋白質(zhì)組學(xué)專(zhuān)業(yè)講座第48頁(yè)當(dāng)前有各種圖像分析軟件可用于膠圖像分析:

MelanieII(BioRad),PDQuest(BioRad),Phoretix2DFull,(AmershamPharmaciaBiotech)ImageMaster2dPlatinum這些軟件能夠完成蛋白質(zhì)點(diǎn)識(shí)別、匹配等，含有很強(qiáng)分析功效，但其缺點(diǎn)是需要很多圖像手工校對(duì)，蛋白質(zhì)組學(xué)專(zhuān)業(yè)講座第49頁(yè)蛋白質(zhì)組學(xué)專(zhuān)業(yè)講座第50頁(yè)蛋白質(zhì)組學(xué)專(zhuān)業(yè)講座第51頁(yè)正常肝細(xì)胞和肝癌細(xì)胞蛋白質(zhì)組雙向電泳差異表示譜園點(diǎn)標(biāo)識(shí)點(diǎn)為二者差異蛋白數(shù)字號(hào)碼為蛋白質(zhì)點(diǎn)在參考膠中索引號(hào)蛋白質(zhì)組學(xué)專(zhuān)業(yè)講座第52頁(yè)蛋白質(zhì)膠內(nèi)酶切

包含感興趣蛋白點(diǎn)挖取、含蛋白質(zhì)凝膠脫色、膠內(nèi)蛋白質(zhì)酶切等過(guò)程蛋白質(zhì)組學(xué)專(zhuān)業(yè)講座第53頁(yè)蛋白質(zhì)組學(xué)專(zhuān)業(yè)講座第54頁(yè)（五）質(zhì)譜分析樣品分子離子化后，依據(jù)不一樣離子間質(zhì)核比（m/z）差異來(lái)分離并確定分子量定性定量質(zhì)譜m/z離子化蛋白質(zhì)組學(xué)專(zhuān)業(yè)講座第55頁(yè)原理質(zhì)譜分析是先將物質(zhì)離子化，按離子質(zhì)荷比分離，然后測(cè)量各種離子譜峰強(qiáng)度而實(shí)現(xiàn)分析目標(biāo)一個(gè)分析方法。蛋白質(zhì)組學(xué)專(zhuān)業(yè)講座第56頁(yè)20世紀(jì)初20世紀(jì)40年代20世紀(jì)60年代20世紀(jì)80年代J.J.Thomson制成第一臺(tái)質(zhì)譜儀主要是用來(lái)進(jìn)行同位素測(cè)定和無(wú)機(jī)元素分析開(kāi)始用于有機(jī)物分析出現(xiàn)了氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀成為有機(jī)物分析主要儀器質(zhì)譜新技術(shù)：電噴霧電離源，大氣壓化學(xué)電離源液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀感應(yīng)耦合等離子體質(zhì)譜儀質(zhì)譜技術(shù)發(fā)展過(guò)程蛋白質(zhì)組學(xué)專(zhuān)業(yè)講座第57頁(yè)SirJosephJohnThomson-1906年諾貝爾物理獎(jiǎng)

主要貢獻(xiàn)：氣態(tài)下離子導(dǎo)電理論和試驗(yàn)探索

FrederickSoddy-1921年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)

主要貢獻(xiàn)：使咱們對(duì)放射活性物質(zhì)認(rèn)識(shí)大大提升，另外他對(duì)同位素起源和性質(zhì)也作了出眾工作。

FrancisWilliamAston-1922年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)

主要貢獻(xiàn)：使用質(zhì)譜方法大規(guī)模研究非放射性元素同位素；提出整數(shù)規(guī)則。

HansG.DehmeltandWolfgangPaul-1989年同獲諾貝爾物理獎(jiǎng)

主要貢獻(xiàn)：開(kāi)發(fā)了離子阱質(zhì)譜技術(shù)。

RobertF.CurlJr.&SirHaroldW.Kroto&RichardE.Smalley-1996年分享諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)

主要貢獻(xiàn)：使用質(zhì)譜發(fā)覺(jué)富洛倫尼斯（C60-C80，足球烯）

JohnFennandKoichiTanakawithKurtWuthrich-年分享諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)

主要貢獻(xiàn)：發(fā)展了可用于分析生物大分子軟電離方法。質(zhì)譜相關(guān)工作成就蛋白質(zhì)組學(xué)專(zhuān)業(yè)講座第58頁(yè)離子源（Ionsource）質(zhì)譜儀離子源種類(lèi)主要有：化學(xué)電離源(ChemicalIonization,CI)快原子轟擊源（FastAtomicbombardment,FAB）

電噴霧源(ElectronsprayIonization，ESI)大氣壓化學(xué)電離源(AtmosphericpressurechemicalIonization,APCI)大氣壓光學(xué)電離源（Atmosphericpressurephotoionization,APPI）基質(zhì)輔助激光解吸電離源（MALDI-TOF）電子電離源(ElectronIonizationEI)

蛋白質(zhì)組學(xué)專(zhuān)業(yè)講座第59頁(yè)每一個(gè)電離方法都有一定分子量檢測(cè)范圍

EI/CIESI/FABAPPIAPCIMW100,00010,000100010010PolarityVeryPolarNonpolar蛋白質(zhì)組學(xué)專(zhuān)業(yè)講座第60頁(yè)電噴霧質(zhì)譜技術(shù)和基質(zhì)輔助激光解吸附質(zhì)譜技術(shù)是誕生于80年代末期兩項(xiàng)軌電離技術(shù)。這兩項(xiàng)技術(shù)出現(xiàn)使傳統(tǒng)主要用于小分子物質(zhì)研究質(zhì)譜技術(shù)發(fā)生了革命性變革。它們含有高靈敏度和高質(zhì)量檢測(cè)范圍，使得在pmol水平上準(zhǔn)確地分析分子量高達(dá)幾萬(wàn)到幾十萬(wàn)生物大分子成為可能，并得到快速發(fā)展。被稱(chēng)做是“軟”電離技術(shù)，因?yàn)椋核麄冊(cè)陔x子化過(guò)程中不會(huì)破壞分子結(jié)構(gòu)，能實(shí)現(xiàn)分子量大于10,000質(zhì)量單位生物大分子質(zhì)量分析蛋白質(zhì)組學(xué)專(zhuān)業(yè)講座第61頁(yè)橫坐標(biāo)為離子質(zhì)核比，縱坐標(biāo)為離子相對(duì)強(qiáng)度或相對(duì)豐度。乙醇以下：質(zhì)譜圖蛋白質(zhì)組學(xué)專(zhuān)業(yè)講座第62頁(yè)（六）蛋白質(zhì)序列測(cè)定主要有兩種方法：數(shù)據(jù)庫(kù)搜索(Sequencedatabasesearch):

從頭算法(Denovointerpretation)蛋白質(zhì)組學(xué)專(zhuān)業(yè)講座第63頁(yè)兩種方法各自特點(diǎn)數(shù)據(jù)庫(kù)搜索算法將試驗(yàn)質(zhì)譜與由數(shù)據(jù)庫(kù)中肽序列得到理論質(zhì)譜相關(guān)聯(lián),得到候選肽序列,它對(duì)質(zhì)譜質(zhì)量要求不高,能夠判定復(fù)雜蛋白質(zhì)樣品,前提是待判定蛋白質(zhì)樣品序列存在于數(shù)據(jù)庫(kù)中.從頭算法利用試驗(yàn)質(zhì)譜中譜峰之間質(zhì)量差直接計(jì)算出肽序列,不需要數(shù)據(jù)庫(kù)輔助,能夠判定數(shù)據(jù)庫(kù)中不存在新序列,不過(guò)它需要相對(duì)高質(zhì)量質(zhì)譜數(shù)據(jù)蛋白質(zhì)組學(xué)專(zhuān)業(yè)講座第64頁(yè)瑞士SWISS-PROT數(shù)據(jù)庫(kù)擁有當(dāng)前世界上最大、種類(lèi)最多蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)庫(kù)是蛋白質(zhì)組研究水平標(biāo)志和基礎(chǔ)蛋白質(zhì)組學(xué)專(zhuān)業(yè)講座第65頁(yè)MascotSearchEngine蛋白質(zhì)組學(xué)專(zhuān)業(yè)講座第66頁(yè)MascotMS/MSIonsSearch蛋白質(zhì)組學(xué)專(zhuān)業(yè)講座第67頁(yè)蛋白質(zhì)組學(xué)專(zhuān)業(yè)講座第68頁(yè)蛋白質(zhì)組學(xué)專(zhuān)業(yè)講座第69頁(yè)蛋白質(zhì)組學(xué)專(zhuān)業(yè)講座第70頁(yè)蛋白質(zhì)組學(xué)專(zhuān)業(yè)講座第71頁(yè)蛋白質(zhì)組學(xué)專(zhuān)業(yè)講座第72頁(yè)蛋白質(zhì)組學(xué)專(zhuān)業(yè)講座第73頁(yè)蛋白質(zhì)組學(xué)專(zhuān)業(yè)講座第74頁(yè)蛋白質(zhì)組學(xué)專(zhuān)業(yè)講座第75頁(yè)蛋白質(zhì)組學(xué)專(zhuān)業(yè)講座第76頁(yè)第三節(jié)蛋白質(zhì)組功效模式研究方法蛋白質(zhì)組學(xué)專(zhuān)業(yè)講座第77頁(yè)揭示蛋白質(zhì)組組員間相互作用、相互協(xié)調(diào)關(guān)系，并深入了解蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功效相互關(guān)系，以及基因結(jié)構(gòu)與蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)功效關(guān)系。

主要研究目標(biāo)

蛋白質(zhì)組學(xué)專(zhuān)業(yè)講座第78頁(yè)（一）蛋白質(zhì)翻譯后修飾研究翻譯后修飾糖基化乙?；谆然蜴I蛋白質(zhì)組學(xué)專(zhuān)業(yè)講座第79頁(yè)（二）蛋白質(zhì)相互作用研究技術(shù)生命基礎(chǔ)過(guò)程是不一樣功效蛋白質(zhì)在時(shí)空上有序和協(xié)同作用新陳代謝以蛋白質(zhì)復(fù)合體或多蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)協(xié)同作用實(shí)現(xiàn)細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及病原體感染和免疫反應(yīng)蛋白質(zhì)組學(xué)專(zhuān)業(yè)講座第80頁(yè)1989年Field和Song等人在酵母細(xì)胞中設(shè)計(jì)分析蛋白質(zhì)相互作用方法。以真核細(xì)胞轉(zhuǎn)錄激活因子結(jié)構(gòu)和活性特點(diǎn)為基礎(chǔ)。1．酵母雙雜交系統(tǒng)（yeasttwo-hybridsystem）

蛋白質(zhì)組學(xué)專(zhuān)業(yè)講座第81頁(yè)

轉(zhuǎn)錄激活因子GAL4特點(diǎn)N端含NLS和與酵母GAL1基因開(kāi)啟子上游激活序列(UASG)結(jié)合結(jié)構(gòu)域C端含GAL1轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域蛋白質(zhì)組學(xué)專(zhuān)業(yè)講座第82頁(yè)功效上相互獨(dú)立又相互依賴，只有經(jīng)過(guò)某種方式結(jié)合在一起才含有完整轉(zhuǎn)錄因子活性蛋白質(zhì)組學(xué)專(zhuān)業(yè)講座第83頁(yè)系統(tǒng)構(gòu)建分別構(gòu)建含GAL4BD和AD兩個(gè)酵母融合蛋白表示載體；建立含特殊基因型、適合用于雙雜交體分析酵母菌株

蛋白質(zhì)組學(xué)專(zhuān)業(yè)講座第84頁(yè)蛋白質(zhì)組學(xué)專(zhuān)業(yè)講座第85頁(yè)酵母雙雜交技術(shù)基礎(chǔ)原理蛋白質(zhì)組學(xué)專(zhuān)業(yè)講座第86頁(yè)主要特點(diǎn)和優(yōu)勢(shì)使蛋白質(zhì)表現(xiàn)型和基因型相聯(lián)絡(luò)篩選cDNA文庫(kù)真實(shí)反應(yīng)體內(nèi)蛋白質(zhì)間相互作用情況不需分離靶蛋白敏感性高蛋白質(zhì)組學(xué)專(zhuān)業(yè)講座第87頁(yè)缺點(diǎn)1.假陽(yáng)性結(jié)果2.假陽(yáng)性結(jié)果3.限于核內(nèi)表示蛋白質(zhì)相互作用

蛋白質(zhì)組學(xué)專(zhuān)業(yè)講座第88頁(yè)

2．基于質(zhì)譜蛋白質(zhì)相互作用研究方法靶蛋白制備

蛋白質(zhì)復(fù)合體純化

蛋白質(zhì)復(fù)合體質(zhì)譜判定基礎(chǔ)步驟：蛋白質(zhì)組學(xué)專(zhuān)業(yè)講座第89頁(yè)（1）親和層析耦聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)

基礎(chǔ)原理：將某種蛋白質(zhì)以共價(jià)鍵固定在基質(zhì)（如瓊脂糖）上，含有與之相互作用蛋白質(zhì)細(xì)胞裂解液過(guò)柱，先用低鹽溶液洗脫下未結(jié)合蛋白質(zhì)，然后用高鹽溶液或SDS溶液洗脫結(jié)合在柱子上蛋白質(zhì)，最終用多維液相色譜耦聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)（MDLC-ESI-MS/MS）判定靶蛋白結(jié)合蛋白。

蛋白質(zhì)組學(xué)專(zhuān)業(yè)講座第90頁(yè)先決條件得到足夠多保持生物活性重組靶蛋白作為誘餌（bait）取得足夠量、純度高與誘餌相互作用蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)組學(xué)專(zhuān)業(yè)講座第91頁(yè)主要優(yōu)點(diǎn)

靈敏度高：高濃度靶蛋白候選蛋白質(zhì)與靶蛋白結(jié)合機(jī)會(huì)均等

檢測(cè)多亞基蛋白質(zhì)之間相互作用

蛋白質(zhì)組學(xué)專(zhuān)業(yè)講座第92頁(yè)（2）免疫共沉淀耦聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)

原理：以細(xì)胞內(nèi)源性靶蛋白為誘餌，用抗靶蛋白抗體與細(xì)胞總蛋白進(jìn)行免疫共沉淀（immuno-precipitation，IP）純化靶蛋白免疫復(fù)合物，凝膠電泳分離后，質(zhì)譜判定靶蛋白結(jié)合蛋白。

蛋白質(zhì)組學(xué)專(zhuān)業(yè)講座第93頁(yè)研究鼻咽癌細(xì)胞系中p53

相互作用蛋白抗p53抗體與HNE1和HNE2總蛋白進(jìn)行免疫共沉淀SDS分離免疫沉淀復(fù)合物切取p53結(jié)合蛋白條帶，酶解后進(jìn)行電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜（LC-ESI-MS/MS）分析，得到對(duì)應(yīng)肽序列標(biāo)簽搜索數(shù)據(jù)庫(kù)蛋白質(zhì)組學(xué)專(zhuān)業(yè)講座第9