細菌內(nèi)毒素工作標準品效價標定方法研究

Summary：根據(jù)《中國藥典》2020年版通則1143細菌內(nèi)毒素檢查法，工作標準品應(yīng)該用法定標準品進行標定。探究了運用凝膠法對細菌內(nèi)毒素工作標準品效價進行標定的檢測方法，使用購于中國食品藥品檢定研究院，效價為9000EU/支細菌內(nèi)毒素國家標準品（CSE）標定標示效價為10EU/支的細菌內(nèi)毒素工作標準品（WSE）。通過試驗，檢驗結(jié)果均符合《中國藥典》現(xiàn)行版的要求。Keys：細菌內(nèi)毒素國家標準品，細菌內(nèi)毒素工作標準品，鱟試劑，凝膠法，效價引言：根據(jù)《中國藥典》先行版收載的細菌內(nèi)毒素檢查法要求，根據(jù)實際使用要求，使用細菌內(nèi)毒素國家標準品來標準定CSE的效價，可以用凝膠法或光度法進行標定，本企業(yè)實際日常檢驗中，使用多個靈敏度的鱟試劑則采用兩個不同靈敏度的鱟試劑標定CSE的效價。若標定的CSE效價Pt，結(jié)果0.5Pe≤Pt≤2Pe（細菌內(nèi)毒素工作標準品標示效價（Pe））。則按照標示效價使用。正文：1.實驗材料1.1儀器設(shè)備儀器設(shè)備名稱型號生產(chǎn)廠家凈化工作臺SW-CJ-1FD蘇州凈化ET-96內(nèi)毒素凝膠法測定儀ET-96天津市天大天發(fā)科技有限公司電熱恒溫干燥箱DL-201BS天津市中環(huán)實驗電爐有限公司ZH-2型自動旋渦混合器ZH-2上海安譜科學儀器有限公司1.2試劑試藥驗證用試劑廠家批號靈敏度（λ）/規(guī)格鱟試劑湛江安度斯生物有限公司21041512

0.03EU/ml鱟試劑湛江安度斯生物有限公司210611120.25EU/ml細菌內(nèi)毒素工作標準品湛江安度斯生物有限公司191010110EU/支細菌內(nèi)毒素國家標準品中國食品藥品檢定研究院150800-2016019000EU/支細菌內(nèi)毒素檢查用水湛江安度斯生物有限公司200804050ml2.實驗準備2.1玻璃器皿的洗滌將檢驗所用玻璃器皿放入潔潔靈水中充分浸泡，然后取出將洗液空干，用自來水將殘留洗液徹底洗凈，再用純化水反復(fù)沖洗三遍以上，晾干后放入適宜的密閉金屬容器中或用錫箔紙包好后再放入金屬容器內(nèi)，放置電熱恒溫干燥箱中。2.2除去玻璃器皿表面可能存在的外源性內(nèi)毒素玻璃器皿置烤箱后將烤箱調(diào)至250℃，待烤箱溫度升至設(shè)定的溫度后開始記時，需干烤至少2小時。達到規(guī)定時間后，關(guān)斷電源。待烤箱溫度自然降至室溫，在不開啟金屬容器的情況下，可以保存24小時，否則需再次滅菌除去可能存在的外源性內(nèi)毒素。2.3細菌內(nèi)毒素國家標準品溶液的制備取細菌內(nèi)毒素國家標準品一支，輕彈瓶壁，使粉末落入瓶底，再用砂輪在瓶頸上部輕輕劃痕,75％酒精棉球擦拭后啟開，防止玻璃屑落入瓶內(nèi)。用移液器（100-1000μL）吸取BET水1ml放入細菌內(nèi)毒素國家標準品瓶中,或按標準品使用說明書用移液器加入規(guī)定量的BET水溶解其內(nèi)容物，用封口膜將瓶口封嚴，置旋渦混合器上混合15分鐘，然后根據(jù)鱟試劑標示靈敏度（λ1為0.25EU/ml標示靈敏度、λ2為0.03U/ml標示靈敏度）），將細菌內(nèi)毒素國家標準品稀釋制備成所需濃度的細菌內(nèi)毒素標準溶液即0.5EU/ml、0.25EU/ml、0.125EU/ml、0.0625EU/ml和0.0625EU/ml、0.03125EU/ml、0.15625EU/ml、0.078125EU/ml。每稀釋一步均應(yīng)在旋渦混合器上混合30秒。只有當細菌內(nèi)毒素國家標準品的2λ平行管均為陽性，0.25λ平行管均為陰性，且陰性對照為陰性時，實驗方有效。2.4待測細菌內(nèi)毒素工作標準品內(nèi)毒素溶液的制備取細菌內(nèi)毒素工作標準品一支，輕彈瓶壁，使粉末落入瓶底，再用砂輪在瓶頸上部輕輕劃痕,75％酒精棉球擦拭后啟開，防止玻璃屑落入瓶內(nèi)。按照標示效價（Pe），用VmlBET水溶解，將細菌內(nèi)毒素工作標準品稀釋制備成所需濃度的細菌內(nèi)毒素標準溶液即0.5EU/ml、0.25EU/ml、0.125EU/ml、0.0625EU/ml（λ1為0.25EU/ml標示靈敏度）和細菌內(nèi)毒素工作標準品標準溶液即0.0625EU/ml、0.03125EU/ml、0.15625EU/ml、0.078125EU/ml（λ2為0.03EU/ml標示靈敏度）。當使用細菌內(nèi)毒素工作標準品（內(nèi)毒素含量為10EU/支,按照鱟試劑為0.25EU/ml）時的方法如下：復(fù)溶：準確吸取BET水lml加入細菌內(nèi)毒素工作標準品的安瓿內(nèi)，用封口膜將瓶口封嚴，置旋渦混合器混合15分鐘，即為10EU/ml內(nèi)毒素標準溶液。稀釋：取0.3ml內(nèi)毒素標準溶液加上2.7mlBET水，得到1EU/ml內(nèi)毒素標準溶液。取1EU/ml內(nèi)毒素標準溶液1.0m1稀釋液，加上1.0mlBET水，得到0.5EU/ml內(nèi)毒素標準溶液。往后依次類推。也可寫成下列格式：

0.3ml

1ml

1ml

1ml

10EU/ml——→1EU/ml——→0.5EU/ml——→0.25EU/ml——→0.125EU/ml

2.7ml

1ml

1ml

1ml1ml

1ml

1ml

1ml—→0.0625EU/ml——→0.0312EU/ml——→0.0156EU/ml——→0.0078EU/ml1ml

1ml

1ml

1ml在上述稀釋過程中，每稀釋一步，均須在旋渦混合器上混合30秒鐘。即工作標準品的稀釋倍數(shù)為：Pe/V/2λ1=20倍，Pe/V/λ1=40倍，Pe/V/0.5λ1=80倍，Pe/V/0.25λ1=160倍。當使用細菌內(nèi)毒素工作標準品（內(nèi)毒素含量為10EU/支，鱟試劑為0.03EU/ml）時即將細菌內(nèi)毒素工作標準品稀釋：Pe/V/2λ2=160倍，Pe/V/λ2=320倍，Pe/V/0.5λ2=640倍，Pe/V/0.25λ2=1280倍。2.5鱟試劑的準備在制備內(nèi)毒素標準溶液的同時，取0.1ml/支的鱟試劑34支輕彈瓶壁，使粉末落入瓶底。用砂輪在瓶頸輕輕劃痕，75％乙醇棉球擦拭后啟開備用，防止玻璃屑落入瓶內(nèi)，每瓶加入0.1mlBET水復(fù)溶，使內(nèi)容物充分溶解，避免產(chǎn)生氣泡。3試驗方法及結(jié)論3.1加樣3.1.1將靈敏度為0.25EU/ml的充分溶解的鱟試劑34支（管）放在試管架上，排成9列，其中4支(管)4列分別加入0.5EU/ml、0.25EU/ml、0.015625EU/ml、0.0078125EU/ml的細菌內(nèi)毒素國家標準品溶液；4支(管)4列分別加入稀釋了20倍、40倍、80倍、160倍的待測工作標準品。2支（管）1列分別加入BET水。內(nèi)毒素標準溶液和BET水的加樣量均為0.1ml/支。將靈敏度為0.03EU/ml的充分溶解的鱟試劑34支（管）放在試管架上，排成9列，其中4支(管)4列分別加入0.0625EU/ml、0.03125EU/ml、0.015625EU/ml、0.0078125EU/ml的細菌內(nèi)毒素國家標準品溶液；4支(管)4列分別加入稀釋了160倍、320倍、640倍、1280倍的待測工作標準品。2支（管）1列分別加入BET水。內(nèi)毒素標準溶液和BET水的加樣量均為0.1ml/支。3.1.2加樣結(jié)束后，輕輕混勻，避免產(chǎn)生氣泡，放入37℃±1℃內(nèi)毒素凝膠法測定儀中，保持水平狀態(tài)，保溫60分鐘±2分鐘，觀察結(jié)果。4試驗結(jié)果4.1細菌內(nèi)毒素國家標準品9000EU/支，待測工作標準品的效價為10EU/支，標示靈敏度為0.25EU/ml時，檢測結(jié)果如下表1和表2：表1細菌內(nèi)毒素國家標準品反應(yīng)終點濃度國家標準品濃度（EU/ml）0.50.250.1250.0625陰性對照反應(yīng)終點濃度重復(fù)管數(shù)1＋＋---0.252＋＋--0.253＋＋---0.254＋＋--0.25表2細菌內(nèi)毒素工作標準品反應(yīng)終點濃度工作標準品稀釋倍數(shù)204080160反應(yīng)終點稀釋倍數(shù)重復(fù)管數(shù)1＋＋--402＋＋--403＋＋--404＋＋--40反應(yīng)結(jié)果為：工作標準品效價Pt的計算Pt=antilog(∑X/4)×antilog(∑D/4)×V（EU/支），其中X為國家標準品系列反應(yīng)終點濃度的對數(shù)值，D為工作標準品系列反應(yīng)終點稀釋倍數(shù)的對數(shù)值。Pt＝antilog[(lg0.125+lg0.25+lg0.25+lg0.25)/4]×antilog[(lg40+lg40+lg40+lg40)/4]×1＝10EU/支國家標準品濃度（EU/ml）0.06250.031250.156250.078125陰性對照反應(yīng)終點濃度重復(fù)管數(shù)1＋＋---0.031252＋＋--0.031253＋＋---0.031254＋＋--0.031254.2細菌內(nèi)毒素國家標準品9000EU/支，待測工作標準品的效價為10EU/支，標示靈敏度為0.03EU/ml時檢測結(jié)果表3和表4：工作標準品稀釋倍數(shù)1603206401280反應(yīng)終點稀釋倍數(shù)重復(fù)管數(shù)1＋＋--3202＋＋--3203＋＋--3204＋＋--320表3細菌內(nèi)毒素國家標準品反應(yīng)終點濃度表4細菌內(nèi)毒素工作標準品反應(yīng)終點濃度反應(yīng)結(jié)果為：工作標準品效價Pt的計算Pt=antilog(∑X/4)×antilog(∑D/4)×V（EU/支），其中X為國家標準品系列反應(yīng)終點濃度的對數(shù)值，D為工作標準品系列反應(yīng)終點稀釋倍數(shù)的對數(shù)值。Pt＝antilog[(lg0.03125+lg0.03125+lg0.03125+lg0.03125)/4]×antilog[(lg320+lg320+lg320+lg320)/4]×1＝10EU/支4.結(jié)果判斷：保溫60分鐘±2分鐘后，觀察并記錄結(jié)果。將鱟試劑安瓿從內(nèi)毒素凝膠法測定儀中輕輕取出，避免振動，將每支拿出緩緩倒轉(zhuǎn)180°觀察，若管內(nèi)形成凝膠，并且凝膠不變形，不從管壁滑脫者為陽性，記錄為（+）；未形成凝膠或形成的凝膠不堅實、變形并從管壁滑脫者為陰性，記錄為（－）。若陰性對照溶液平行管均為陰性，供試品陽性對照溶液平行管均為陽性，陽性對照溶液平行管均為陽性，試驗有效。細菌內(nèi)毒素工作標準品效價為10EU/支，Pt在0.5Pe～2Pe（包括0.5Pe和2Pe）范圍內(nèi)，以0.25EU/ml和0.03EU/ml為鱟試劑的靈敏度。符核檢驗標準0.5Pe≤Pt≤2Pe。5.小結(jié)通過以上的實驗可知用兩個不同靈敏度的鱟試劑，用效價為9000EU/支細菌內(nèi)毒素國家標準品（CSE）標定標示效價為10EU/支的細菌內(nèi)毒素工作標準品（WSE），檢測效價Pt在0.5Pe～2Pe（包括0.5Pe和2Pe）范圍內(nèi)，以0.25EU/ml和0.03EU/ml為鱟試劑的靈敏度。符核檢驗標準0.5Pe≤Pt≤2Pe。證明凝膠檢測法的可靠性，規(guī)范了標化細菌內(nèi)毒素工作標準品