基因工程技術簡要介紹第1頁，共22頁，2023年，2月20日，星期一基因工程的操作流程第2頁，共22頁，2023年，2月20日，星期一

將外源基因（又稱目的基因，是一段

DNA片斷）組合到載體DNA

分子中去，再把它轉到受體細胞（亦稱寄主細胞）中去，使外源基因在寄主細胞中增值和表達，從而得到期望的由這個外源基因所編碼的蛋白質。第3頁，共22頁，2023年，2月20日，星期一所以，基因工程的操作包含以下步驟：

獲得目的基因

構造重組DNA分子

轉化或轉染

表達

蛋白質產物的分離純化第4頁，共22頁，2023年，2月20日，星期一

到哪里去找目的基因？

從組織細胞中可以分離得到人/小鼠的全套基因，稱為基因文庫。文庫中基因總數就人來說約有3萬個基因。如何從中把需要的基因找出來？采取“釣”的辦法。這個辦法通常稱為印跡法。（1）獲得目的基因第5頁，共22頁，2023年，2月20日，星期一印跡法內切酶切開DNA電泳印跡轉移放射性探針雜交膠片顯影第6頁，共22頁，2023年，2月20日，星期一印跡法的主要步驟：

（1）基因文庫－DNA用限制性內切

酶處理。

（2）DNA片斷混合物通過電泳分離。

（3）電泳后，通過印跡技術轉到酯酰

纖維薄膜上，以便操作。

（4）用已知小片斷DNA作為探針，

互補結合需要找的基因片斷。

（5）探針DNA片斷已用放射性元素

標記，使膠片感光后可看出。第7頁，共22頁，2023年，2月20日，星期一印跡法的關鍵是“分子雜交”，利用堿基配對的原則，用一段小的已知的DNA片斷去尋找（“釣”）大的未知的基因片斷。

探針DNA片斷從何而來？

根據目的蛋白的氨基酸序列，只要其中N－端15-20個氨基酸序列，按三聯密碼轉為40-60核苷酸序列，人工合成，即為探針DNA片斷。第8頁，共22頁，2023年，2月20日，星期一（2）目的基因的擴增用上面的方法“釣”出的目的基因，數量極少，所以，接下來必須經過擴增，亦稱為基因克隆。獲得相當數量的目的基因后，才能繼續(xù)下一步操作。第9頁，共22頁，2023年，2月20日，星期一（3）PCR——把尋找目的基因和擴增目的基因兩步操作并成一步。

PCR法，又稱多聚酶鏈式反應，是近年來開發(fā)出來的基因工程新技術，它的最大優(yōu)點是把目的基因的尋找和擴增，放在一個步驟里完成。第10頁，共22頁，2023年，2月20日，星期一PCR操作流程90

0C500C700C返回第11頁，共22頁，2023年，2月20日，星期一PCR反應分三步完成：

第一步——90

0C高溫下，使混合物的DNA片斷因變性而成單鏈。

第二步——500C溫度下，引物DNA結合在適于配對的DNA片斷上。

第三步——700C溫度下，由合成酶（DNA高溫聚合酶）催化，從引物開始合成目的基因DNA。第12頁，共22頁，2023年，2月20日，星期一

PCR的三個步驟為一次循環(huán)，約需5－10分鐘。每經一次循環(huán)，所找到的目的基因擴充一倍。經過20次循環(huán)，即可擴增

106

倍，總共只需幾個小時。第13頁，共22頁，2023年，2月20日，星期一（4）構造重組DNA分子首先要有載體。

載體有好幾種，常用的有：

質粒－－環(huán)狀雙鏈小分子DNA，適于做小片斷基因的載體。

噬菌體DNA－－線狀雙鏈DNA，適于做大片斷基因的載體。第14頁，共22頁，2023年，2月20日，星期一返回用質粒構建重組DNA分子第15頁，共22頁，2023年，2月20日，星期一返回用噬菌體DNA構建重組DNA分子第16頁，共22頁，2023年，2月20日，星期一

其次要把目的基因“裝”到載體中去?！鞍惭b”的過程，需要好幾種工具酶，其中關鍵的酶叫限制性內切酶。

此酶識別一定堿基序列，有的還可切出“粘性”末端，使得目的基因和載體的連接非常容易。圖一圖二第17頁，共22頁，2023年，2月20日，星期一下圖限制性內切酶識別特定的堿基序列第18頁，共22頁，2023年，2月20日，星期一返回限制性內切酶造成粘性末端有利于重組DNA分子的構建第19頁，共22頁，2023年，2月20日，星期一（5）轉化/轉染—表達—蛋白質分離

把構造好的重組DNA分子送進寄主細胞，亦需要適當的技術方法。若受體細胞是細菌，通常稱轉化；若受體細胞是動/植物細胞，通常稱轉染。第20頁，共22頁，2023年，2月20日，星期一

重組DNA分子進入寄主細胞后，其中的目的基因能否表達，表達效率高低，還有很大差別。表達通常是指