大黃的提取分離實驗報告背景和目的大黃，又名黃良、火參、將軍等，為我國傳統(tǒng)常用中藥材。大黃(RadixeRhiZomaRhei)為寥科植物掌葉大黃(RheumPalmatumL)，唐古特大黃(RheumtangutieumMaxim.exBal勺或藥用大黃(RheumoffieinaleBaill)的干燥根和根莖。掌葉大黃和唐古特大黃藥材稱北大黃，主產(chǎn)于青海、甘肅等地。藥用大黃藥材稱南大黃，主產(chǎn)于四川。于秋末莖葉枯萎或次春發(fā)芽前采挖。除去須根，刮去外皮切塊干燥，生用，或酒炒，酒蒸，炒炭用。味苦、性寒。歸脾、胃、大腸、肝、心包經(jīng)。1.1天然產(chǎn)物提取、分離和純化技術(shù)概述植物的化學(xué)成分比較復(fù)雜，種類很多，因此在著手研究一個植物的有效成分時，首先要大致知道有哪些類型的化學(xué)成分，這就需要對各類化學(xué)成分的進行簡單的定性預(yù)試驗。通常先用幾種不同極性的溶劑分別進行提取，進行生物活性篩選，確定哪一個溶劑提取部位有效后，再對該部位進行各類化學(xué)成分的預(yù)實驗。另外在植物資源化學(xué)研究工作中，常常根據(jù)工作需要，定向的尋求某類化學(xué)成分，這就要進行某類化學(xué)成分的單項預(yù)實驗。根據(jù)預(yù)實驗的結(jié)果，判斷可能含有哪些類型的化學(xué)成分，然后按照所含化學(xué)成分的性質(zhì)，設(shè)計有效成分分離的具體方法。通常將植物分別用石油醚、95%乙醇和水提取。這樣便可以把絕大部分植物成分提取出來，假使我們不著重研究揮發(fā)油，一般經(jīng)過酒精和水兩種溶劑的提取就可以進行預(yù)實驗。預(yù)實驗往往只能提供初步的線索。水提液取植物粉末5g，加50mL蒸餾水，在50-60°C的水浴上加熱約1小時后過濾，此濾液即可在試管及濾紙上作糖、多糖、有機酸、皂苷、苷類、酚類、鞣質(zhì)、氨基酸、生物堿等項的預(yù)試驗。酒精提取液取植物粉末5g，加50mL95%的酒精，在水浴上加熱回流約1小時后過濾，濾液即可進行酚類、鞣質(zhì)、有機酸等項的預(yù)實驗。其后將濾液濃縮至漿狀，置于研缽中，用少量5%鹽酸溶解，取鹽酸水溶液進行生物堿的預(yù)實驗。原來的糖漿加以少量的乙醇溶解，其溶液可以進行黃酮體、蒽醍、酚類、苷類、有機酸、香豆素、萜類、甾體化合物等項的預(yù)實驗。若被試植物為樹葉，其中含有很多葉綠素，應(yīng)盡量先將葉綠素除去，才不致妨礙預(yù)實驗進行。其方法如下:將植物用95%的乙醇熱回流后的浸出液加入適量的水，使95%的乙醇稀釋成70%，搖勻后倒入分液漏斗，再加入等體積的石油醚或汽油進行萃取，葉綠素轉(zhuǎn)移到上層的石油醚溶液中，分出下層70%乙醇提取液，減壓抽干得糖漿狀物質(zhì)，再做上述預(yù)實驗。石油醚提取液取植物粉末1g，加10mL石油醚(沸程60-90°C)，放置2-3個小時，過濾，濾液放在表面皿上，讓石油醚揮發(fā)掉，用殘留物進行萜類、甾體、脂肪等項的檢查。如何著手有效成分的分離呢?一般有下面兩種情況:第一，對有效成分一無所知。另一種就是從植物中提取已知的化學(xué)結(jié)構(gòu)類者。兩種情況不同，考慮其提取分離方法也不同。對于第一種情況，經(jīng)不同溶劑提取，以確定有效部位，再逐步細分，追蹤有效成分最集中的部位，最后分得有效的單體。通?？梢圆扇∮傻蜆O性到高極性的分別提取，將藥粉按以下次序提取，石油醚或苯提取脂溶性大的化合物，如油脂和蠟、葉綠素、精油及甾體、三萜等中性物質(zhì)；乙醚提取樹脂及一些極性基團少的化合物，如甾體，某些生物堿、有機酸、黃酮體及香豆素苷元等；氯仿及乙酸乙酯提取生物堿及許多中性成分；丙酮、乙醇或甲醇(提取極性化合物，如生物堿的鹽類)；水提取水溶性化合物，如氨基酸、糖類等。進一步還可以分為冷水、熱水、酸水、堿水等步驟。這樣除纖維素等不溶物以外，植物中各類成分都能被提取出來。在確定哪一個部位有效后，再進一步分離。也可以將植物先用水或酒精提取，所得總提取物拌以硅膠或硅藻土等使成粉末后，再按上述次序逐步分離。1.2中藥蒽醍類成分的提取分離不同中草藥所含蒽醍化合物的結(jié)構(gòu)各不相同，而且游離蒽醍和蒽醍苷的極性溶解性差別較大，因此提取分離方法各異，但多采用有機溶劑提取法。1.2.1游離蒽醍的提取一般游離蒽醍化合物的極性較小，可用極性較小的有機溶劑如乙醇、乙醚、苯、氯仿等提取。如果提取的是帶游離酚羥基的蒽醍化合物，也可以選用堿提取一酸沉淀法，即酚羥基與堿成鹽而溶于堿水溶液中，酸化后酚羥基被游離而又沉淀出來。值得注意的是，一般羥基蒽醍類衍生物及其相應(yīng)的苷類在植物體內(nèi)多通過酚羥基或羧基結(jié)合成鎂、鉀、鈉、鈣鹽形式，在提取之前需加酸酸化使之全部處于游離狀態(tài)。也可以先用乙醇提取，減壓濃縮后殘渣用與水不相溶的有機溶劑(如氯仿、乙醚)反復(fù)萃取，游離蒽醍將轉(zhuǎn)溶于有機溶劑中，蒽醍苷仍留在水溶液中[1]。1.2.2游離羥基蒽醍的分離羥基蒽醍是中草藥蒽醍類化合物最重要的結(jié)構(gòu)類型。由于羥基蒽醍中酚羥基的位置和數(shù)目不同，分子的酸性強弱也不同，據(jù)此可酌情選用5%NaHCO3、5%Na2CO31%NaOH或5%NaOH進行pH梯度萃取分離。萃取后各部分堿水加酸酸化，即有蒽類沉淀析出。但是，酸性差別不大的羥基蒽醍類化合物不宜用此法分離。吸附柱層析是分離和精制蒽醍衍生物的最有效手段。硅膠、聚酰胺、羥丙基葡聚糖凝膠SephadexLH-20的分離效果良好［2-5］。當(dāng)藥材中含有一系列結(jié)構(gòu)近似的蒽醍衍生物時，必須經(jīng)過層析方法才能得到徹底分離。酸性強的蒽醍衍生物的吸附性能很強，且酸性相近的蒽醍衍生物被吸附的程度也很相近，用柱層析較難完全分離，此時可將混合物進行乙?；?，使其轉(zhuǎn)化為乙酸乙酯后再進行層析，而且往往需要反復(fù)多次層析才能收到較好的效果［1］。1.2.3蒽醍苷的提取蒽醍苷因其分子中含有糖，故極性較大，水溶性較強，提取分離比較困難，一般不容易得到純品，而且蒽醍苷與酶多伴存于中草藥中，在提取中容易使苷酶解而產(chǎn)生苷元或次級苷。一般可采用70%以上的甲醇、乙醇或80°C以上熱水提取，熱水可以破壞酶的活性，增大苷類的溶解度，而且部分蛋白質(zhì)類雜質(zhì)能因熱水而凝固變性與苷類直接分離開［6］。1.2.4蒽醍苷的分離蒽醍苷的分離一般采用柱層析法，而且在柱層析之前往往采用溶劑法或鉛鹽法處理粗提品以除去大部分雜質(zhì)，制得較純的總苷以后再進行柱層析。過去主要應(yīng)用的是硅膠柱層析法，近年來聚酰胺柱層析、正相和反相硅膠柱層析、SephadexLH-20凝膠柱層析的廣泛應(yīng)用使得天然藥物中蒽醍苷的分離獲得了滿意的分離效果［7,8］1.3大黃的藥理研究大黃是重要的瀉下藥、清熱藥和止血藥。臨床研究證實，大黃具有抗衰老、降血脂、抗腫瘤和抗炎，瀉下作用，抗菌性，止血性等多種生物學(xué)活性。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)對大黃進行了深入的藥理研究。大黃含有蔥貳衍生物，其中以番瀉貳的瀉下作用最強，另還含有大黃靴質(zhì)及相關(guān)物質(zhì)，如沒食子酸、兒茶素和大黃四聚素等。(l)對血壓的作用:動物實驗表明，藥用大黃及掌葉大黃浸劑、配劑及大黃素皆有降低血壓作用，D一兒茶精可使兔耳血管收縮、血壓輕度上升。(2)對心臟的作用:對離體蟾蛛的心臟，大黃素小劑量則興奮，大劑量則抑制。⑶降血脂作用:大黃的活性物質(zhì)白黎蘆醇能抑制膽固醇吸收;大黃中的兒茶素等能降低毛細血管通透性，增加內(nèi)皮致密性，限制有害脂質(zhì)的進入，從而降低血液粘滯度，提高血漿滲透壓，這種稀釋血液的功能，可以減少脂質(zhì)的沉積。由于大黃還能增加膽汁分泌，促進膽汁排泄，使膽固醇在腸內(nèi)被還原成類固醇排出體外的數(shù)量增加。致瀉作用:大黃內(nèi)的結(jié)合蒽酮類物質(zhì)能促使腸蠕動而致瀉。1.4化學(xué)成分大黃化學(xué)成分包括蒽醍類大黃素、大黃酸、大黃酚、大黃素甲醚、蘆薈大黃素、土大黃素和異大黃素等及其苷類和蒽酮類化合物，還含有多元酚類、鞣質(zhì)、揮發(fā)油、多糖、脂肪酸等幾十種化合物。其中各種類型的蒽醍類化合物是中藥大黃的主要化學(xué)成分，也是主要生理活性物質(zhì)。可以進一步分為游離型蒽醍類和結(jié)合型蒽醍類。掌葉大黃、藥用大黃和唐古特大黃均含有大黃酸、大黃素、大黃酚、蘆薈大黃素、大黃素甲醚等游離型蒽醍類成分。結(jié)合型蒽醍類成分有大黃素葡萄糖苷、大黃素甲醚葡萄糖苷、蘆薈大黃素葡萄糖苷、大黃酚葡萄糖苷、大黃酸葡萄糖苷、大黃酸苷A~D(藥用大黃不含大黃酸苷類成分)等［io］大黃含有蒽醍類衍生物、苷類化合物、鞣質(zhì)類、有機酸類、揮發(fā)油類等［ii］。蒽醍類衍生物分為：(一)游離蒽醍類衍生物，如蘆薈大黃素(aloeemodin)、土大黃素(elirysamn)、大黃酚(elirysophanol)、大黃素(emodin)、異大黃素(isoemodin)、蟲漆酸D(laceaieacidD)、大黃素甲醚(physeion)、大黃酸(thein);(2)結(jié)合蒽醍類化合物，有大黃酸、蘆薈大黃素、大黃酚的單和雙葡萄糖甙;大黃素、大黃素甲醚的單糖甙；蒽酚和蒽酮化合物:大黃二蒽酮(rheidin)、掌葉二蒽酮(palmidin)以及與糖結(jié)合的甙如番瀉甙(sennoside)A、B、C、D、E、F等。苷類化合物:土大黃甙(rhaponticin)、3，5，4’-三羥基芪烯-4’-O-p-D-(6’-O-沒食子酞)葡萄糖甙(3，5，4-trihydroxy-stilbene-4’-O-p-D(6’-O-gallaylglucoside)3，5，4’一三羥基芪烯-4’-O-p-D-毗喃葡萄糖甙(3，5，4?—trihydroxy-stilbene-4’-O-p-D-glucopyranoside)。萘衍生物:torachrysone-8-O-p-D-glueopyranoside，torachrysone—8—(6’-oxaly)-glucopyraboside及決明松(torachryson)。鞣質(zhì)類:沒食子酰葡萄糖、d-兒茶素、沒食子酸、大黃四聚素(tetrann)等。大黃四聚苯經(jīng)水解，得沒食子酸、肉桂酸及大黃明(rheosmin)。此外合有樹脂。尚含有有機酸:蘋果酸、唬拍酸、草酸、乳酸、桂皮酸、異丁烯二酸、檸檬酸、延胡紊酸等。大黃中還含有揮發(fā)油、脂肪酸及植物幽醇等。

%%R?AlowwlinHEmMinOHRheinHPhyscionOCHjCirysopholHwH叫叫COOCHJCH,IXUrAVA0圖1.蘆薈大黃素(Aloe-emodin)、大黃酸(Rhein)、大黃素(Emodin)、大黃酚(Chrysophanol)AlowwlinHEmMinOHRheinHPhyscionOCHjCirysopholHwH叫叫COOCHJCH,紙色譜法:紙色譜法是最早應(yīng)用于大黃中有效成分分離分析的色譜法。柱色譜法:大黃酚和大黃素甲醚結(jié)構(gòu)相似，極性相近，用一般層析方法很難分離。薄層色譜法:此法在大黃的分離中是一種常用的層析方法。吸附劑載體最常用的是硅膠G、硅膠GF254、硅膠H、硅膠HF254等。高速逆流色譜法(HSCCC)高速逆流色譜技術(shù)(High-speedeountereuerrntChromatogrpahy)是在液液分配色譜的基礎(chǔ)上建立的一項分離技術(shù)。利用pH梯度萃取法與HSCCC結(jié)合分離出大黃的五個游離蒽醍。分別利用HSCCC法對傳統(tǒng)中藥大黃中的五游離蔥醒類活性成分大黃酚、大黃素甲醚、蘆薈大黃素、大黃素、大黃酸等進行了制備分離，經(jīng)HPLC驗證純度均達到98%以上。本實驗旨在采取柱色譜、薄層色譜等分離方法，獲得大黃素、大黃酚、蘆薈大黃素等單體化合物，并用高效液相色譜檢測純度。從而掌握植物的提取分離方法并熟練應(yīng)用。實驗步驟與觀察2.1大黃的提取稱取50g大黃，粉碎，用95%的無水乙醇回流提取1h。過濾，得浸膏。2.2薄層板選擇條件采用石油醚-丙酮系統(tǒng)為展開劑如下圖為純石油醚、石油醚：丙酮=50:1,15:1,5：1，3：1。2.3柱層析稱取大黃浸膏1g,拌樣硅膠1.5g，空白硅膠15g,濕法拌樣，干法裝柱。梯度洗脫，流動相分別為石油醚：丙酮二100：0，50：1，25：1，15：1，5:1,3:1,12.4薄層制備將柱層析以石油醚-丙酮=25：1為流動相，得到的流分5號和7號進行制備薄層分離。5號對應(yīng)展開劑為石油醚：丙酮二8：1，7號對應(yīng)展開劑為石油醚：丙酮=3：1。將柱層析以石油醚-丙酮=15：1為流動相，得到的流分8號進行制備薄層分離。8號對應(yīng)展開劑為石油醚：乙酸乙酯：二氯甲烷=4：1：1。實驗結(jié)果針狀紡品（不落于甲■）硅膠柱層折20&30001000始針狀紡品（不落于甲■）硅膠柱層折20&30001000始,rTb?#壽實驗討論分離得到三個單體化合物，達到了分離蒽醍類化合物的實驗?zāi)康摹嶒炦^程中首先使用小薄層板選擇上柱條件，效果不錯，可是柱層析結(jié)束并沒有得到同樣的效果，原因可能有：⑴柱層析柱效更高，分離效果更好，薄層板選擇條件是粗分。⑵柱層析的流分在合并時不合理，合并過程中選擇的展開系統(tǒng)太過單一。⑶柱子裝得不好，沉降不夠。柱層析過程中，在流動相中加入了少許冰醋酸，可能會造成得到與冰乙酸反應(yīng)后的化合物。制備薄層應(yīng)注意的問題：⑴薄層板不要鋪得太厚；⑵點樣的樣品要全部溶解，不要太濃；⑶點樣量要適中，過大則超過板的載樣量，達不到好的分離效果；⑷如果點樣兩次，則要保證前后兩次在一條直線上;⑸TLC小板選擇條件時，要保證幾個點之間分離效果好，否則制備薄層時易出現(xiàn)條帶之間分不開。⑹在分離條帶時，可以選擇前一條帶的上面部分，和后一條帶的下面部分，中間部分如果分離效果不好可以再制備。在用高效液相色譜鑒定樣品純度時，在兩分鐘處得到一個峰面積為1050左右的平頭峰，進樣量為15微升。有可能是苷類物質(zhì)，含量比較高。實驗過程中得到三個結(jié)晶，都不溶于甲醇，也不溶于其他有機溶劑。兩相展開系統(tǒng)分離不好，可以嘗試三相展開系統(tǒng)，本實驗在分離8號樣品時，開始用石油醚-乙酸乙酯系統(tǒng)，分離效果都不理想，后改為石油醚：乙酸乙酯：二氯甲烷=4:1:1，得到很好的分離效果。大黃中含有一系列結(jié)構(gòu)近似的蒽醍衍生物，其酸性強的蒽醍衍生物的吸附性能很強，且酸性相近的蒽醍衍生物被吸附的程度也很相近，用柱層析較難完全分離，此時可以將混合物進行乙?；蛊滢D(zhuǎn)化為乙酸乙酯后再進行層析。結(jié)晶不一定是單體化合物，還需要重結(jié)晶等其他方法來純化。結(jié)論通過本實驗得到了預(yù)期結(jié)果，分離得到三個單體化合物。初步學(xué)習(xí)了采用柱層析、薄層制備以及高效液相色譜分離化合物的方法。使理論與實踐相結(jié)合，加深了對提取分離的認識。參考文獻段淑娥，李敏.中草藥中蒽醍化合物的研究進展.西安文理學(xué)院學(xué)報，2005,8(1)：24-28袁倚盛，趙飛浪，譚力.大黃游歷蒽醍的制備與純化[J].中草藥，2000，