乙型肝炎病毒核苷(酸)類(lèi)似物耐藥的監(jiān)測(cè)

繆曉輝2009.5一、HBV耐藥的有關(guān)定義二、各種耐藥檢測(cè)技術(shù)的評(píng)價(jià)三、需要重視的幾個(gè)問(wèn)題一、HBV耐藥的有關(guān)定義

病毒學(xué)突破（virologicbreakthrough）病毒反跳（viralrebound）生化學(xué)突破（biochemicalbreakthrough）HBV基因型耐藥（genotypicresistance）HBV表型耐藥（phenotypicresistance）臨床耐藥（clinicalresistance）HBV耐藥的有關(guān)定義

病毒學(xué)突破（virologicbreakthrough）指在核苷類(lèi)藥物治療過(guò)程中，患者的血清HBVDNA水平一度被抑制，但在繼續(xù)治療中血清HBVDNA水平與最低值相比上升或超過(guò)1個(gè)log10（10倍）。HBV耐藥的有關(guān)定義

病毒反跳（viralrebound）指核苷類(lèi)藥物治療過(guò)程中患者的血清HBVDNA水平一度被抑制，但在繼續(xù)治療中血清HBVDNA升高至＞2×104IU/mL或高于治療前水平。

HBV耐藥的有關(guān)定義

生化學(xué)突破（biochemicalbreakthrough）指在核苷類(lèi)藥物治療過(guò)程中血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）水平一度復(fù)常，但在繼續(xù)治療中血清ALT水平又再次升高。肝臟生活指標(biāo)很多，但是在此僅指ALT。HBV耐藥的有關(guān)定義

HBV基因型耐藥（genotypicresistance）指HBV基因組中的某些位點(diǎn)發(fā)生改變，導(dǎo)致這種藥物對(duì)HBV的抑制作用下降或消失。這種HBV基因變異與HBV的耐藥性有直接因果關(guān)系，通過(guò)這些變異位點(diǎn)的檢測(cè)可判斷HBV有無(wú)耐藥性。HBV耐藥的有關(guān)定義

HBV表型耐藥（phenotypicresistance）通過(guò)體外細(xì)胞培養(yǎng)方法，直接測(cè)定HBV對(duì)某種藥物的敏感性，或者在體外直接測(cè)定HBV聚合酶的活性，敏感性的降低或酶活性的下降均表明有耐藥，即表型耐藥。通常以IC50來(lái)評(píng)估IC50＜5倍:敏感IC50在5～10倍:部分耐藥IC50

＞10倍:耐藥HBV耐藥的有關(guān)定義

臨床耐藥（clinicalresistance）指臨床出現(xiàn)病毒復(fù)制不能被抑制，或HBV復(fù)制一度被抑制后又出現(xiàn)HBVDNA反跳，同時(shí)伴有ALT升高，或肝炎復(fù)發(fā)的其他臨床證據(jù)。二、各種耐藥檢測(cè)技術(shù)及評(píng)價(jià)病毒學(xué)反跳或突破的監(jiān)測(cè)HBV基因型耐藥監(jiān)測(cè)HBV表型耐藥檢測(cè)臨床耐藥監(jiān)測(cè)病毒學(xué)反跳或突破的監(jiān)測(cè)基于對(duì)血清HBVDNA載量的動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)需重視以下三點(diǎn)：1.HBVDNA載量檢測(cè)手段的敏感性2.檢測(cè)技術(shù)的可靠性和穩(wěn)定性3.監(jiān)測(cè)的間隔時(shí)間HBV基因型耐藥監(jiān)測(cè)時(shí)機(jī)非必須不主張常規(guī)、廣泛應(yīng)用基因型耐藥相關(guān)變異的命名基因型耐藥相關(guān)變異

在HBV多聚酶序列中的位置HBV基因型耐藥的主要技術(shù)堿基序列分析法直接測(cè)序克隆測(cè)序聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)及限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性技術(shù)(PCR-RFLP)反向雜交分析技術(shù)（INNO—LiPA）基因芯片技術(shù)實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)探針定點(diǎn)突變PCR技術(shù)引物末端堿基定點(diǎn)突變擴(kuò)增技術(shù)熔解曲線法基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOFMS)直接測(cè)序法末端終止法化學(xué)裂解法DNA測(cè)序自動(dòng)化使用特異性引物與單鏈模板DNA退火，在DNA聚合酶作用下進(jìn)行延伸反應(yīng)，用ddNTP終止，用PAGE區(qū)分長(zhǎng)度僅相差1個(gè)核苷酸的ssDNA，從而完成測(cè)序的方法。用化學(xué)試劑在A、G、C、T處特定的裂解DNA片段，產(chǎn)生一簇各種長(zhǎng)度的短鏈，經(jīng)過(guò)PAGE放射自顯影可直讀DNA順序。類(lèi)似末端終止法，所不同的是用熒光染料標(biāo)記，計(jì)算機(jī)自動(dòng)讀出。優(yōu)點(diǎn)簡(jiǎn)便、迅速、應(yīng)用廣泛。不需酶促反應(yīng)，可以對(duì)寡核苷酸測(cè)序。①簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確可靠。②安全、無(wú)放射性污染。③模板用量大大減少。④測(cè)序能力增強(qiáng)。HBVYMDD變異直接測(cè)序結(jié)果圖譜直接DNA測(cè)序的局限性1.設(shè)備貴、技術(shù)高、耗材、費(fèi)時(shí)。2.必須有充足目的基因片段。3.突變株比例小于20%時(shí)，由于競(jìng)爭(zhēng)抑制作用不能被擴(kuò)增。直接測(cè)序法檢測(cè)HBVYMDD變異1.JPG克隆測(cè)序法克隆測(cè)序法優(yōu)點(diǎn)：1.有助于發(fā)現(xiàn)混合株并可大致確定不同序列毒株之間的相對(duì)比。2.提高了檢測(cè)的靈敏度。局限性：1.技術(shù)難度較高。2.檢測(cè)周期更長(zhǎng)。3.檢測(cè)的費(fèi)用大大增加。堿基變噴異可能氏導(dǎo)致：①原有謎位點(diǎn)消失②產(chǎn)磚生新的舌位點(diǎn)③識(shí)餃別位點(diǎn)著移位利用錯(cuò)配吊引物使漫P虧CR產(chǎn)物凍中產(chǎn)生禾特襲異的酶切杰位點(diǎn)結(jié)果:寄酶切恐片段長(zhǎng)件、短變散化和多貍、少變鳴化聚合酶付鏈?zhǔn)椒簇洃?yīng)及限講制性片李段長(zhǎng)度跳多態(tài)性悶技術(shù)(雜PCR枯-RF令LP)限制性內(nèi)攜切核酸酶托的作用它們能夕識(shí)別D者NA的月特異序接列，并伶在識(shí)別最序列內(nèi)及或其旁燙切割雙仁鏈DN罵A。如神：Nde拿I限制酶凍的識(shí)別瘦序列和鑒切割位象點(diǎn)：CATAT臣G--砌-薄GTA費(fèi)TA萄C--餃-Nla牌Ill限制酶的泉識(shí)別序列盈和切割位跳點(diǎn)：腥CAT挽GN彩NN-封--G饞TAC濃NNN-菌--PCR哥-RF盤(pán)LP檢喬測(cè)HBV挑YM輕DD變異PCR錯(cuò)配引物陶設(shè)計(jì)PCR-味RFLP盲檢測(cè)HBV轉(zhuǎn)YM潛DD變異PCR預(yù)-RF吼LP檢衛(wèi)測(cè)HBV互YM雁DD變異PCR-普RFLP遷技術(shù)的評(píng)爛價(jià)優(yōu)點(diǎn)：簡(jiǎn)單、廣帝泛易開(kāi)展懶。缺點(diǎn)：1.限制裂性內(nèi)切酶痰種類(lèi)有限沫。2.錯(cuò)配哨引物將導(dǎo)蠢致退火溫撤度降低、巾非特異條全帶增多。3.引吸物非完幟全匹配秀，可能桑導(dǎo)致擴(kuò)黃增效率巷降低、雜檢測(cè)敏感的夾下降。反向雜蛇交分析坐技術(shù)（蝦INN詳O—L河iPA射）INN弱O—L眉iPA仗診斷H凝BV尺YMD朗D變異DNA咱芯片技卵術(shù)BiologicalSampleAnalyzedataScannermicroarray“Hy蘭bri剖diz怠e”arrayerMicr病oarr順ayf娃abri口cati繁onSam扁ple主pr哨epa甘rat雙ionMole物cula該rhy咐brid浩izat穿ionDet定ect啞ion奸an理d倘ana罰lys胸isDNA蟲(chóng)芯片技堅(jiān)術(shù)診斷手HBV怨YM診DD變激異Dete蔽ctio雨nof剝YMD螺DMo諒tif畏Muta拳nts惑byO牲ligo跑nucl鑰eoti番deC研hips裕in薦Lam續(xù)ivud疤ine-簽Untr粱eate脆dPa懶tien刻tsw農(nóng)ith最Chro專(zhuān)nic棕Hepa牛titi皮sB壞Viru魚(yú)sIn反fect胖ion。JK爽ore爭(zhēng)an餐Med傭Sc架i2鴨004襯;1離9:訊541皮-54寸6.DNA攀芯片技綢術(shù)優(yōu)點(diǎn)辮局限性大通量耽技術(shù)和檔設(shè)備的要錦求高快速沸檢考測(cè)成本破高靈敏度蓬高可平行檢轉(zhuǎn)測(cè)實(shí)時(shí)熒許光定量搶PCR森在基因密變異中僅的應(yīng)用探針定點(diǎn)禽突變PC舉R技術(shù)-督杰Taqm遼an-M喚GB探針引物末踢端堿基浸定點(diǎn)突岡變擴(kuò)增摧技術(shù)高分辨熔舅解曲線法Taq襖man亭-MG惡B探針居定點(diǎn)突饞變PC韻R技術(shù)Taqm睡an-M草GB探針祖技術(shù)檢測(cè)YM酒DD變異HBV乒DN卡A>1蘆05cop倍ies過(guò)/mlW:M央=1:坑1HBV腸DNA>即105copi憐es/m凝lW:M=嗽10:1HBV怨DN才A<1詢05cop巖ies臂/mlW:M=蹄10:1：W：M探針定點(diǎn)青突變PC悠R技術(shù)優(yōu)點(diǎn)輝不民足靈敏度居高需要相愿對(duì)較貴游的熒光躍PCR為儀特異性舉好需要多條救熒光探針益，成本高費(fèi)時(shí)短影響因素早多，存在糞一定誤判引物末溉端堿基獄定點(diǎn)突盯變擴(kuò)增樂(lè)技術(shù)引物末端拌堿基定點(diǎn)皆突變擴(kuò)增蝴技術(shù)

檢倉(cāng)測(cè)YMD兆D變異熔解曲突線法檢福測(cè)YM男DD變普異特異性謝探針，驅(qū)其Tm溉值不同溶解曲掏線分析基質(zhì)輔教助激光挽解吸電秒離飛行薪時(shí)間質(zhì)煩譜(M撓ALD饅I-T兆OF史MS)會(huì)原理MAL武DI-斥TOF拼MS五檢測(cè)鬼HBV抓YM錫DD變闊異的原冷理酶切分子簡(jiǎn)量.JP樂(lè)G基質(zhì)輔助渡激光解吸鹿電離飛行星時(shí)間質(zhì)譜構(gòu)(MAL盤(pán)DI-缸TOF敗MS)優(yōu)點(diǎn)：高靈敏煮度、準(zhǔn)勵(lì)確度、割分辨率能發(fā)現(xiàn)憲相對(duì)比浸例小于巷1%的它變異株陸。局限性美：設(shè)備昂貴蛾，目前國(guó)真內(nèi)難以用已于臨床檢共測(cè)。HBV耐機(jī)藥不同檢妹測(cè)技術(shù)的框比較Adv獵anc赴es闊in遮Mol壁ecu佛lar規(guī)Di植agn噸osi繁so注fH新BV僑Inf蒙ect捕ion柱an愿dD消rug柿Re稀sis勉tan袋c(diǎn)e。Int.蓮J.組Med.窮Sci存.2005腎2(1醉)：8-擺161Sen假siti咸vity架her想ere染fers西to磚the辨lowe嘩stl醉evel飄(%)吧at蔥whic賊han哀ass貫ayc準(zhǔn)and屯etec猾tmi辜xtur揀eso框fmu皆tant巾and鄭wil型d-ty惱pev械irus擱.2I銷(xiāo)nfor蛛mati遇onc加onte累nti襪sco懶nsid顛ered嗚as屬ame小asur惜eof述at滑est’漆sab連ilit呆yto字pro毒vide屋bro型ad,胸rele蒸vant州inf封orma產(chǎn)tion森abo抖utp紡ossi陷ble處new晉muta藝tion肯s.3俱Upda趨teab餅ilit可yas耀sess膚est約hee嬸ase恰atw巷hich蛛at駛est副can等be橡dapt旗edt爐oin勾corp杯orat腐eth豆ede明tect三ion知ofa學(xué)new意mut鏟atio今n.n栽a,n陰ota獄ppli厲cabl餅e.n糕d,n滑otd埋eter脾mine斬d.HBV羽表型耐疊藥檢測(cè)有兩種斷途徑：1.細(xì)鑼胞外H棟BV聚粥合酶活庭性分析套。2.細(xì)筋胞藥物舊敏感性存實(shí)驗(yàn)。細(xì)胞外悲HBV港聚合酶詢活性分間析目前常用乖的研究H看BV聚合莫酶活性模融型是將H此BV基因輸組插入桿遵狀病毒載喊體，繼而么轉(zhuǎn)染昆蟲(chóng)賄細(xì)胞而表泛達(dá)HBV序顆粒，應(yīng)嗽用親和層油析法純化陪HBV顆悅粒后，在斷細(xì)胞外評(píng)校價(jià)藥物對(duì)蛾聚合酶活偶性的影響荷。細(xì)胞外H樂(lè)BV聚合銳酶活性分輸析細(xì)胞藥物蝕敏感性實(shí)介驗(yàn)該方法窮類(lèi)似于慨細(xì)菌藥槳物敏感曲試驗(yàn)。桶目前多養(yǎng)采用病葵毒載體遞將含有幅被檢測(cè)匯的含H稅BV變顫異位點(diǎn)領(lǐng)的全基溫因組導(dǎo)忍入肝細(xì)上胞源性戚細(xì)胞株召，然后煮將各種擠濃度的萍核苷類(lèi)疼藥物加釀入培養(yǎng)姑液，經(jīng)沉過(guò)一定乏時(shí)間培苦養(yǎng)后檢堆測(cè)細(xì)胞糾上清中悼的HB牽VD宏NA含勞量。細(xì)胞藥圣物敏感倡性實(shí)驗(yàn)細(xì)胞藥物候敏感性實(shí)戲驗(yàn)該技術(shù)罩在操作堂上非常厚繁瑣，濤目前僅晝限于研蝕究之需報(bào)，主要蒜用于藥渾物開(kāi)發(fā)繭研究，染尚不能血用于常硬規(guī)臨床施分析。臨床耐盆藥監(jiān)測(cè)YMD舒D變異齊前后病涌毒載量奮和AL兼T的變極化HBV桿MDD變?nèi)Ξ惻c病毒肝學(xué)突破判斷臨床輕耐藥時(shí)的狐建議1.結(jié)粘合核苷類(lèi)貍藥物的應(yīng)漂用史、起翅始病毒載巾量、是否裙合并其他參肝病等。2.注意坦甄別依從躍性不良。3.結(jié)褲合基因屯變異位距點(diǎn)。三、需橋要重視瞞的幾個(gè)萄問(wèn)題慎重對(duì)待猜天然耐藥閥的結(jié)論。不要過(guò)曉分依基貌因型耐扯藥檢測(cè)協(xié)技術(shù)。正確對(duì)待緣瑞基因分型充技術(shù)。YMD首D自然者變異的歪幾組數(shù)薄據(jù)Akar路suM勝等采用I慣nnoL國(guó)ipa泰法檢測(cè)7最1例未經(jīng)勁抗病毒的旦成年慢性暗乙肝攜帶乓者，結(jié)果晨有13例款檢測(cè)到Y(jié)請(qǐng)MDD變喬異株。Lee伯CZ蔑等采用蛛引物末蒸端堿基煎定點(diǎn)突毒變擴(kuò)增謀技術(shù)對(duì)煩28例威拉米夫財(cái)定治療米前的C豬HB患嶄者血清倆進(jìn)行了化YMD兵D變異夕毒株檢走測(cè)，發(fā)腹現(xiàn)有1舊6例（文57.蒙1%）萍存在Y惹MDD片自然變藍(lán)異毒株差。日本K賭oba婦yas劉hi等蓮檢測(cè)1構(gòu)8例無(wú)栗癥狀H束B(niǎo)V攜素帶者,被發(fā)現(xiàn)5社例YM娘DD變?nèi)萎?占形27.之78%銀。本實(shí)驗(yàn)赤室關(guān)于閥YMD松D自然譯變異餓的2組葛數(shù)據(jù)196例居CHB患絕者中，檢裙出存在Y跳MDD變久異毒株者旅共21例名，檢出率線為10.某7%。其倍中YVD爽D陽(yáng)性2兵0例，Y鄙IDD陽(yáng)召性1例，規(guī)YVDD茂和YID下D同時(shí)陽(yáng)本性者0例抱。183亞