細菌分類鑒定的實驗室技術發(fā)展2021/5/91（一）細菌分類鑒定的指標

1.傳統(tǒng)指標2.分子生物學指標2021/5/921.生物分類的傳統(tǒng)指標形態(tài)特征群體：菌落形態(tài)，在半固體或液體培養(yǎng)基中的生長狀態(tài)等；個體：細胞形態(tài)，染色反應，各種特殊構造等。

從不同層次，用不同學科的技術方法來研究和比較不同微生物的細胞、細胞組分或代謝產(chǎn)物，從中發(fā)現(xiàn)的反映微生物類群特征的資料。2021/5/93生理生化反應營養(yǎng)要求：能源，碳源，氮源，生長因子等；酶：產(chǎn)酶種類和反應特性等；代謝產(chǎn)物：種類，產(chǎn)量，顯色反應等。2021/5/94生態(tài)特性：

生長溫度，對氧的需要，宿主種類等；生活史特點：

在生活史中出現(xiàn)的菌體變化特點及其規(guī)律性；血清學反應：

利用抗原構造上的差別進行鑒定；噬菌體的敏感性；其他2021/5/952.生物分類的分子生物學指標DNARNA2021/5/96染色鏡檢形態(tài)觀察按照標準進行傳統(tǒng)的生化反應鑒定標準化成品鑒定產(chǎn)品（如：API試劑條）

半自動細菌鑒定儀（如：ATBExpression）全自動細菌鑒定儀（如：VITEK2）色譜、光譜分析技術分子生物學技術1.生理生化檢測技術2.色譜、光譜分析技術3.分子生物學技術（二）細菌分類鑒定的實驗室技術2021/5/97人工鑒定培養(yǎng)基的微量化、標準化和商品化數(shù)碼分類鑒定技術（生化反應的數(shù)字化）自動化鑒定技術（生物信息的電腦化）細菌的鑒定和藥敏試驗都實現(xiàn)了自動化1.生理生化檢測技術2021/5/98前期準備增菌劃線分離染色鏡檢血清手工細菌鑒定手工鑒定流程2021/5/99

1）

臨床常見菌的初步分群雙岐索引鑒定

例如：葡萄球菌屬雙岐索引鑒定2021/5/910早在七十年代中期，一些國外公司就研究出借助生物信息編碼鑒定細菌的新方法。這些技術的應用，為醫(yī)學微生物檢驗工作提供了一個簡便、科學的細菌鑒定程序，大大提高了細菌鑒定的準確性。目前，微生物編碼鑒定技術已經(jīng)得到普遍應用，并早已商品化和形成獨特的不同細菌鑒定系統(tǒng)。如API、Micro-ID、RapID、Enterotube和Minitek等系統(tǒng)。這種鑒定系統(tǒng)是自動化鑒定系統(tǒng)的基礎。2）數(shù)碼鑒定法2021/5/911

數(shù)碼鑒定是指通過數(shù)學的編碼技術將細菌的生化反應模式轉(zhuǎn)換成數(shù)學模式，給每種細菌的反應模式賦予一組數(shù)碼,建立數(shù)據(jù)庫或編成檢索本。通過對未知菌進行有關生化試驗并將生化反應結果轉(zhuǎn)換成數(shù)字（編碼），查閱檢索本或數(shù)據(jù)庫，得到細菌名稱。

其基本原理是計算并比較數(shù)據(jù)庫內(nèi)每個細菌條目對系統(tǒng)中每個生化反應出現(xiàn)的頻率總和。數(shù)碼鑒定法基本原理2021/5/912微量生化反應系統(tǒng)Micro-ID系統(tǒng)VP硝酸鹽還原

苯丙氨酸脫羧酶硫化氫吲哚鳥氨酸賴氨酸丙二酸鹽尿素七葉甘ONPG阿拉伯糖側(cè)金盞花醇肌醇三梨醇421421421421421—+—

—+++—

—

—+++—

—

020021400021400

23434相加所得數(shù)字：23434查出相應細菌為：大腸埃希菌項目分值數(shù)碼鑒定法基本原理2021/5/913先將細菌分離純化。做染色形態(tài)觀察、氧化酶、糖發(fā)酵試驗。根據(jù)染色、氧化酶、糖發(fā)酵試驗結果選擇不同的生化反應板進行接種（同一個鑒定系統(tǒng)，配有不同細菌的生化反應板）。培養(yǎng)后，讀取生化反應結果，得到一組數(shù)據(jù)。將這組數(shù)據(jù)查編碼本（即數(shù)據(jù)庫），即得到鑒定結果。實驗方法：數(shù)碼鑒定法基本原理2021/5/9143）自動化的微生物鑒定和藥敏試驗分析系統(tǒng)

細菌數(shù)碼分類技術是細菌自動化鑒定技術的基礎，細菌鑒定自動化是把生化反應數(shù)字化技術進一步電腦化，數(shù)據(jù)庫用電腦管理，結果用電腦分析和鑒定。

鑒定系統(tǒng)的工作原理因不同的儀器和系統(tǒng)而異。不同的細菌對底物的反應不同是生化反應鑒定細菌的基礎，而試驗結果的準確度取決于鑒定系統(tǒng)配套培養(yǎng)基的制備方法、培養(yǎng)物濃度、孵育條件和結果判定等。大多鑒定系統(tǒng)采用細菌分解底物后反應液中pH的變化，色原性或熒光原性底物的酶解，測定揮發(fā)或不揮發(fā)酸，或識別是否生長等方法來分析鑒定細菌。2021/5/915對標本同時進行鑒定與藥敏測試全自動細菌鑒定/藥敏檢測系統(tǒng)2021/5/916檢測流程純培養(yǎng)新鮮平板上挑取菌落制成標準濁度（0.5~0.6麥氏單位）的菌懸液菌液加入肉湯中，倒入檢測板，上機檢測。2021/5/917檢測流程掃描板條，輸入資料，等待鑒定結果。檢測流程2021/5/918挑選菌落樣品制備于樣品盤上菌種鑒定結果未知微生物?

MALDI

BioTyper軟件-數(shù)據(jù)庫分析獲取質(zhì)譜指紋信號以蛋白為基礎的分析方法(Proteinbasedapproach)1.樣品制備2.質(zhì)譜信號3.菌種鑒定2.質(zhì)譜分析的細菌鑒定流程2021/5/919直接涂抹法(DirectTransfer)單一菌種(Pureculture)涂抹單一菌落于樣品盤上(SinglecolonyonMALDI)Target加上1

ml基質(zhì)溶液(Overlaywith1mlHCCAMatrix)90-95%以上的常規(guī)樣品可于此制備法得到鑒定結果步驟1：樣品制備2021/5/9204364.065380.646254.646315.495096.017157.657273.876410.907870.628368.99010002000300040005000Intens.[a.u.]400045005000550060006500700075008000m/z質(zhì)譜圖:多數(shù)為核糖體蛋白(ribosomalproteins)信號大腸桿菌

(E.coli)步驟

2：采集譜圖2021/5/921Calculationofamatchingscorebasedon:RelScore

%matchesofthereferencespectrum (e.g.6/10=0.6)

RelP-Num.

%matchesoftheunknownspectrum (e.g.6/20=0.3)I-Corr.

valueofintensitycorrelationUnknownmicroorganismismatchedagainsteachMainspectruminbiotyperlibrary.Rankingaccordingtomatchingscore,thresholdforIDMSP:MainSpectrumPeaks步驟

3：數(shù)據(jù)庫比對2021/5/922ResultReport|DetectedSpecies|Ranking|actSc|maxSc|RelScore|PNk|PNb|PNm|RelP-Num.|I-Corr.|1000*Pro---------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------Spectrum#12|Ps.mendocinaDSM50017|1|3813|4271|0.89|41|10|83|0.55|0.88|438|Ps.oleovoransB396|2|1671|3450|0.48|14|8|83|0.22|0.39|41|Ps.fluoreszensB340|3|868|4186|0.21|6|7|83|0.11|0.19|4|Ps.veroniiDSM11331|4|847|4250|0.20|5|7|83|0.10|0.14|3|Ps.putidaDSM291|5|374|2821|0.13|3|3|83|0.05|0.12|1|Ps.putidaB401|6|329|2638|0.12|3|2|83|0.05|0.11|1譜圖模式比對進行細菌鑒定2021/5/923得分范圍分數(shù)的解釋2.300-3.000highlyprobablespeciesidentification完全可靠地鑒定到種的水平2.000-2.299securegenusidentification,probablespeciesidentification可靠鑒定到屬的水平，有可能鑒定到種的水平1.700-1.999

probablegenusidentification有可能鑒定到屬的水平0.000-1.699

noreliableidentification沒有可信的鑒定結果微生物鑒定得分及含義2021/5/92425MALDIBiotyper

1樣品

~5分鐘96樣品(整盤)~30分鐘生化反應測試鑒定法8小時–數(shù)天CanIidentifymicroorganisms

fast

?2021/5/925Acetobacteracetisubsp.acetiAcetobacterpasteurianussubsp.lovaniensisAcetobacterpasteurianussubsp.pasteurianusActinomaduraaurantiacaActinomaduralibanoticaActinomaduralividaAgrobateriumtumefaciensArthrobacterglobiformisArthrobacteroxydansArthrobacterpyridinolisArthrobactersulfureusBacillusalcalophilusBacilluscohniiBacillussphaericusBrevibacillusbrevisBrevibacteriumlinensCellulomonasflavigenaCellulomonasturbataCorynebacteriumglutamicumComamonastestosteroniiGluconobacteroxydanssubsp.oxydansGluconobacteroxydanssubsp.oxydansGordoniaamaraeGordoniarubropertinctaGordoniaterraeHalomonasdenitrificansHalomonaselongataHalomonaselongataHalomonashalmophilaHalomonashalmophilaHydrogenophagaflavaHydrogenophagapseudoflavaMethylobacteriummesophilicumMethylobacteriumorganophilumMethylobacteriumradiotoleransMethylobacteriumrhodesianumParacoccusversutusParacoccusversutusPseudomonasbalearicaPseudomonasfluorescensPseudomonasfluorescensPseud