關(guān)于大腸菌群測(cè)定第1頁(yè)，課件共23頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月大腸菌群的定義

大腸菌群：一群在37℃，經(jīng)24h能發(fā)酵乳糖，并產(chǎn)酸產(chǎn)氣，需氧或兼性厭氧生長(zhǎng)的革蘭氏陰性的無(wú)芽孢桿菌。

其中包括有大腸桿菌（也稱(chēng)大腸埃希氏菌）、腸桿菌屬、枸櫞酸菌屬、克雷伯氏菌屬中的一部分和沙門(mén)氏菌屬的第Ⅲ亞屬。P139第2頁(yè)，課件共23頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月大腸桿菌的定義大腸桿菌指革蘭氏陰性無(wú)芽孢桿菌、乳糖發(fā)酵產(chǎn)酸產(chǎn)氣、IMViC試驗(yàn)（靛基質(zhì)、MR、V-P、檸檬酸鹽試驗(yàn)）為++--或-+--的細(xì)菌。大腸桿菌（也稱(chēng)大腸埃希氏菌），分類(lèi)于腸桿菌科，歸屬于埃希氏菌屬。與人類(lèi)有關(guān)的大腸桿菌統(tǒng)稱(chēng)為致瀉性大腸桿菌，包括五種：腸毒素性大腸桿菌（ETEC）、致病性大腸桿菌（EPEC）、出血性大腸桿菌（EHEC）、侵襲性大腸桿菌（EIEC）、黏附性大腸桿菌（EAEC）。第3頁(yè)，課件共23頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月大腸菌群和大腸桿菌的關(guān)系耐熱大腸菌群的定義：能在液體乳糖培養(yǎng)基中35/37℃培養(yǎng)48h產(chǎn)酸產(chǎn)氣，并在44.5℃培養(yǎng)24h產(chǎn)酸產(chǎn)氣的細(xì)菌（依據(jù)ISO標(biāo)準(zhǔn)）第4頁(yè)，課件共23頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月衛(wèi)生學(xué)意義大腸菌群和大腸桿菌作為食品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)的意義在于，是評(píng)價(jià)衛(wèi)生質(zhì)量的重要指標(biāo)，作為食品中的糞便污染指標(biāo)。另外，腸道致病菌如沙門(mén)氏菌屬和志賀氏菌屬等，對(duì)食品安全性威脅很大。經(jīng)常檢驗(yàn)致病菌有一定困難。而食品中的大腸菌群較容易檢出，腸道致病菌與大腸菌群的來(lái)源相同，而且在一般條件下大腸菌群在外環(huán)境中生存時(shí)間也與主要腸道致病菌一致．所以大腸菌群的另一重要食品衛(wèi)生意義是作為腸道致病菌污染食品的指示菌．大腸菌群數(shù)的高低，表明了糞便污染的程度，也反映了對(duì)人體健康危害性的大小。第5頁(yè)，課件共23頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月大腸桿菌的生物學(xué)特性基本形態(tài)：

此菌為兩端鈍圓的短小桿菌，一般約0.5-0.8μm*1.0-3.0μm，多單獨(dú)存在或成雙，但不呈長(zhǎng)鏈排列。約50%的菌株有周生鞭毛，但多數(shù)只有1-4根，一般不超過(guò)10根，故菌體動(dòng)力弱。多數(shù)菌株有菌毛，有的有莢膜或微莢膜，不形成芽孢，對(duì)普通堿性染料著色良好，革蘭氏染色陰性。第6頁(yè)，課件共23頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月大腸桿菌的生物學(xué)特性培養(yǎng)特性：大腸桿菌合成代謝能力強(qiáng)，在含無(wú)機(jī)鹽、銨鹽、葡萄糖的普通培養(yǎng)基上生長(zhǎng)良好。最適生長(zhǎng)溫度為37℃，在42-44℃條件下仍能生長(zhǎng)，生長(zhǎng)溫度范圍15-46℃。

在普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂上有3種菌落形態(tài)：

1）光滑型：菌落邊緣整齊，表面有光澤、濕潤(rùn)、光滑、呈灰色，在生理鹽水中易分散；

2）粗糙型：菌落扁平、干澀、邊緣不整齊，易在生理鹽水中自凝；

3）黏液型：常為含有莢膜的菌株。第7頁(yè)，課件共23頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月 食品中大腸菌群數(shù)是以每100mL（g）檢樣內(nèi)大腸菌群最近似數(shù)（MPN）表示。大腸菌群數(shù)的定義第8頁(yè)，課件共23頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月P142第9頁(yè)，課件共23頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月

GB/T4789.3-2010大腸菌群

初發(fā)酵復(fù)發(fā)酵24±2h~48±2h大腸菌群MPN計(jì)數(shù)法操作步驟第10頁(yè)，課件共23頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月實(shí)驗(yàn)材料檢測(cè)樣品：奶粉設(shè)備和材料：恒溫培養(yǎng)箱、天平、搖床、無(wú)菌移液管（1ml）、無(wú)菌錐形瓶、無(wú)菌試管、小倒管、精密pH試紙培養(yǎng)基和試劑：LST肉湯、BGLB肉湯、無(wú)菌生理鹽水、1mol/LNaOH、1mol/LHCl第11頁(yè)，課件共23頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月實(shí)驗(yàn)步驟：前期準(zhǔn)備每個(gè)小組準(zhǔn)備器材：移液管1mlX6、10mlX2、錐形瓶500mlX2、試管X14準(zhǔn)備試劑：配制：LST肉湯（1000ml）和BGLB肉湯生理鹽水（500ml）

第12頁(yè)，課件共23頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月相關(guān)配方第13頁(yè)，課件共23頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月相關(guān)配方生理鹽水：8.5g+1000ml蒸餾水（一錐形瓶瓶裝225ml，剩下的裝在另外一個(gè)錐形瓶中）第14頁(yè)，課件共23頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月將相關(guān)玻璃儀器進(jìn)行滅菌前包裝將配制好的LST肉湯加入試管中（注意1），然后小心將小倒管放入肉湯中（注意2）（每組10支）將所有東西包扎好放入滅菌鍋中滅菌20min實(shí)驗(yàn)步驟：前期準(zhǔn)備第15頁(yè)，課件共23頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月實(shí)驗(yàn)步驟：檢樣稀釋稱(chēng)取25g樣品→加入225ml生理鹽水中→搖床勻質(zhì)→制成1:10樣品勻液取一支無(wú)菌試管+9ml生理鹽水→+1ml1:10樣品→制成1:100稀釋液如2方法制成1:1000稀釋液（注意3）分別標(biāo)注好標(biāo)號(hào)第16頁(yè)，課件共23頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月實(shí)驗(yàn)步驟：初發(fā)酵用1ml無(wú)菌移液管分別吸取3個(gè)稀釋度的稀釋樣品至LST肉湯發(fā)酵試管中（每一稀釋度3管）加好后塞好試管塞，放進(jìn)培養(yǎng)箱培養(yǎng)24-48h第17頁(yè)，課件共23頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月實(shí)驗(yàn)步驟：復(fù)發(fā)酵將LTS發(fā)酵管取出，觀(guān)察倒管是否有氣泡，將初發(fā)酵產(chǎn)氣的管數(shù)種類(lèi)進(jìn)行記錄注意：在發(fā)酵試驗(yàn)工作中，經(jīng)?？梢钥吹皆诎l(fā)酵倒管內(nèi)極微少的氣泡（有時(shí)比小米粒還?。?，有時(shí)可以遇到在初發(fā)酵時(shí)產(chǎn)酸或沿管壁有緩緩上浮的小氣泡。實(shí)驗(yàn)表明，大腸菌群的產(chǎn)氣量，多者可以使發(fā)酵倒管全部充滿(mǎn)氣體，少者可以產(chǎn)生比小米粒還小的氣泡。如果對(duì)產(chǎn)酸但未產(chǎn)氣的乳糖發(fā)酵如有疑問(wèn)時(shí)，可以用手輕輕打動(dòng)試管，如有氣泡沿管壁上浮，即應(yīng)考慮可能有氣體產(chǎn)生，而應(yīng)作進(jìn)一步試驗(yàn)。

第18頁(yè)，課件共23頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月實(shí)驗(yàn)步驟：復(fù)發(fā)酵與結(jié)果準(zhǔn)備BGLB肉湯發(fā)酵管（分裝、滅菌等）用接種環(huán)接一環(huán)產(chǎn)氣的LTS發(fā)酵管至BGLB發(fā)酵管中，并記號(hào)放進(jìn)培養(yǎng)箱培養(yǎng)48h取出觀(guān)察倒管是否產(chǎn)氣，如果兩種發(fā)酵管均產(chǎn)氣則證實(shí)為大腸菌群陽(yáng)性，并根據(jù)管數(shù)查MPN檢測(cè)表（P142-143），得出MPN值第19頁(yè)，課件共23頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月大腸菌群測(cè)定——MPN法檢驗(yàn)幾點(diǎn)說(shuō)明MPN檢索表：

MPN為最大可能數(shù)(MostProbableNumber)的簡(jiǎn)稱(chēng)。這種方法，對(duì)樣品進(jìn)行連續(xù)系列稀釋?zhuān)尤肱囵B(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，從規(guī)定的反應(yīng)呈陽(yáng)性管數(shù)的出現(xiàn)率，用概率論來(lái)推算樣品中菌數(shù)最近似的數(shù)值。MPN檢索表只給了三個(gè)稀釋度，如改用不同的稀釋度，則表內(nèi)數(shù)字應(yīng)相應(yīng)降低或增加10倍。第20頁(yè)，課件共23頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月初發(fā)酵和證實(shí)試驗(yàn)：

1）兩步法進(jìn)行了兩次乳糖發(fā)酵試驗(yàn)。初發(fā)酵和證實(shí)實(shí)驗(yàn)所用培養(yǎng)基不同，但都是為了證實(shí)培養(yǎng)物是否符合大腸菌群的定義，即“在37℃分解乳糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣”。LST中提供了磷酸鹽緩沖體系，氯化鈉可維持滲透壓，月桂基硫酸鈉可抑制非大腸菌群的生長(zhǎng)，這個(gè)緩沖蛋白胨乳糖肉湯允許“緩慢乳糖發(fā)酵（Slowlactosefermentations）”來(lái)促進(jìn)菌體產(chǎn)氣。BGLB中膽鹽和煌綠可以抑制革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌和除了大腸菌群的很多革蘭氏陰性細(xì)菌。

2）初發(fā)酵陽(yáng)性管，不能肯定就是大腸菌群細(xì)菌，經(jīng)過(guò)證實(shí)試驗(yàn)后，有時(shí)可能成為陰性。有數(shù)據(jù)表明，食品中大腸菌群檢驗(yàn)步驟的符合率，初發(fā)酵與證實(shí)試驗(yàn)相差較大。因此，在實(shí)際檢測(cè)工作中，證實(shí)試驗(yàn)是必需的。大腸菌群測(cè)定——MPN法檢驗(yàn)