細(xì)胞電生理學(xué)與膜片鉗技術(shù)詳解演示文稿目前一頁\總數(shù)四十一頁\編于十六點（優(yōu)選）細(xì)胞電生理學(xué)與膜片鉗技術(shù)目前二頁\總數(shù)四十一頁\編于十六點

1991Nobel基金會的頒獎評語：膜片鉗技術(shù)點燃了細(xì)胞和分子水平的生理學(xué)研究的革命之火，為細(xì)胞生理學(xué)的研究帶來了一場革命性的變化，它和基因克隆技術(shù)并駕齊驅(qū)，給生命科學(xué)研究帶來了巨大的前進(jìn)動力。目前三頁\總數(shù)四十一頁\編于十六點2、膜片鉗技術(shù)及其應(yīng)用3、離子通道藥理學(xué)1、細(xì)胞電生理學(xué)OUTLINE目前四頁\總數(shù)四十一頁\編于十六點

細(xì)胞電生理學(xué)Electrophysiology細(xì)胞生理學(xué)：揭示細(xì)胞的生理過程，用電生理方法記錄生物電活動測量離子、離子通道細(xì)胞興奮生物電信號細(xì)胞生理學(xué)目前五頁\總數(shù)四十一頁\編于十六點膜的“流動鑲嵌模型”細(xì)胞膜和離子學(xué)說建立（Hodgkin，etal.1946年）目前六頁\總數(shù)四十一頁\編于十六點磷脂雙層的屏蔽作用目前七頁\總數(shù)四十一頁\編于十六點Na-K泵目前八頁\總數(shù)四十一頁\編于十六點

[K+]o<<[K+]i [Na+]o>>[Na+]i離子的跨膜分布目前九頁\總數(shù)四十一頁\編于十六點目前十頁\總數(shù)四十一頁\編于十六點離子通道

(ionchannels)

離子通道是細(xì)胞膜上的一種特殊整合蛋白，對某些離子（K+、Na+、Ca2+等）能選擇通透，其功能是細(xì)胞生物電活動的基礎(chǔ)。

特性：通透性（permeation）選擇性（selectivity）門控性（gating）

研究技術(shù)：膜片鉗技術(shù)和分子克隆技術(shù)目前十一頁\總數(shù)四十一頁\編于十六點配體門控通道陽離子通道：乙酰膽堿、谷氨酸、五羥色胺受體陰離子通道：甘氨酸和γ－氨基丁酸受體

通道蛋白——離子通道乙酰膽堿受體

目前十二頁\總數(shù)四十一頁\編于十六點電壓門控通道：鉀、鈉、鈣離子通道

通道蛋白——離子通道電壓門控鉀離子通道

目前十三頁\總數(shù)四十一頁\編于十六點環(huán)核苷酸門控通道

氣味分子與G蛋白偶聯(lián)型受體結(jié)合，激活腺苷酸環(huán)化酶，產(chǎn)生cAMP，開啟cAMP門控陽離子通道（cAMP-gatedcationchannel），引起鈉離子內(nèi)流，膜去極化，產(chǎn)生神經(jīng)沖動，最終形成嗅覺或味覺。

機(jī)械門控通道一類是牽拉活化或失活的離子通道，另一類是剪切力敏感的離子通道，前者幾乎存在于所有的細(xì)胞膜，研究較多的有血管內(nèi)皮細(xì)胞、心肌細(xì)胞以及內(nèi)耳中的毛細(xì)胞等，后者僅發(fā)現(xiàn)于內(nèi)皮細(xì)胞和心肌細(xì)胞

水通道2003年諾貝爾化學(xué)獎：PeteAgre、RoderickMacKinnon

通道蛋白——離子通道目前十四頁\總數(shù)四十一頁\編于十六點2、膜片鉗技術(shù)及其應(yīng)用3、離子通道藥理學(xué)1、細(xì)胞電生理學(xué)OUTLINE目前十五頁\總數(shù)四十一頁\編于十六點電生理學(xué)研究簡史：

二千年前，觀察到電鰩魚放電現(xiàn)象。1825年，Nobili發(fā)明了電流計，用其證實了肌肉有電流存在。1912年，Bridge確定了AP的“全或無”現(xiàn)象。同年，Oxford提出了突觸的概念及反射弧的生理學(xué)研究，獲1932年Nobel獎。目前十六頁\總數(shù)四十一頁\編于十六點1937年，Hodgkin和Huxley在槍烏賊巨大神經(jīng)軸突細(xì)胞內(nèi)實現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)電記錄，獲1963年Nobel獎。1946年，凌寧和Gerard創(chuàng)造拉制出尖端直徑小于1μm的玻璃微電極，并記錄了骨骼肌的電活動。玻璃微電極的應(yīng)用使的電生理研究進(jìn)行了革命性的變化。Voltageclamp（電壓鉗技術(shù)）由Cole和Marmont發(fā)明，并很快由Hodgkin和Huxley完善，真正開始了定量研究，建立了H－H模型（膜離子學(xué)說),是近代興奮學(xué)說的基石。目前十七頁\總數(shù)四十一頁\編于十六點1948年，Katz利用細(xì)胞內(nèi)微電極技術(shù)記錄到了終板電位；1969年，又證實N－M接觸后的Ach以“量子式”釋放，獲1976年Nobel獎。1976年，德國的Neher和Sakmann發(fā)明PatchClamp（膜片鉗）。并在蛙橫紋肌終板部位記錄到乙酰膽堿引起的通道電流。1980年，Sigworth、Hamill、Neher等在記錄電極內(nèi)施加負(fù)壓吸引，得到了10~100GΩ的高阻封接(gigaseal)，大大降低記錄噪聲，實現(xiàn)了單根電極既鉗制膜電位又記錄單通道電流。獲1991年Nobel獎。目前十八頁\總數(shù)四十一頁\編于十六點

HistoryofIonChannelStudy1955年，Hodgkin和Keens應(yīng)用電壓鉗(Voltageclamp)在研究神經(jīng)軸突膜對鉀離子通透性時發(fā)現(xiàn)，放射性鉀跨軸突膜的運動很像是通過許多狹窄空洞的運動，并提出了“通道”的概念。1963年，描述電壓門控動力學(xué)的Hodgkin-Huxley模型（簡稱H-H模型），榮獲諾貝爾醫(yī)學(xué)/生理學(xué)獎。1976年，Neher和Sakmann建立膜片鉗(Patchclamp)技術(shù)。1983年10月，《Single-ChannelRecording》一書問世，奠定了膜片鉗技術(shù)的里程碑。1991年，Neher和Sakmann的膜片鉗技術(shù)榮獲諾貝爾醫(yī)學(xué)/生理學(xué)獎。目前十九頁\總數(shù)四十一頁\編于十六點1963年諾貝爾生理學(xué)/醫(yī)學(xué)獎

發(fā)現(xiàn)了神經(jīng)細(xì)胞膜的周邊和中央部分與興奮和抑制有關(guān)的離子機(jī)制艾克爾斯SirJohnCarewEccles澳大利亞澳大利亞國家大學(xué)1903年--1997年霍奇金AlanLloydHodgkin英國英國劍橋大學(xué)1914年--1998年赫克斯利AndrewFieldingHuxley英國英國倫敦大學(xué)1917年--目前二十頁\總數(shù)四十一頁\編于十六點TheNobelPrizeinPhysiologyorMedicine(1991)

ErwinNeherBertSakmann

1/2oftheprize

1/2oftheprizeFederalRepublicofGermanyFederalRepublicofGermanyMax-Planck-InstitutfürBiophysikalischeChemie,Goettingen,FederalRepublicofGermanyMax-Planck-InstitutfürmedizinischeForschung,Heidelberg,FederalRepublicofGermanyb.1944b.1942目前二十一頁\總數(shù)四十一頁\編于十六點膜片鉗技術(shù)膜片鉗技術(shù)：從一小片(約幾平方微米)膜獲取電子學(xué)方面信息的技術(shù)，即保持跨膜電壓恒定——電壓鉗位，從而測量通過膜離子電流大小的技術(shù)。通過研究離子通道的離子流，從而了解離子運輸、信號傳遞等信息。目前二十二頁\總數(shù)四十一頁\編于十六點基本原理利用負(fù)反饋電子線路,將微電極尖端所吸附的一個至幾個平方微米的細(xì)胞膜的電位固定在一定水平上,對通過通道的微小離子電流作動態(tài)或靜態(tài)觀察,從而研究其功能。目前二十三頁\總數(shù)四十一頁\編于十六點膜片鉗技術(shù)實現(xiàn)膜電位固定的關(guān)鍵是在玻璃微電極尖端邊緣與細(xì)胞膜之間形成高阻（10ＧΩ）密封,使電極尖端開口處相接的細(xì)胞膜片與周圍環(huán)境在電學(xué)上隔離,并通過外加命令電壓鉗制膜電位。目前二十四頁\總數(shù)四十一頁\編于十六點由于玻璃微電極尖端管徑很小,其下膜面積僅約1μｍ2,離子通道數(shù)量很少,一般只有一個或幾個通道,經(jīng)這一個或幾個通道流出的離子數(shù)量相對于整個細(xì)胞來講很少,可以忽略,也就是說電極下的離子電流對整個細(xì)胞的靜息電位的影響可以忽略,那么,只要保持電極內(nèi)電位不變,則電極下的一小片細(xì)胞膜兩側(cè)的電位差就不變,從而實現(xiàn)電位固定。目前二十五頁\總數(shù)四十一頁\編于十六點膜片鉗技術(shù)的優(yōu)點膜片鉗技術(shù)實現(xiàn)了小片膜的孤立和高阻封接的形成，由于高阻封接使背景噪聲水平大大降低，相對地增寬了記錄頻帶范圍，提高了分辨率。另外,它還具有良好的機(jī)械穩(wěn)定性和化學(xué)絕緣性。而小片膜的孤立使對單個離子通道進(jìn)行研究成為可能。目前二十六頁\總數(shù)四十一頁\編于十六點膜片鉗記錄的各種模式根據(jù)膜片與電極之間的關(guān)系，可將膜片記錄主要分為４種模式。首先建立的單通道記錄法（Singlechannelrecording）是細(xì)胞吸附式，其后又建立了膜內(nèi)面向外和膜外面向外的模式；還有一種是全細(xì)胞記錄法（Ｗholecellrecording）的全細(xì)胞式。現(xiàn)在又發(fā)展了開放的細(xì)胞吸附式膜內(nèi)面向外和穿孔囊泡膜外面向外的模式，以及穿孔膜片的模式。目前二十七頁\總數(shù)四十一頁\編于十六點目前二十八頁\總數(shù)四十一頁\編于十六點Patchclamp-wholecell目前二十九頁\總數(shù)四十一頁\編于十六點目前三十頁\總數(shù)四十一頁\編于十六點細(xì)胞吸附膜片

(cell-attachedpatchmode)一種將微電極吸附在細(xì)胞膜上對單離子通道電流進(jìn)行記錄的模式。優(yōu)點是不破壞細(xì)胞的完整性,內(nèi)環(huán)境保持正常。缺點是不能人為直接地控制細(xì)胞內(nèi)環(huán)境條件，不能確切判明細(xì)胞內(nèi)電位。即使在浴液中加入刺激物質(zhì)，也不能到達(dá)與電極內(nèi)液接觸的膜片的細(xì)胞外面。但是，如果膜片離子通道對浴液中的刺激物有反應(yīng)，則可以說明這種刺激物是經(jīng)過某些細(xì)胞內(nèi)第二信使的介導(dǎo)間接地起作用。目前三十一頁\總數(shù)四十一頁\編于十六點內(nèi)面向外膜片

(inside-outpatch)在細(xì)胞吸附模式高阻封接形成后,將微管電極提起,使吸附的膜片從胞體上被切割下來，就得到“內(nèi)面向外”膜片。此種模式，可直接且自由地經(jīng)浴液介導(dǎo)而調(diào)控細(xì)胞內(nèi)液的條件，并可在和細(xì)胞活動無關(guān)的形式下觀察到單一離子通道的活動。但是，由于胞質(zhì)滲漏，可能丟失某種通道調(diào)控因子，離子通道活動出現(xiàn)run-down（或run-up）現(xiàn)象。目前三十二頁\總數(shù)四十一頁\編于十六點全細(xì)胞記錄式

(Ｗhole-cellrecording)在細(xì)胞吸附模式下繼續(xù)以負(fù)壓抽吸使電極管內(nèi)細(xì)胞膜破裂,電極胞內(nèi)液與胞內(nèi)液直接相通,而與浴槽液絕緣,這種形式記錄膜片以外部位的全細(xì)胞膜的離子電流。它既可記錄膜電位又可記錄膜電流。其中膜電位可在電流鉗情況下記錄,或?qū)⒉９苓B到標(biāo)準(zhǔn)高阻微電極放大器上記錄。目前三十三頁\總數(shù)四十一頁\編于十六點外面向外膜片

(outside-outpatch)在全細(xì)胞模式上將微管電極向上提起,可得到切割分離的膜片，斷端游離部分自行融合成脂質(zhì)雙層,此時高阻封接仍然存在。而膜外側(cè)面接觸浴槽液。用這種模式，可自由改變細(xì)胞外液的情況下，記錄單一離子通道的電流活動。目前三十四頁\總數(shù)四十一頁\編于十六點開放細(xì)胞吸附膜內(nèi)面向外模式（opencell-attachedinside-outmode）將細(xì)胞吸附式的膜片以外的某部位的胞膜進(jìn)行機(jī)械地破壞，經(jīng)破壞孔調(diào)控細(xì)胞內(nèi)液，并在細(xì)胞吸附狀態(tài)下進(jìn)行內(nèi)面向外的單一離子通道記錄。這種方法的細(xì)胞體積越大，破壞部位離被吸附膜片越遠(yuǎn)或破壞孔越小，都可導(dǎo)致細(xì)胞因子外流變慢。目前三十五頁\總數(shù)四十一頁\編于十六點穿孔膜片模式

（perforatedpatchmode）為克服全細(xì)胞模式的胞質(zhì)滲漏問題，Horn和Marty將與離子親和的制霉菌素（或二性霉素Ｂ）經(jīng)膜片微電極灌流到含類甾醇的細(xì)胞膜片上，形成只允許一價離子通過的孔，用此法在膜片上做很多導(dǎo)電性孔道借此對全細(xì)胞膜電流進(jìn)行記錄。因為此模式的胞質(zhì)滲漏極為緩慢，局部串聯(lián)阻抗較全細(xì)胞模式高，所以鉗制速度很慢，故也稱為緩慢全細(xì)胞模式。目前三十六頁\總數(shù)四十一頁\編于十六點穿孔囊泡膜外面向外模式(perforatedvesicleoutside-outmode)穿孔膜片模式將電極向上提起，便在微電極尖端處形成一個膜囊泡（膜內(nèi)面向外膜片斷端融合封閉而成）。如果條件較好，此膜囊泡內(nèi)不僅有細(xì)胞質(zhì)因子還可有線粒體等細(xì)胞器存在。所以在有比較接近正常的細(xì)胞內(nèi)信號傳遞條件和代謝條件的基礎(chǔ)上，可能記錄到膜外面向外模式的單一離子通道。目前三十七頁\總數(shù)四十一頁\編于十六點過去認(rèn)為，膜片鉗只能在培養(yǎng)細(xì)胞或酶解的細(xì)胞上進(jìn)行，這樣得到的細(xì)胞膜表面比較光滑，才能夠形成高阻封接，但缺點是組織的正常三維結(jié)構(gòu)被破壞，并且對神經(jīng)中樞內(nèi)突觸特有的傳遞機(jī)能的研究無法展開。于是，一些學(xué)者建立了組織切片膜片鉗技術(shù)（Slicepatch），就能在哺乳動物腦片制備上做全細(xì)胞記錄。組織切片膜片鉗技術(shù)（Slicepatch）目前三十八頁\總數(shù)四十一頁\編于十六點1992年，在腦片膜片鉗技術(shù)上，美國Ferster實驗室首次報道在在體貓