淺論丹參提取液對HMGB1胞外釋放的抑制作用【摘要】目的：研究丹參對內(nèi)毒素脂多糖激活后巨噬細胞高遷移率族蛋白B1釋放和內(nèi)毒素血癥小鼠血清HMGB1水平的影響。方法：使用不同濃度的丹參提取液處理100ng/mlLPS激活的培養(yǎng)巨噬細胞株RAW，觀察培養(yǎng)上清液中HMGB1水平和細胞HMGB1mRNA表達的變化，并通過腹腔內(nèi)注射LPS建立的內(nèi)毒素血癥小鼠模型，觀察丹參提取液對內(nèi)毒素血癥小鼠血清HMGB1水平和存活率的影響。細胞培養(yǎng)上清液和血清HMGB1含量采用酶聯(lián)免疫分析方法檢測，細胞HMGB1mRNA表達采用RTPCR方法檢測。結果：丹參提取液明顯抑制LPS激活后的巨噬細胞HMGB1釋放和HMGB1mRNA表達，降低內(nèi)毒素血癥小鼠血清HMGB1水平并提高存活率。結論：丹參有抑制巨噬細胞HMGB1釋放和保護內(nèi)毒素血癥小鼠的作用。

【關鍵詞】丹參；高遷移率族蛋白B1；巨噬細胞；內(nèi)毒素血癥

［Abstract］Objective:TostudytheeffectsofSalviamiltiorrhizaonthereleaseofhighmobilitygroupbox1(HMGB1)fromendotoxinstimulatedmacrophagesandserumHMGB1levelofendotoxemiamice.Methods：HMGB1concentrationintheculturemediumandexpressionofHMGB1mRNAwereanalysedbyenzymelinkedimmunosorbentassayandRTPCR,respectively,after100ng/mllipopolysaccharide(LPS)stimulatedmacrophagelikeRAWcellsweretreatedwithdifferentdosesofSalviamiltiorrhizaextract.Inaddition,theeffectofSalviamiltiorrhizaextractwasinvestigatedonserumHMGB1levelandsurvivalrateofendotoxemiamicewhichwereestablishedbyintraperitonealinjectionofLPS.Results：SalviamiltiorrhizaextractmarkedlysuppressedthereleaseofHMGB1andexpressionofHMGB1mRNAinLPSstimulatedmacrophages,anddecreasedserumHMGB1levelofendotoxemiamicewiththesurvivalrateelevated.Conclusion：SalviamiltiorrhizasuppressedextracellularreleaseofHMGB1inendotoxinstimulatedmacrophages,andconferredprotectionagainstendotoxinlethality.

［Keywords］Salviamiltiorrhiza;highmobilitygroupbox1;macrophages;endotoxemia

胞外高遷移率族蛋白B1為近年發(fā)現(xiàn)的一種晚期炎癥介質(zhì)，在膿毒癥、關節(jié)炎、肺炎、急性胰腺炎等疾病的發(fā)病機制中起著十分重要的作用［1-4］。鑒于HMGB1在諸多炎癥性疾病病理中的重要性，HMGB1靶向治療研究已引起廣泛重視［3,4］。丹參(Salviamiltiorrhiza)為唇形科鼠尾草屬植物的干燥根及根莖，具有活血通經(jīng)、涼血消腫、祛癰腫丹毒之功效［5,6］。我們在篩選中藥抗HMGB1成分研究中發(fā)現(xiàn)丹參提取液具有明顯抑制巨噬細胞HMGB1釋放和保護內(nèi)毒素血癥小鼠的作用，現(xiàn)報告如下。

1材料與方法

實驗材料

BALB/c小鼠由江蘇省血吸蟲病防治研究所提供；丹參購自甘肅天水藥材供應站(經(jīng)無錫市人民醫(yī)院許英華主任藥師鑒定)；巨噬細胞株RAW購自中國科學院細胞庫。內(nèi)毒素脂多糖為Sigma公司產(chǎn)品，mRNA提取試劑盒為Promega公司產(chǎn)品，MMLV一步法RTPCR試劑盒為上海捷瑞公司產(chǎn)品。

方法

丹參提取液的制備

丹參經(jīng)純水漂洗后，水煎2次，合并2次水煎液，μm過濾器過濾并調(diào)整濃度至1g/ml(按生藥計算)。

HMGB1濃度測定

采用酶聯(lián)免疫分析方法。小鼠HMGB1ELISA試劑盒為武漢中美科技有限公司產(chǎn)品，按產(chǎn)品使用說明書進行。

HMGB1mRNA表達檢測

應用mRNA提取試劑盒，在細胞培養(yǎng)皿中直接裂解細胞mRNA。HMGB1引物：5′ATGGGCAAAGGAGATCCTA3′，5′ATTCATCATCATCATCTTCT3′。以三磷酸甘油醛脫氫酶作為內(nèi)參對照，引物：5′TCCCTCAAGATTGTCAGCAA3′，5′AGATCCACAACGGATACATT3′。HMGB1mRNA表達水平以HMGB1與GADPH基因擴增條帶光密度比值表示。

培養(yǎng)細胞實驗

巨噬細胞株RAW使用含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液在37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，隔天傳代1次。細胞貼壁覆蓋80%～90%時進行實驗。以LPS組和丹參處理組各25只，后者于注射LPS后0，24，48，72h以15g/kg劑量給小鼠腹腔內(nèi)注射丹參提取液，觀察小鼠存活情況。

統(tǒng)計學方法

采用SPSS統(tǒng)計軟件包進行雙側t檢驗分析和χ2檢驗分析，為差異有統(tǒng)計學意義。

2結果

丹參提取液對巨噬細胞HMGB1釋放的作用

丹參提取液明顯抑制LPS激活后巨噬細胞株RAWHMGB1的釋放，并呈劑量相關性，見表1。表1丹參提取液對巨噬細胞株RAW培養(yǎng)上清液中HMGB1水平的影響，Tab1EffectofSalviamiltiorrhizaextractonHMGB1levelintheculturemediumofmacrophagelikeRAWcells。

丹參提取液對巨噬細胞HMGB1mRNA表達的影響

巨噬細胞株RAW受LPS激活20h后HMGB1mRNA表達顯著升高，而丹參提取液對其表達具有明顯抑制作用,見圖1。

丹參提取液對內(nèi)毒素血癥小鼠血清HMGB1水平和存活率的影響

丹參提取液對內(nèi)毒素血癥小鼠有明顯的保護作用，96h后小鼠存活率由32%提高至64%,見圖2。同時，丹參提取液明顯降低了內(nèi)毒素血癥小鼠血清HMGB1水平,見表2。表2丹參提取液對內(nèi)毒素血癥小鼠血清HMGB1水平的影響,Tab2EffectofSalviamiltiorrhizaextractonserumHMGB1levelofendotoxemiamice

3討論

高遷移率族蛋白因其在聚丙烯酰胺凝膠電泳中的高遷移能力而得名，包括HMGA，HMGB，HMGN3個家族,而HMGB家族有3個成員即HMGB1，HMGB2，HMGB3。HMGB1作為核內(nèi)一種典型的非組蛋白,長期以來的研究主要集中在其核內(nèi)功能，包括參與核小體的構建和穩(wěn)定，調(diào)節(jié)基因的轉(zhuǎn)錄、參與DNA的重組修復和復制等。1999年，Wang等［7］發(fā)現(xiàn)HMGB1可通過活化細胞的主動分泌釋放到胞外并介導炎癥反應，為內(nèi)毒素血癥和膿毒癥的重要炎癥介質(zhì)，隨后胞外HMGB1的致炎作用引起廣泛興趣和重視。近年來的研究［1-4］證實,胞外HMGB1為一種重要的炎癥介質(zhì)和致炎細胞因子，參與多種疾病如膿毒癥、關節(jié)炎、急性胰腺炎、肺炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、腦膜炎、腎臟疾病、心血管疾病等的發(fā)病過程。目前，HMGB1靶向治療研究已引起人們關注，而HMGB1靶向治療的關鍵是研發(fā)有效的HMGB1拮抗劑。

目前已發(fā)現(xiàn)有HMGB1拮抗作用的有抗HMGB1抗體、HMGB1Abox蛋白和丙酮酸乙酯等［4,7］。中國使用中藥歷史悠久、資源豐富，中藥對許多疾病具有明顯的療效，世界各國對中藥的研究和應用也日趨重視,但對中藥及其有效成分的抗HMGB1作用研究甚少。本課題組在嚴重急性呼吸綜合征暴發(fā)期間，曾對國內(nèi)治療SARS的幾種主要中藥配方進行抗HMGB1作用的實驗研究，發(fā)現(xiàn)這些中藥配方具有明顯抑制巨噬細胞株RAW和人外周血單核細胞的HMGB1釋放作用，并提出HMGB1參與SARS的發(fā)病機制［8］。最近，Chen等［9］和Li等［10］研究發(fā)現(xiàn)綠茶提取物和綠茶主要成分表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)具有抑制HMGB1釋放的作用，后者可明顯提高膿毒癥小鼠的存活率。

丹參是最常用的活血化瘀中藥之一，在《神農(nóng)本草經(jīng)》中被列為上品，現(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)丹參具有保護心臟缺血缺氧、改善微循環(huán)、抑制血小板聚集和血栓形成、中樞鎮(zhèn)靜、抗氧化、抗菌消炎及增強免疫功能等作用［5］。本研究顯示，丹參提取液對內(nèi)毒素致巨噬細胞HMGB1釋放具有明顯的抑制作用，其作用機制與抑制細胞HMGB1基因表達有關，但其信號轉(zhuǎn)導過程值得進一步研究。動物實驗結果顯示，丹參提取液能明顯降低內(nèi)毒素血癥小鼠血清HMGB1水平，同時能提高內(nèi)毒素血癥小鼠的存活率。鑒于胞外HMGB1為內(nèi)毒素血癥致死的重要炎癥介質(zhì)，丹參提取液可能通過抑制細胞HMGB1釋放、降低血清HMGB1水平而阻止內(nèi)毒素血癥的發(fā)展和惡化。徐鑫榮等［11］報道，丹參注射液能改善內(nèi)毒素休克兔的心、肝、肺功能，減輕全身炎癥反應及部分臟器病理損害，丹參注射液對內(nèi)毒素休克多器官損傷的保護作用可能與丹參抑制HMGB1釋放有關。我們下一步將對丹參抗HMGB1作用的有效成分進行研究。

【參考文獻】

［1］KluneJR,DhuparR,CardinalJ,etal.HMGB1:endogenousdangersignaling［J］.MolMed,2008,14(7-8):476-484.

［2］KarlssonS,PettilV,TenhunenJ,etal.HMGB1asapredictoroforgandysfunctionandoutcomeinpatientswithseveresepsis［J］.IntensiveCareMed,2008,34(6):1046-1053.

［3］WangH,ZhuS,ZhouR,etal.TherapeuticpotentialofHMGB1targetingagentsinsepsis［J］.ExpertRevMolMed,008,4(10):e32.

［4］YangH,OchaniM,LiJ,etal.Reversingestablishedsepsiswithantagonistsofendogenoushighmobilitygroupbox1［J］.ProcNatlAcadSciUSA,2004,101(1):296-301.

［5］劉艾林,李銘源,王一濤,等.丹參藥理學活性物質(zhì)基礎研究現(xiàn)狀［J］.中國藥學雜志,2007,42(9):641-646.

［6］吳建農(nóng),張建新,劉敏,等.丹參對急性壞死性胰腺炎腎臟損害的干預作用［J］.江蘇大學學報：醫(yī)學版,2004,14(6):500-504.

［7］WangH,BloomO,ZhangM,etal.HMG1asalatemediatorofendotoxinlethalityinmice［J］.Science,1999,285:248-251.

［8］ChenG,ChenDZ,LiJ,etal.PathogenicroleofHMGB1inSARS?［J］.MedHypotheses,2004,63:691-695.

［9］ChenX,LiW,WangH.Moreteaforsepticpatients—Greenteamayreduceendotoxininducedreleaseofhighmobilitygroupbox1andotherproinflammato