作者單位：430071大學中南醫(yī)院呼吸內[摘要]目的通過肥大細胞與肺成纖維細胞接觸和非接觸共體培養(yǎng)觀察,了解肥大細胞對肺成纖維細胞增殖、轉化及功能的影響。方法分離成年大鼠肺成纖維育組:肥大細胞與肺成纖維細胞接觸共體培養(yǎng);非接觸共育組:肥大細胞與肺成3復孔,5天，每日鏡成纖維細胞特異性標志物α-平滑肌肌動蛋白(α-smoothmuscleactin,α-SMAMTT比色法測定肺成纖維細胞增殖率,ELISAbFGF、TGFβ1及Ⅰ型膠原蛋白含量。結果①細胞計數(shù)顯示：接觸共育組各時段成纖維細胞的數(shù)觸共育組和對照組比較,（P<0.05）;非接觸共育組和對照組比較,差（P<0.05照組和非接觸共育組，非接觸共育組比對照組也高,但差異不明顯α－SMA染色陽性細胞，與非接觸,（P＞0.05成纖維細胞接觸共育培養(yǎng)組,bFGF、TGFβ1及Ⅰ型膠原蛋白含量明顯bFGF、TGFβ1明顯增加，非接觸共育組比對照組也高,但差異不大細胞與肺成纖維細胞緊密接觸有利于bFGF、TGFβ1的合成；肥大細胞可能通過緊密接觸及合成的bFGF、TGFβ1來促進肺成纖維細胞的增殖、轉化及膠原合[]肥大細胞；肺成纖維細胞；增殖、轉TheeffectionofmastcellonproliferationandtransformationofpulmonaryfibroblastinratZhenshunCheng,JiongYang,YanqingYe,DepartmentRespiratoryMedicine,ZhongNanHospital,WuHanWuHan,,Code: ]Objective:Toinvestigatethepossiblerolesofmastcellsontheproliferationandtransformationoflungfibroblastcellsbycontactandnon-contactco-cultureofthetwocelllines.Methods:Fibroblastcellswereseparatedfromadultratlungandculturedinvitrowithtrypsinization.Collectratperitoneallavagesolutiontoseparateandpurifymastcellswithmastcellseparatingmediumunderasepsiscircumstance,thenqualificatedwithanilineblue.Cellsweredividedinto3groups,eachwiththreesubgroups:controlgroup(lungfibroblastcellcultureofnormalrat);contactco-culturegroup(contactco-cultureofmastcellsandlungfibroblastcells);non-contactco-culturecapsule).Eachgroupwereculturedforfivedays,countinglungfibroblastcellsundermicroscopeeverydaytosetupcellgrowthcurve.Afterfivedays,αSMAwasmeasuredbyimmunocytochemistrymethodsinmyofibroblasts,lungfibroblastcellhypersiaratewasmeasuredwithMTTcolorimetricmethodandcellscount,bFGFTGFβ1andcollagenⅠproteinincultureweremeasuredwithELISAmethod.①CellcountingresultssuggestthatFbamountincontactco-culturegroupwereincreasedobviouslythannon-contactco-culturegroupandcontrolgroupineverystage(P<0.05).ThedifferenceofFbamountbetweencontactco-culturegroupandtwogroupsweresignificant,butwerenotsignificantbetweennon-contactco-culturegroupandcontrolgroup(P>0.05).②MTTresultsindicatethatco-cultureofmastcellsandlungfibroblastcellscanobviouslyincreasethegenerationofthelatter.Contactco-culturegroupenhancethegenerationoflungfibroblastcellscomparedwithgroupandnon-contactco-culturegroup(P<0.05).Thegenerationoflungfibroblastcellsinnon-contactco-culturegroupwerealsoincreasedcomparedwithcontrolgroup,butwithnosignificantdifference(P>0.05).③Comparedwithcontrolgroupnon-contactco-culturegroup,,massiveα－SMApositivecellsweredetectedinco-culturegroup,theaverageopticalvalue(IOD)increasedsignificantly(P<0.05).Non-contactco-culturegroupisincreasedcomparedwithcontrolgroup,butwithnosignificantdifference(P>0.05).④Comparedwithcontrolgroupandnon-contactculturegroup,bFGF、TGFβ1andcollagenⅠproteinwerehigherincontactco-group(P<0.05).Comparedwithcontrolgroup,non-contactgrouphashigherproteinexpression,butwithnosignificantdifference(P>0.05).Conclusion:MastcellscanupregulatethesynthesisofbFGFandTGFβ1byacompactcontactwaywithlungfibroblastcells;Theproliferationandtransformationoflungfibroblastcellsissignificantwhencontactco-culturewithmast 】mastcell;lungfibroblast proliferation;特發(fā)性肺纖維化(Idiopathicpulmonaryfibrosis,IPF)是一種不斷進展而且致命的肺部疾病,發(fā)病機制尚不清楚，病理改變表現(xiàn)為普通型間質性[1]。目前治療，尚沒有有效藥物能疾病的發(fā)展。胞（mastcell,MC）通過與成纖維細胞間的相互作用而促進組織纖維化的形成,這基質沉積和平滑肌細胞/成肌纖維細胞增生的區(qū)域有大量高表達bFGF的肥大細胞,提示肥大細胞和bFGF與成纖維細胞的增殖、轉化有關[3]。10只成年雄性Wistar大鼠購自省疾病預防控制動物實驗中心,2-180-250克.1、大鼠原代肺成纖維細胞體外分離培養(yǎng)和鑒定3:①肺成纖維細胞獨立培養(yǎng)；②接觸共育組:肥大細胞與肺成纖維細胞接觸共體培養(yǎng)；③非接觸共育組肥大細胞與肺成纖維細胞非4、將第3代在24孔培養(yǎng)板和帶圓玻片的24孔培養(yǎng)板上進行培養(yǎng)0.25%5分鐘左右，隨即用Hanks3次，去除胰蛋1-2滴于計數(shù)板上數(shù)細胞個數(shù)，再計算總的細胞濃度。僅在非接觸共育組的培養(yǎng)分別放入直徑6.5mm的Transwell共育皿．保證非接觸共育組中兩種細胞共育時沒有細胞間的直接接觸。消化收集純化的第胞數(shù)分別接種于3組培養(yǎng)，于第48h換液后，將肥大細胞懸液(1×l05個細m1)lm1Transwell內。對照組不加肥大細胞,5天后終止培養(yǎng)。524,2456、四甲基偶氮唑藍〔MTT隨即用Hanks31ml，反復吹打瓶壁200μl96孔板。80μl新鮮RPMI16400.5%MTT 吸掉上清，每孔加入100ul二甲基亞砜，置搖低速振蕩10min，使結晶490nm處測量各孔的吸光值。7、免疫細胞化學法檢測α-SMA小牛的RPMI-1640培養(yǎng)基將肥大細胞懸液(1×l04個細胞／m1)lm1分別加入接觸共育組中和非接觸共育組的Transwell48小時，其后做細胞爬片并用免疫細胞化學法檢測α-SMA、的表達。8、酶聯(lián)免疫吸附實驗(ELISA)bFGFTGF-β15天后終止培養(yǎng),取細胞培養(yǎng)上清液,用ELISA試劑盒檢測bFGF、TGF-β1、Ⅰ型膠原蛋白含量。9xs表示，采用SPSS11.0軟件對資料進行處理分析,組間比較采用單肺成纖維1-2肺成纖維細胞生長曲線及各組間肺（xs多。各組肺成纖維細胞數(shù)目在培養(yǎng)的第53.7×106±0.83個/1.4×106±0.32個/孔;1.1×106±0.23個孔.接觸共育組中肺成纖維細胞生長數(shù)與非接觸共育組和對照組比較,（P<0.05）;非接觸共育組肺成纖維細胞生長數(shù)比對照組增多,但差異不明顯.5012345Numbersof 3組肺成纖維細胞生長曲MTT結果表明，接觸共育組肺成纖維細胞光密度值明顯高于對照組和非接（P<0.05共育組。非接觸共育組和對照組比較,差異不明顯.（P＞0.0511肥大細胞對肺成纖維細胞增殖的影響（xs組 光密度（OD△接觸共育 * 對照 △P<0.05,vs對照組;﹡<0.0,vs對照組中量細胞α-SMA染色陽性，接觸共育組中有大部分的細胞胞漿6（P<0.05維細胞轉化為肌成纖維細胞明顯增加。非接觸共育組高于對照組,但差異不明（P＞0.05 表2肥大細胞對肺成纖維細胞α-SMA染色平均光密度表達的影響（xs） △接觸共育 * 對照 △P<0.05,vs對照組;﹡<0.05,vELISA法檢測結果提示,在肥大細胞與肺成纖維細胞接觸共體培養(yǎng)組,培養(yǎng)液中TGFβ1含量明顯高于非接觸共育組和對照組（P<0.05）,說明該組細胞分泌TGFβ1增多，同時發(fā)現(xiàn),在肥大細胞與肺成纖維細胞非接觸共育組,培養(yǎng)液中TGFβ1含量高于對照組.但差異不明顯（P>0.057ELISA法檢測結果提示,在肥大細胞與肺成纖維細胞接觸共體培養(yǎng)組,培養(yǎng)液中bFGF含量明顯高于非接觸共育組和對照組（P<0.05）,說明該組細胞分泌bFGF增多，同時發(fā)現(xiàn),在肥大細胞與肺成纖維細胞非接觸共育組,培養(yǎng)液中bFGF含量高于對照組.但差異不明顯（P>0.058Ⅰ)ELISA法檢測結果提示,在肥大細胞與肺成纖維細胞接觸共體培養(yǎng)組,培胞與肺成纖維細胞非接觸共育組,培養(yǎng)液中Ⅰ型膠原蛋白含量高于對照組.但差異不明顯（P>0.059 差?！鱌<0.05,vs對照組;﹡P<0.05,vs接觸共育組。圖 準差。△P<0.05,vs對照組;﹡P<0.05,vs接觸共育組。討細胞(myofibroblast，MF)的增殖與對照組和非接觸共體培養(yǎng)比較，肥大細胞與肺成纖維細胞接觸共體培組織纖維化中起到重要的作用[4,5],[6]有支持由不同病因引起的肺纖維化患者的肺泡間隔部位肥大細胞數(shù)量明達TFα信號[7],在來霉素誘導的小鼠肺纖維化中,肥大細胞分泌的糜蛋白酶明顯增加[8],均提示肥大細胞影響肺纖維化的形成[910]。另一研究發(fā)現(xiàn)，1]肺成纖維細胞有促進其增殖作用，這與肥大細胞對其它成纖維細胞的作用相似,也與相關文獻印證。膠原蛋白含量的檢測也支持這一點,I型膠原蛋白是細胞外基質的主要成分,主要本研究也發(fā)現(xiàn):肥大細胞與肺成纖維細胞接觸共體培養(yǎng)后,培養(yǎng)液內和TGF-β1含量均明顯高于對照組和非接觸共體組，非接觸共體組高于對照組,-β(Transforminggrowthfactor-beta，TGF-β)是致肺纖維化的關鍵因子之一[12]。堿性成纖維細胞生長因子(basicfibroblastgrowthfactor,bFGF)具有刺激成纖維細胞、血管內皮細胞、平滑肌bFGF與肺部疾病的關系方面，bFGF在肺肌細胞/成肌纖維細胞增生的區(qū)域有大量高表達bFGF的肥大細胞,提示bFGF、在肺成纖維細胞培養(yǎng)液中加入肥大細胞后,bFGFTGF-β1含量均明顯增高,根據以上文獻復習提示肥大細胞可能通過分泌bFGF和TGF-β1刺激肺成纖維細胞增殖和轉化,bFGFTGF-β1,進一步放大肺成纖維細胞增殖和轉化效果.維細胞接觸和非接觸共體培養(yǎng)比較,結果顯示:培養(yǎng)組,肺成纖維細胞增殖和轉化能力高于非接觸共體培養(yǎng)組,TGF-β1含量比較,差異也明顯,因此,給我們另外一個提示:肥大細胞對肺成纖維細胞的影響可能與緊密接觸有關.這一點,相關文獻曾有.具體機制不清楚，后,bFGFTGF-β1含量均明顯增高。由此推測,bFGF、TGF-β1ChilosiM，ZamoA，DoglioniCetal,Migratorymarkerexpressioninfibroblastfociofidiopathicpulmonaryfibrosis.Respiratoryresearch,2006,7,95.LawsonWE;PolosukhinVV;ZoiaOetal,Characterizationoffibroblast-specificprotein1inpulmonaryfibrosis.AmJRespirCritCareMedJT,2005,8(171):899-InoueY;KingTEJr;BarkerE,Basicfibroblastgrowthfactoranditsreceptorsidiopathicpulmonaryfibrosisandlymphangioleiomyomatosis.AmJRespirCritCareMedJT.2002,5(166):765-773.LIUXM．Relatedevolvementbetweenstemcellfactorandmastcells.ForeignZhongYS，DingK，YeW，eta1．Therelationbetweenexpressionofbasic魯吳中耀李永.肥大細胞對眼眶成纖維細胞生長的影響.中國臨床解剖學.2004,22(3):294-6.EdwardsST;CruzAC;DonnellyS,c-Kitimmunophenotyandmetalloproteinaseexpressionprofilesofmastcellsininterstitial9lungdiseases.JPathol,2005,206(3):279-90TomimoriY;MutoT;SaitoK;TanakaT;MaruokaH;SumidaM;FukamiH;FukudaY,Involvementofmastcellchymaseinbleomycin-inducedpulmonaryfibrosisinmice.EurJPharmacol,2003,478(2-3):179-85LemayAM;HastonCK,Radiation-inducedlungresponseofAcB/BcAbinantcongenicmice.RadiatResJT.2008,17(3):299-306KinnulaVL;HodgsonUA;LakariEK;Extracellularsuperoxidedismutasehasahighlyspecific