微生物菌種及其復(fù)壯與保藏

現(xiàn)代微生物發(fā)酵工程研究的內(nèi)容1菌種的選育和擴(kuò)大2最經(jīng)濟(jì)地利用營養(yǎng)物，按需確定培養(yǎng)基3滅菌4微生物在最優(yōu)條件下產(chǎn)物的大規(guī)模生產(chǎn)5發(fā)酵產(chǎn)物的提取純化6廢物的處理、再生和生產(chǎn)環(huán)境的凈化

微生物菌種及其復(fù)壯與保藏1工業(yè)生產(chǎn)常用的微生物及要求2菌種的退化與復(fù)壯3菌種的保藏工業(yè)生產(chǎn)常用的微生物及要求1.細(xì)菌:

分布最廣，數(shù)量最多，單細(xì)胞原核，二分裂殖….枯草芽孢桿菌----淀粉酶、蛋白酶嗜熱乳桿菌----乳酸醋酸桿菌----醋酸棒狀桿菌----氨基酸短桿菌----肌苷酸工業(yè)生產(chǎn)常用的微生物2.酵母菌:

單細(xì)胞真核，含糖，偏酸，腐生，出芽繁殖，假絲….啤酒酵母----釀酒、細(xì)胞色素C、單細(xì)胞蛋

白、甘油、琥珀酸假絲酵母----面包、石油脫蠟、飼料類酵母----脂肪酶

工業(yè)生產(chǎn)常用的微生物3.霉菌:絲狀真菌生產(chǎn)菌種:根霉，毛霉，犁頭霉，紅曲霉，青霉等產(chǎn)品:酶制劑，抗生素，有機(jī)酸，甾體激素工業(yè)生產(chǎn)常用的微生物4.放線菌:

原核生物，有機(jī)質(zhì)豐富的，微堿性土壤中，無形包子或菌絲片斷繁殖。生產(chǎn)菌種:鏈霉菌屬，小單孢菌屬，諾卡菌屬等產(chǎn)品:鏈霉素，紅霉素，金霉素，慶大霉素等工業(yè)生產(chǎn)常用的微生物純凈健壯產(chǎn)量質(zhì)量穩(wěn)定2易于控制培養(yǎng)條件,周期短3對(duì)誘變劑敏感4抗污染力強(qiáng)5原料廉價(jià),生長迅速,目的產(chǎn)物產(chǎn)量高6不是病原菌1微生物工業(yè)對(duì)菌種的要求7產(chǎn)物分泌型菌種退化：生產(chǎn)菌種或選育過程中篩選出來的較優(yōu)良的菌株，由于進(jìn)行一種傳代或保藏之后，群體中某些生理特征和形態(tài)特征逐漸減退或完全喪失的現(xiàn)象。

菌種的退化與復(fù)壯退化的表現(xiàn)產(chǎn)物合成能力下降產(chǎn)量下降發(fā)酵力或糖化力降低孢子數(shù)量變化菌落大小變化生長能力和生長速度變化

1.菌種退化的原因退化原因基因突變質(zhì)粒的脫落培養(yǎng)和保藏條件的影響連續(xù)移代

基因突變導(dǎo)致菌種退化：

自發(fā)突變與回復(fù)突變10-7----10-9低產(chǎn)株低產(chǎn)株高產(chǎn)株高產(chǎn)株

質(zhì)粒脫落導(dǎo)致菌種退化：控制產(chǎn)量的質(zhì)粒脫落或核內(nèi)DNA和質(zhì)粒復(fù)制不一致。連續(xù)傳代加速退化的發(fā)生：大量低產(chǎn)突變株

傳代個(gè)別低產(chǎn)突變株不良的培養(yǎng)條件：如營養(yǎng)成分、溫度濕度、pH值、通氣量等和保藏條件如營養(yǎng)、含水量、溫度、氧氣等不僅會(huì)誘發(fā)低產(chǎn)基因型出現(xiàn)，而且會(huì)造成低產(chǎn)基因和高產(chǎn)基因細(xì)胞的數(shù)量比發(fā)生變化。延緩?fù)嘶私馔嘶脑蚍蛛x純化科學(xué)保藏減少傳代2.菌種退化的防止盡量減少傳代

1菌種經(jīng)常純化2創(chuàng)造良好的培養(yǎng)條件3用單核細(xì)胞移植傳代4采用有效的菌種保藏方法

3.菌種的復(fù)壯及其方法復(fù)壯原理狹義復(fù)壯：從大量退化的菌株中分離篩選到那些仍保持優(yōu)良性狀的個(gè)體廣義復(fù)壯：在菌種的生產(chǎn)性能尚未退化前就經(jīng)常有意識(shí)地進(jìn)行純種分離與生產(chǎn)性能的測試工作復(fù)壯方法平板劃線稀釋分離涂布分離毛細(xì)管分離

純種分離淘汰法宿主體內(nèi)復(fù)壯法低溫等條件處理,使部分退化菌株死亡對(duì)于寄生性微生物的退化菌株,可通過接種到的昆蟲或動(dòng)物寄主體內(nèi)以提高菌株毒性

2.3菌種的保藏一.菌種保藏廣義：在廣泛收集實(shí)驗(yàn)室和生產(chǎn)菌種、菌株的基礎(chǔ)上，將它們妥善保管，是指達(dá)到不死、不衰、不污染以便于研究、交換和使用的目的。狹義：防止菌種退化、保持菌種的生活能力和優(yōu)良的生產(chǎn)性能，盡量減少、推遲負(fù)突變、防止死亡，并確保不污染雜菌。原理干燥低營養(yǎng)低溫干燥3液體石蠟2凍干4真空5液氮6斜面1微生物菌種的保藏法

(一).斜面保藏法特點(diǎn)：簡便有效，易變異，退化甚至死亡。適合：不要求長期保藏的及不適合冷凍干燥的。保存期:3個(gè)月

影響保藏效果因素

營養(yǎng)略貧乏氮源略多糖類少培養(yǎng)基124℃培養(yǎng)條件

（二）.液體石蠟油保藏法保存期:2-3年，甚至5年傳代一次.特別適合:在固體培養(yǎng)基上不能形成孢子的絲狀擔(dān)子菌，如大型食用真菌和藥用真菌以及鐮刀菌、紅曲霉等.注意：保藏溫度，液體石蠟需滅菌和除水（三）.干燥保藏法適于:能產(chǎn)生孢子或芽孢的微生物

沙土麥麩硅膠適合產(chǎn)孢子的霉菌和放線菌適合絲狀真菌和酵母菌砂土沙土管菌種粒度，除鈣，除鐵及pH。砂和土混合比例：1：1或3：2。121℃間歇滅菌3次，每次1-1.5小時(shí)埋沙土干法濕法細(xì)胞濃度108-109/ml,0.2-0.3ml/支。抽真空干燥4小時(shí)砂土保藏法特點(diǎn):經(jīng)濟(jì)簡便，保存時(shí)間長，不易變異。一般2-3年.冷凍干燥法:用保護(hù)劑制備菌懸液，然后將含菌樣快速降至冰凍狀態(tài)，減壓抽真空，使冰升華成水蒸汽排出，從而使含菌樣脫水干燥，并在真空狀態(tài)立即密封瓶口隔絕空氣，造成無氧的真空環(huán)境，然后置于低溫下保存。特點(diǎn)：不易發(fā)生變異，5-10年。需要凍干機(jī)。適用：除了一些不產(chǎn)孢子的絲狀真菌外。（四）.冷凍干燥保藏法1.安剖瓶：2%鹽酸浸泡7-10h。裝入標(biāo)簽，塞上棉花，滅菌備用。2．保護(hù)劑：選擇適合的種類。保護(hù)劑減少細(xì)胞的損傷和死亡維持細(xì)胞的構(gòu)型重新培養(yǎng)適宜溶解成長良好，健壯無污染穩(wěn)定期高濃度菌種3.菌種制備預(yù)凍：防止泡沫溢出，凍結(jié)，升華。不低于-20℃，30min，疏松狀態(tài)時(shí)，轉(zhuǎn)入室溫抽1h，融封，檢測真空度，4℃，避光。4.預(yù)凍和真空干燥

凍干物呈酥塊狀或松散片狀

真空度接近空載時(shí)的最高值

以等量水作對(duì)照

干燥終止：恢復(fù)培養(yǎng)：室溫下平衡后，加入最適培養(yǎng)基，控制溶化速度，操作靠近火焰。避免：樣品逸散，污染。常溫下直接真空干燥。設(shè)備簡單，操作方便。適于:預(yù)凍后易受凍傷的菌株（五）真空干燥法

以甘油、二甲基亞砜等作保護(hù)劑，在液氮超低溫下保藏的方法。是防止退化的最有效的方法。適合于各種微生物的保藏。原理：菌種細(xì)胞從常溫過渡到低溫，并在降到低溫之前，使細(xì)胞內(nèi)的自由水通過細(xì)胞膜外滲出來。（六）.液氮超低溫法保護(hù)劑：甘油，二甲基亞砜，糊精，血清蛋白等。

不同微生物的保護(hù)劑不同，需實(shí)驗(yàn)確定。甘油10-20%，二甲基亞砜5-10%安剖瓶的選擇：95料或GG17的玻璃管制成。液氮超低溫法菌種制備和凍結(jié)保藏：孢子或菌絲體。-3